Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (penaeus monodon) sử dụng phương pháp phân tích thư viện cDNAEST

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về cDNA/EST của tôm sú đã đạt được một số kết quả góp phần làm sáng tỏ một số cơ chế phân tử liên quan đến sinh trưởng, sức sinh sản và khả năng k

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

TRẦN TRUNG THÀNH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN CỦA TÔM SÚ

(PENAEUS MONODON) SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH THƯ VIỆN cDNA/EST

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Trang 2

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Kim Thị Phương Oanh, Trưởng phòng Hệ gen học Môi trường, Viện Nghiên cứu hệ gen, đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin cảm ơn tới PGS TS Nông Văn Hải, Trưởng phòng Hệ gen học người, Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen, đã tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự chỉ bảo chuyên môn nhiệt tình của các cán bộ nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới

sự giúp đỡ quý báu đó

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc vừa qua

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Trần Trung Thành

Trang 4

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác Tôi cũng xin cam đoan rằng, mọi

sự giúp đỡ trong việc thực hiện đề tài đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã đƣợc ghi rõ nguồn gốc

Ký tên

Trần Trung Thành

Trang 5

MỤC LỤC

MỤC LỤC I DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC CÁC HÌNH IV DANH MỤC CÁC BẢNG V

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 ĐẶCĐIỂMSINHHỌCCỦATÔMSÚ 3

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học 3

1.1.2.1 Đặc điểm sinh trưởng và sinh sản 3

1.1.2.2 Chu kỳ sống 3

1.1.2.3 Tập tính dinh dưỡng 5

1.1.2.4 Điều kiện môi trường sống 5

1.2 TÌNHHÌNHNUÔITRỒNGTÔMSÚTRÊNTHẾGIỚIVÀ 6

VIỆTNAM 6

1.2.1 Diện tích, sản lượng của tôm trên thế giới và Việt Nam 6

1.2.2 Giá trị kinh tế của tôm sú 7

1.2.3 Những thách thức của nghề nuôi trồng tôm sú 9

1.2.3.1 Vấn đề dịch bệnh 9

1.2.3.2 Vấn đề chọn giống 11

1.2.3.3 Gia hóa tôm sú 13

1.3 CÔNGNGHỆSINHHỌCTRONGNUÔITRỒNGTÔMSÚ 17

1.3.1 Chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh 17

1.3.2 Phát triển các chỉ thị phân tử 19

1.3.3 Nghiên cứu chức năng của những gen liên quan tới một số tính trạng quan trọng 27

1.4 XUHƯỚNGPHÁTTRIỂNVÀTRIỂNVỌNGCỦACÔNGNGHỆSINH HỌCTRONGNUÔITRỒNGTÔMSÚ 33

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35

2.1 VẬTLIỆU 35

2.1.1 Thu thập mẫu 35

2.1.2 Hóa chất 35

2.1.3 Thiết bị 36

2.2 PHƯƠNGPHÁP 37

2.2.1 Tách chiết RNA tôm sú 39

2.2.2 Tinh sạch mRNA 40

2.2.3 Tạo thư viện cDNA/EST tôm sú từ các mô sử dụng plasmid vector với các vị trí tái tổ hợp đặc hiệu 43

Trang 6

2.2.3.1 Tổng hợp cDNA có chứa trình tự attB1 và attB2 (DNA

recombination sites) ở hai đầu 43

2.2.3.2 Phân đoạn cDNA theo kích thước 46

2.2.3.3 Tinh sạch cDNA 48

2.2.3.4 Đưa cDNA vào vector (pDONR222) bằng phản ứng tái tổ hợp giữa các điểm attB và attP 49

2.2.3.5 Biến nạp vector vào tế bào vi khuẩn 51

2.2.3.6 Kiểm tra thư viện cDNA/EST bằng phản ứng cắt enzyme giới hạn……… 52

2.2.4 Xác định trình tự cDNA/EST 54

2.2.5 Phương pháp phân tích dữ liệu trình tự 55

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57

3.1 TÁCHCHIẾTRNATỔNGSỐTÔMSÚ 57

3.2 TẠOTHƯVIỆN CDNA/EST 58

3.3 KIỂMTRATHƯVIỆN CDNA/ESTBẰNGPHẢNỨNGCẮTENZYME GIỚIHẠN 59

3.3.1 Tách chiết plasmid tái tổ hợp 59

3.3.2 Cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn 60

3.3.3 Số liệu thống kê các thư viện cDNA/EST tôm sú đã tạo lập 62

3.4 GIẢIMÃCÁC CDNA/ESTTỪCÁCTHƯVIỆNĐÃTẠOLẬP 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

Trang 7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn

DNA) AHPNS Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome

ddNTPs Dideoxyribonucleoside triphosphate (ddATP, ddCTP, ddGTP,

ddTTP) DEPC Diethyl pyrocarbonate

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTPs Deoxyribonucleoside triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EMS Early Mortality Syndrome

EST Expressed sequence tag (Đoạn trình tự gen biểu hiện)

EtBr Ethidium bromide

GAS Gene Assisted Selection

GAV Gill associated virus

HPV Hepatopanceatic parvovirus

IHHNV Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus

IMNV Infectiuos meonecrosis virus

LAMP Loop-mediated isothermal amplification

Mab Monoclonal antibodies

MAS Marker Assisted Selection

MBV Monodon baculovirus

MCS Multiple cloning site (Vùng cắt gắn đa vị trên vector)

mtDNA Mitochondrial DNA (DNA ty thể)

OD Optical Density (Mật độ quang học)

ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở )

Pab Polyclonal antibodies

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

QTL Quantitative trait locus

RACE Rapid Amplification of cDNA Ends (khuếch đại các đầu 5„ và 3„ của

cDNA) RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA (Đa hình đoạn DNA

đƣợc nhân ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn

DNA cắt bằng enzyme giới hạn) RNA Ribonucleic acid

RT-PCR Reverse transcriptase-PCR (PCR bằng enzyme phiên mã ngƣợc) SNP Single-nucleotide polymorphism (Đa hình các nucleotide đơn)

WSSV White spot syndrome virus (virus gây bệnh đốm trắng)

YHV Yellow head virus (virus gây bệnh đầu vàng)

Trang 8

Hình 3 1 Điện di đồ các mẫu RNA tổng số tách chiết từ các mô khác nhau 57 Hình 3 2 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn 59 Hình 3 3 Master plate 59 Hình 3 4 Một số hình ảnh điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp tác từ các dòng tế bào trong thư viện cDNA/EST tôm sú 60 Hình 3 5 Điện di đồ kiểm tra kích thước cDNA đã được đưa vào vector

pDONR222 61 Hình 3 6 Thống kê thành phần và phân loại các trình tự cDNA/EST 75

Hình 3 7 So sánh (alignment) trình tự amino acid của protein antimicrobial

peptide ở tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố 76 Hình 3 8 So sánh (alignment) trình tự nucleotide gen hemocyanin của tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố 77 Hình 3 9 So sánh (alignment) trình tự amino acid của protein hemocyanin ở tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố 78 Hình 3 10 So sánh (alignment) trình tự amino acid của protein c-type lectin ở tôm

sú Việt Nam với trình tự đã công bố 79

Trang 9

Trang 10

MỞ ĐẦU

Tôm sú (Penaeus monodon) thuộc giống Penaeus, họ Penaeidae là loài có

đặc điểm sinh trưởng nhanh, được nuôi rộng rãi nhất trên thế giới Nghề nuôi tôm là một thế mạnh của thuỷ sản, các chuyên gia ngành thủy sản đánh giá, tôm sú là đối tượng xuất khẩu chủ lực ở nước ta Duy trì sự ổn định của nghề nuôi tôm phụ thuộc rất nhiều vào nguồn tôm khỏe mạnh và sự kiểm soát dịch bệnh hiệu quả Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành Tuy nhiên, việc chọn và tạo giống tôm sú vẫn còn nhiều khó khăn, nguồn tôm giống chủ yếu là đánh bắt tự nhiên Nền tảng cho các chương trình chọn giống là những nghiên cứu về gen và hệ gen Nghiên cứu

về hệ gen sẽ cung cấp những thông tin di truyền về các gen liên quan đến tính trạng sinh trưởng, sinh sản, kháng bệnh và chống chịu với các điều kiện tự nhiên Có nhiều phương pháp nhằm tiếp cận nghiên cứu hệ gen tôm sú trong đó, phương pháp phân lập và phân tích các đoạn trình tự gen biểu hiện (Expressed Sequence Tag, EST) là một trong các phương pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm tập trung nghiên cứu các gen chức năng Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về cDNA/EST của tôm sú đã đạt được một số kết quả góp phần làm sáng tỏ một số cơ chế phân tử liên quan đến sinh trưởng, sức sinh sản và khả năng kháng bệnh

Để tạo tiền đề cho các nghiên cứu cơ bản về genome tôm sú, chúng tôi xây

dựng đề tài nghiên cứu: “ Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (Penaeus monodon) sử dụng phương pháp phân tích thư viện cDNA/EST”

Nghiên cứu được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu giải trình tự một phần bộ gen và xây dựng cơ sở dữ liệu genome tôm sú (P.monodon)”

thuộc chương trình “Phát triển và Ứng dụng Công nghệ sinh học ngành Thủy sản”,

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.

Mục tiêu nghiên cứu:

- Xây dựng thư viện cDNA/EST của tôm sú tự nhiên/nuôi tại Việt Nam

- Xác định trình tự cDNA/EST

- Chú giải chức năng một số gen thu thập được từ thư viện cDNA/EST

Trang 11

Nội dung luận văn:

- Thu thập mẫu, tách chiết RNA tổng số bằng phương pháp sử dụng TRIzol (Invitrogen), tinh chế mRNA sử dụng bộ kit “ PolyAtract® mRNA Isolation Systems III” (Promega)

- Xây dựng thư viện cDNA/EST tôm sú từ các mô sử dụng plasmid vector với các vị trí tái tổ hợp đặc hiệu sử dụng bộ kit “CloneMiner™ cDNA Library Contruction Kit” (Invitrogen)

- Giải mã trình tự nucleotide của các cDNA/EST trên máy ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) và phân tích trình tự thu được

- Chú giải trình tự nucleotide của các cDNA/EST thu được bằng các công cụ tin sinh học

Trang 12

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố

Tôm sú (Penaeus monodon) có tên tiếng Anh là Giant tiger prawn hay Black tiger shrimp thuộc giống Penaeus, họ Tôm he (Penaeidae), bộ phụ Natantia, bộ

mười chân (Decapoda), lớp giáp xác (Crustacea), ngành chân khớp (Arthropoda)

Tôm sú phân bố rộng rãi ở các thủy vực thuộc vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, phân bố tập trung ở vùng Ấn Độ - Thái Bình Dương, Đông và Đông Bắc Châu Phi, Pakistan đến Nhật Bản, Nam Châu Phi đến Bắc Australia Đặc biệt phân bố hầu hết

ở Vùng Đông Nam Á như Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippin và Việt Nam

Ở Việt Nam, tôm sú phân bố tự nhiên ở tất cả các tỉnh ven biển, nhưng tập trung nhiều nhất ở các vùng Duyên Hải Miền Trung và Nam Bộ

1.1.2 Đặc điểm sinh học

1.1.2.1 Đặc điểm sinh trưởng và sinh sản

Tôm sú có đặc điểm sinh trưởng rất nhanh, khoảng 4-5 tháng là tôm đạt được mức trưởng thành, đạt trọng lượng khoảng 28 gram [15]

Ngoài tự nhiên, khi đến tuổi trưởng thành thì tôm di cư ra biển, bắt cặp, giao

vỹ Khi giao vỹ xong tôm cái sẽ tìm bãi đẻ Bãi đẻ của tôm thường xa bờ, nước sâu, sạch, độ mặn trên 30 ‰ Khi tôm tìm được bãi đẻ phù hợp, tôm sẽ đẻ trứng Sức sinh sản của tôm thường từ 200.000-1.200.000 trứng/ tôm cái Mùa vụ sinh sản của tôm là từ tháng 2 đến tháng 5 và tháng 7 đến tháng 9

1.1.2.2 Chu kỳ sống

Vòng đời của tôm sú chia làm 5 thời kỳ: thời kỳ phát triển phôi, ấu trùng phù

du (Larvae), hậu ấu trùng phù du (Post larvae), ấu niên hay tiền trưởng thành (Juvenile), và trưởng thành (Adults) [3] (Hình 1.1)

Trang 13

Căn cứ vào đặc điểm, cấu tạo hình thái ngoài và tập tính ăn mồi người ta chia

thời kỳ ấu trùng phù du làm 3 giai đoạn: ấu trùng không đốt (Nauplli), ấu thể Zoea,

ấu thể Mysis:

o Nauplli: Có 6 lần lột vỏ nên chia làm 6 giai đoạn N1-N6, các Nauplli

có tập tính trôi nổi, hướng quang Chúng tự sống bằng noãn hoàng không cần ăn

o Zoea: Có 3 lần lột vỏ nên chia làm 3 giai đoạn Z1-Z3, các Zoea có

tính ăn lọc, thụ động Tuy nhiên, Zoea vẫn còn sử dụng noãn hoàn trong khi bắt đầu ăn ngoài Zoea có tính hướng quang mạnh

o Mysis: Có 3 lần lột vỏ nên chia làm 3 giai đoạn M1-M3, các Mysis

bơi hướng xuống sâu, đuôi đi trước đầu đi sau

Giai đoạn hậu ấu trùng (Postlarvae): phần phụ bơi lội và cơ quan tiêu hóa

phát triển hoàn chỉnh, thời kỳ này bắt đầu đặc trưng của sự chín bộ phận sinh dục

Giai đoạn ấu niên (Juvenile): thời kỳ này bộ phận sinh dục đã chín hoàn

toàn, tôm sống ở ngoài khơi [4, 7]

(http://oceanworld.tamu.edu)

Hình 1 1 Chu kỳ sống của tôm

Trang 14

1.1.2.3 Tập tính dinh dưỡng

Tôm sú là loài ăn tạp, thích ăn các động vật sống và di chuyển chậm như là giun nhiều tơ, động vật hai mảnh vỏ, côn trùng Trong tự nhiên, tôm sú bắt mồi nhiều hơn khi thủy triều rút Tôm sú nuôi trong ao, hoạt động bắt mồi nhiều vào sáng sớm và chiều tối Tôm bắt mồi bằng càng, sau đó đẩy thức ăn vào miệng, thời gian tiêu hóa thức ăn là 4-5 giờ trong dạ dày.Tập tính ăn và loại thức ăn của tôm sú thay đổi theo từng giai đoạn phát triển

- Giai đoạn ấu trùng:

Do tập tính sống trôi nổi bắt mồi thụ động bằng các râu và phụ bộ nên thức ăn phải phù hợp với cỡ miệng Tôm sú giai đoạn ấu trùng sống trong tự nhiên thức ăn là các loại tảo, luân trùng, mùn bã hữu cơ

- Giai đoạn trưởng thành:

Tôm sú có tập tính sống đáy nên thức ăn là giáp xác sống đáy, giun nhiều tơ, các loại động vật hai mảnh vỏ, các loại ấu trùng của động vật sống đáy, …

1.1.2.4 Điều kiện môi trường sống

- Nhiệt độ: Tôm sú là loài rộng nhiệt có thể sống ở nhiệt độ từ 18oC-35oC Tối ưu là 28oC-30oC Nếu nhiệt độ nhỏ hơn 25oC hay lớn hơn 33oC thì tôm giảm ăn từ 30-50% [6]

- Độ mặn: Tôm sú là loài rộng muối, tùy vào từng giai đoạn phát triển khác

nhau mà thích ứng với độ mặn khác nhau Với điều kiện được thuần hóa thì tôm có thể tồn tại và phát tiển ở độ mặn từ 0-40 ‰, nhưng thích hợp nhất ở độ mặn từ 15-25 ‰ [13]

- DO (mật độ oxy hòa tan): Tôm sú có khả năng sinh tồn và phát triển

trong khoảng DO từ 2 mg/L trở lên, DO thấp làm cho tôm hô hấp và bắt

Trang 15

mồi kém Nếu DO < 2 mg/L thì tôm sẽ bị chết ngạt DO thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của tôm là > 5 mg/L

- pH: Tôm sú có thể sống trong môi trường nước có pH dao động từ 6,5 –

9,5 pH thích hợp cho sự phát triển tối ưu của tôm là 7,5 – 8,5 và pH dao động trong ngày không quá 0,5 đơn vị

- Ánh sáng: Tôm sú là loài ưu tối nên tạo điều kiện bóng mát cho tôm nuôi

- Độ kiềm, NH 3 , H 2 S: Độ kiềm từ 80 – 120 mg/L, NH3 < 0,1 mg/L, H2S < 0,03 mg/L [9]

Trên thế giới có hai khu vực nuôi tôm lớn là Tây bán cầu gồm các nước Châu Mỹ La Tinh và Đông bán cầu gồm các nước Nam Á và Đông Nam Á Theo Nguyễn Văn Hảo thì năm 1997 ở khu vực Tây bán cầu, sản lượng tôm nuôi của Ecuador đạt 130.000 tấn chiếm 66% tổng sản lượng tôm nuôi của khu vực Khu vực Đông bán cầu thì sản lượng tôm nuôi là 462.000 tấn chiếm 70% tôm nuôi trên thế giới Trong đó, Thái Lan là nước đứng đầu, kế đến là Indenesia, Trung Quốc, Banglades và Việt Nam [3, 8] Năm 2000, sản lượng tôm sú nuôi đạt 571,5 nghìn tấn, chiếm 52,3 % tổng sản lượng các loại tôm nuôi [37]

Theo thống kê của FAO, sản lượng tôm nuôi thế giới năm 2011 sản lượng tôm đạt 3,85 triệu tấn, trong đó có gần 3 triệu tấn tôm chân trắng (78%) và hơn 850 nghìn tấn tôm sú (22%) [36]

Ở Việt Nam

Trang 16

Việt Nam có bờ biển dài trên 3.260 km với nhiều cửa sông, đầm, phá rất thuận lợi cho nuôi trồng thủy sản Đặc biệt vùng đất bãi bồi ven biển, đất ngập nước ven biển bị xâm nhập mặn, thuận lợi cho việc nuôi tôm Miền Bắc diện tích nuôi tôm không lớn do ở đây có nhiệt độ thấp kéo dài Khu vực Miền Trung và Khu vực phía Nam do điều kiện địa lý bờ biển uốn khúc, dốc, nền đáy cát, nước biển trong, sạch do chưa bị ô nhiễm nên thuận lợi cho việc phát triển sản xuất giống tôm sú [8]

Theo số liệu của Tổng cục Thủy sản, năm 2011, Việt Nam vươn lên dẫn đầu thế giới về sản xuất tôm sú với sản lượng 300 nghìn tấn Ấn Độ và Indonesia xếp thứ 2 và 3 với sản lượng lần lượt là 187,9 nghìn tấn và 126,2 nghìn tấn Trong năm

2012, cả nước có 30 tỉnh thành nuôi tôm nước lợ đã thả nuôi 657.523 ha, đạt sản lượng 476.424 tấn, tăng 0,2% diện tích và giảm 3,9% sản lượng Trong đó diện tích nuôi tôm sú 619.355 ha, sản lượng 298.607 tấn, giảm 7,1% diện tích và 6,5% sản lượng; tôm chân trắng 38.169 ha, tăng 15,5%, sản lượng 177.817 tấn, tăng 3,2% so với năm 2011 Diện tích tôm sú chiếm 94,1% diện tích nuôi tôm và 62,7% sản lượng, tôm chân trắng chiếm 5,9% diện tích và 27,3% sản lượng Khu vực ĐBSCL chiếm diện tích và sản lượng lớn nhất với 595.723 ha và 358.477 tấn, trong đó tôm

sú là 579.997 ha và 280.647 tấn, tôm chân trắng 15.727 ha và 77.830 tấn [14]

Tôm sú được xác định là sản phẩm chủ lực trong cơ cấu sản xuất và xuất khẩu tôm của Việt Nam Chính vì vậy, cùng với vị trí dẫn đầu thế giới hiện nay về sản lượng tôm sú, Việt Nam cần phát huy hơn nữa thế mạnh của loài tôm này với nguồn cung ổn định, giá bán cạnh tranh và chất lượng sản phẩm tốt

1.2.2 Giá trị kinh tế của tôm sú

Theo số liệu của Tổng cục Thống kê, có thể dễ dàng nhận thấy từ năm 1990 đến nay mặt hàng tôm, và cá đông lạnh vẫn là các mặt hàng chủ lực xuất khẩu Tuy nhiên, có một sự thay đổi khá lớn về cơ cấu tỷ trọng theo hai loại mặt hàng này Cụ thể mặt hàng tôm có xu hướng tăng nhẹ trong thời gian gần đây và chủ yếu vẫn là

Trang 17

mặt hàng tôm sú Trong khi đó, mặt hàng các tra, các ba sa có mức độ gia tăng nhanh chóng Mặc dù vậy nhưng tôm vẫn là mặt hàng chiếm ưu thế, dù cho tôm chiếm một khối lượng trong tỉ trọng xuất khẩu không cao song lại có giá trị xuất khẩu rất lớn

Việt Nam hiện nay với 470 doanh nghiệp chế biến thủy sản đông lạnh thì

346 cơ sở đạt tiêu chuẩn ngành về an toàn vệ sinh thực phẩm, trong đó 245 doanh nghiệp được phép xuất khẩu sang EU, 34 doanh nghiệp được xuất vào Mỹ và Canada Tuy nhiên, tính đến tháng 10/ 2012, số doanh nghiệp xuất khẩu tôm chỉ còn khoảng 70 doanh nghiệp Dịch bệnh, thiếu vốn và nhu cầu từ thị trường thế giới sụt giảm đang là những yếu tố căn bản khiến nhiều doanh nghiệp chế biến và xuất khẩu tôm phải ngừng tham gia xuất khẩu [14]

Theo số liệu của Hải quan, năm 2007 các loài thủy sản Việt Nam đã được xuất khẩu sang 135 thị trường thế giới với khối lượng trên 661 nghìn tấn, tăng 13%, đạt giá trị 2.709 tỷ USD, tăng 13,8 % so với cùng kỳ 2006 Trong khi EU duy trì mức tăng khá cao trong năm 2007 thì thị trường Nhật lại giảm khá mạnh và thị trường Mỹ chỉ tăng ở mức độ khiêm tốn và không ổn định Thị trường Nga là một điển hình về sự biến động gây ảnh hưởng nhiều đến kết quả tổng xuất khẩu của thủy sản Việt Nam [1]

Theo các số liệu thống kê, trong năm 2012 cả nước có 1.529 cơ sở sản xuất tôm sú giống, sản xuất được hơn 37 tỷ con giống và có 185 cơ sở sản xuất tôm chân trắng giống với gần 30 tỷ con giống Việt Nam xuất khẩu tôm sang 92 thị trường, với tổng giá trị ước tính đạt 2,25 tỷ USD, giảm khoảng 6,3% so với năm 2011 Tỷ trọng xuất khẩu tôm sú của Việt Nam đã có thay đổi trên các thị trường thế giới Thị trường lớn nhất là Nhật Bản, theo sau là Mỹ, Châu Âu và một số nước Châu Á khác Theo thông tin từ Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2013 tôm là mặt hàng giữ vị trí “quán quân” trong nhóm hàng thủy sản xuất khẩu Dự kiến xuất khẩu tôm năm 2013 đạt khoảng 2,8 tỷ USD, tăng 27%

Trang 18

so với năm 2012 Trong đó, tôm thẻ chân trắng chiếm tỷ trọng khoảng 48,7 % tổng giá trị xuất khẩu tôm [14]

Đối với thị trường tiêu thụ nội địa chúng ta chưa có một thị trường đúng nghĩa cho ngành thủy sản Dẫu biết thị trường nội địa có nhiều tiềm lực với số dân khoảng 90 triệu người, đặc biệt dân số nước ta là dân số trẻ và đang dần hình thành lối sống đô thị hóa Tuy nhiên, do thói quen ăn uống của người dân vốn quen với thức ăn chế biến từ thủy sản đánh bắt tự nhiên và tươi, sống Bên cạnh đó là chi phí cho bảo quản và quảng bá thương hiệu của các doanh nghiệp vẫn đang ở mức khá cao Chính vì vậy, tỉ lệ phần trăm tiêu thụ của thị trường nội địa trong các năm qua hầu hết chỉ giao động xung quanh biên độ 5-10% doanh số của các công ty chế biến thủy sản [1]

1.2.3 Những thách thức của nghề nuôi trồng tôm sú

1.2.3.1 Vấn đề dịch bệnh

Các vấn đề dịch bệnh chính ở các trại sản xuất tôm giống có liên quan đến nhiễm khuẩn, nấm và virus Trong đó, những thiệt hại nghiêm trọng nhất chủ yếu gây ra do virus Kiểm tra sàng lọc các mầm bệnh trong suốt giai đoạn ấu trùng và kiểm tra nghiêm ngặt các biện pháp an toàn sinh học trong quá trình sản xuất có thể tránh tôm chết hàng loạt và tránh suy giảm hiệu suất nuôi Tôm nuôi phải chịu đựng các điều kiện nuôi khá khác biệt so với môi trường biển tự nhiên của chúng Dịch bệnh xảy ra không chỉ do sự hiện hữu của các mầm bệnh đã được biết đến trong hệ thống nuôi trồng, mà còn do tác động của các yếu tố môi trường, dinh dưỡng, quản

lý, di truyền hoặc sinh lý dưới mức tối ưu Nhiều loại mầm bệnh thường hiện hữu trong môi trường ao nuôi tôm Từ đó mà nhiều loại bệnh viêm nhiễm có thể xảy ra,

và có thể che giấu nguyên nhân chính của bệnh Do sự phức tạp của hệ sinh thái mầm bệnh trên tôm nên cần thiết xem xét kỹ vật chủ, mầm bệnh và môi trường

nhằm ngăn ngừa hoặc điều trị bệnh [46]

Trang 19

Nghề nuôi tôm hiện đang phải đương đầu với nhiều loại bệnh xuất hiện trong quá trình nuôi, nhất là bệnh do virus gây ra như bệnh đốm trắng (White spot syndromes virus - WSSV), hội chứng Taura (Taura syndrome virus - TSV), bệnh đầu vàng (Yellow head virus - YHV), bệnh mang (Gill associated virus - GAV), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô (Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus - IHHNV), bệnh gan tụy (Hepatopanceatic parvovirus

- HPV), bệnh còi (Monodon baculovirus - MBV), bệnh hoại tử cơ/đục cơ (Infectiuos meonecrosis virus - IMNV) Theo cơ quan Quốc tế về Dịch bệnh Động vật (năm 1995), WSSV, IHHNV, YHV, IMNV là các virus gây bệnh cực kỳ nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm, vì các tác nhân này có khả năng lây rất nhanh, có

hệ ký chủ rộng [33], tỷ lệ tôm chết khi bị nhiễm bệnh có thể lên đến 80 - 100% [25, 48]

Ở Việt Nam năm 2011, Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn đã ban hành thông tư số 83/2011/TT - BNNPTNT về việc công bố các dịch bệnh nguy hiểm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng; bao gồm hội chứng Taura và bệnh hoại tử

cơ ở tôm chân trắng; bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh hoại tử cơ quan tạo máu

và cơ quan biểu mô gây hại trên cả tôm sú và tôm chân trắng

Trong 4 tháng đầu năm 2012, tình hình tôm chết tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long diễn biến hết sức phức tạp Diện tích nuôi tôm bị thiệt hại tại Cà Mau đã lên đến 555 ha (cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng), tại Bạc Liêu là 1.270 ha và tại Sóc Trăng là 1.400 ha (gồm 500 ha tôm thẻ chân trắng và hơn 900 ha tôm sú nghịch vụ) (theo báo cáo tháng 4/2012 của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn tỉnh Cà Mau, tỉnh Bạc Liêu và tỉnh Sóc Trăng) Từ số liệu thu được thì năm 2012 cả nước

có khoảng 100.766 ha diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại do dịch bệnh tôm chết sớm (EMS) (trong đó 91.174 ha nuôi tôm sú và 7.068 ha nuôi tôm thẻ chân trắng) Theo điều tra, khảo sát và nghiên cứu của Tổng cục Thủy sản, chứng hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS) chiếm 45,7% diện tích thiệt hại và xảy ra chủ yếu trên diện tích nuôi tôm công nghiệp Phần còn lại là do bệnh đốm trắng và đầu vàng [14, 57]

Trang 20

Điều đáng mừng là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính vừa được các nhà khoa học nghiên cứu đã tìm được nguyên nhân và có các biện pháp phòng chống Ngày 9-5-2013, Cục Thú y đã ban hành Công văn 737 về việc thông báo tác nhân gây Hội chứng hoại tử gan tụy trên tôm nuôi Kết quả nghiên cứu xác định nguyên nhân gây bệnh

do vi khuẩn Vibrio Parahaemolyticus gây ra Vi khuẩn này đã bị nhiễm bởi một loại

thể thực khuẩn (Phage) sống ký sinh nên sinh ra độc tố cực mạnh gây Hội chứng AHPNS cho tôm nuôi [30]

Trên thế giới, ở các nước có nghề nuôi trồng tôm sú khác cũng có nguy cơ bùng phát dịch bệnh, đặc biệt là bệnh đốm trắng [54] Bệnh đốm trắng là một ví dụ điển hình về tốc độ lây lan của bệnh; đầu tiên bệnh đốm trắng được phát hiện tại Đài loan vào năm 1992, WSSV đã nhanh chóng lan truyền rộng rãi trên hầu khắp các quốc gia Châu Á và ảnh hưởng nghiêm trọng tới sản xuất của các quốc gia này [44]

Trong năm 2011 Trung Quốc chịu thiệt hại 1,7 triệu tấn (giá trị khoảng 3,3 tỷ USD) trong đó, gây ra bởi thảm họa tự nhiên (1,2 triệu tấn), dịch bệnh (295.000 tấn)

và ô nhiễm môi trường (123.000 tấn) Dịch bệnh cũng đã ảnh hưởng lớn tới sản lượng tôm nuôi tại Mozambique trong năm 2011 [35]

1.2.3.2 Vấn đề chọn giống

Trên quy mô toàn cầu, vấn đề lựa chọn giống là một yêu cầu bắt buộc và có

ý nghĩa vô cùng quan trọng, dẫn tới giảm thiểu thiệt hại trong nuôi trồng thủy sản Các chương trình chọn giống chủ yếu tập trung vào các tính trạng: tốc độ sinh trưởng, năng suất của tôm nuôi, khả năng sinh sản, khả năng kháng bệnh, và khả năng sống sót của ấu trùng Phương pháp chọn giống truyền thống thường thông qua các kỹ thuật chọn lọc cá thể và các phương pháp lai Trong khi chọn lọc cá thể

là một biện pháp nâng cao chất lượng giống, một phương pháp khác là lai giữa các dòng tôm có nguồn gốc khác nhau về mặt địa lý cũng có thể nâng cao tốc độ tăng trưởng của tôm nhờ vào ưu thế lai ở thế hệ con Phương pháp lai có thể cho kết quả

Trang 21

nhanh chóng và ít tốn kém so với phương pháp chọn giống Phương pháp lai thường được xem là phương pháp rẻ tiền để cải thiện con giống và phù hợp với các ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản ở qui mô nhỏ [5]

Hầu hết các giống thương mại hiện nay được nuôi trồng công nghiệp đều được phát triển thông qua các phương pháp chọn giống truyền thống, đã cải thiện đáng kể chất lượng con giống, nâng cao tốc độ tăng trưởng từ 10-20%/thế hệ Tuy nhiên các phương pháp này thường phải mất 10-20 năm kể từ khi nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng, bên cạnh đó chí phí đầu tư ban đầu tương đối cao đã ảnh hưởng tới sự công nghiệp hóa [5, 116]

Từ những thách thức gặp phải trong chọn giống theo phương pháp truyền thống, các nhà khoa học đã và đang phát triển các phương pháp chọn giống hiện đại với những ưu điểm về giá thành và thời gian chọn tạo giống Bằng việc kết hợp bản

đồ di truyền liên kết dựa trên sự di truyền của các DNA marker (microsatellite, SNP hoặc AFLP) với đánh giá locus tính trạng số lượng đã cung cấp các thông tin về di truyền của tôm Các thông tin đó sẽ được sử dụng trong phương pháp chọn giống với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử, hay còn gọi là MAS (Marker Assisted Selection) Hay ở mức độ cao hơn, thông tin về các gen trực tiếp quy định các tính trạng quan tâm sẽ được sử dụng trong phương pháp chọn giống có sự trợ giúp của gen, hay còn gọi là GAS (Gene Assisted Selection) [56] Tuy nhiên, trong chọn giống tôm sú, các phương pháp chọn giống hiện đại dựa trên các chỉ thị phân tử vẫn chưa phát triển mạnh Hiện chưa có một chương trình chọn giống MAS nào được thực hiện trên đối tượng tôm sú, các nhà khoa học vẫn đang nghiên cứu nhằm tìm ra các marker phân tử có thể ứng dụng trong chọn giống tôm theo phương pháp MAS [51]

Dưới đây là một số thông tin về tình hình nghiên cứu chọn giống ở tôm: về tính trạng sinh trưởng, nghiên cứu chọn giống tôm bao gồm cải thiện và phát triển

khả năng sinh trưởng và tồn tại của tôm ở Brazil đã được Jol cùng cộng sự tiến hành vào năm 2013 [45] Cũng trong năm 2013, nhóm tác giả Alejandra đã tiến hành

Trang 22

nghiên cứu các tham số di truyền liên quan tới các tính trạng sinh sản và sinh trưởng đối với loài tôm thẻ chân trắng Các tính trạng nghiên cứu là số lượng trứng (NE) và

số lượng ấu trùng (NN) và trọng lượng cơ thể tôm cái ở giai đoạn thụ tinh (FWI) và trọng lượng cơ thể ở giai đoạn 130 ngày tuổi (BW130) Từ các giá trị nghiên cứu thu được nhóm tác giả đã bước đầu kết luận mối quan hệ tỉ lệ thuận giữa khả năng sinh sản của tôm cái và trọng lượng cơ thể của tôm Bên cạnh đó nghiên cứu cũng bộc lộ một số giả thuyết về sự ảnh hưởng của mật độ tôm tới khả năng sinh sản, mặc dù vậy để có các kết luận cuối cùng, cần có các nghiên cứu sâu hơn và trên quy

mô lớn hơn [16] Về năng suất của tôm sú nuôi, năm 2010 Nigel và cộng sự, đã

đánh giá sản lượng tôm sú thu được ở Australia với thế hệ thứ 8 của tôm sú gia hóa của cơ quan khoa học quốc gia Australia (CSIRO) và các đối tác, năng suất trung bình đạt 17,5 tấn / ha một số ao ở trên 20 tấn / ha Mở ra các cơ hội cho công sản

xuất công nghiệp trên quy mô lớn trên đối tượng tôm sú [65] Về đặc điểm kháng bệnh, Nam Mỹ đang rất tích cực trong việc nghiên cứu năng ngừa bệnh dịch và

chọn giống kháng bệnh Năm 2013 Gael và cộng sự đã có báo cáo về kết quả và

toàn cảnh về tình hình nghiên cứu này [38] Về chọn giống sạch bệnh, một số

nghiên cứu đã thu được thành công trong nuôi tôm sạch bệnh [59, 61] Tuy nhiên, không dễ để tránh hoặc loại trừ tận gốc dịch bệnh trong điều kiện nuôi trồng ngoài đầm, ao Trong nghiên cứu của Reyes, một số khu vực ở Nam và Đông Nam Á đã tránh được sự lây lan của dịch bệnh đốm trắng do điều kiện nhiệt độ nước cao hơn

so với các khu vực khác [76] Bên cạnh đó, Thái Lan nhờ việc sử dụng giống sạch bệnh và các phương pháp kiểm soát sinh học đã giảm đáng kể diện tích chịu thiệt hại của bệnh đốm trắng [44] Ngoài ra, tôm phát triển trong môi trường xuất hiện dịch bệnh đã hình thành nên một số cá thể có thể chống lại sự lây lan của dịch bệnh

và bảo vệ chúng khỏi bệnh từ môi trường sống Một số cá thể có cơ chế miễn dịch bẩm sinh, bản thân chúng đã tự có cơ chế bảo vệ trước các tác nhân môi trường [24]

1.2.3.3 Gia hóa tôm sú

Trang 23

Khép kín vòng đời của tôm sú trong các hệ thống nuôi trong nhà gần đây đã thành công trên rất nhiều thế hệ sản xuất trong các chương trình nghiên cứu, Tuy nhiên, gia hóa tôm sú hiện vẫn chưa được thương mại hóa phổ biến, chủ yếu là do

sự sinh sản kém, khả năng giao phối tự nhiên thấp, khả năng trứng nở thành công không cao Các nghiên cứu về sinh trưởng và sinh sản của tôm sú đã được công bố

từ những năm 1980, tuy nhiên tất cả những đánh giá tại thời điểm đó chủ yếu tập trung vào tính trạng sinh trưởng nhanh và công nghệ nuôi trồng chứ không phải là gia hóa tôm sú Đối với các nước nuôi tôm sú, một vấn đề quan trọng gặp phải là sự phụ thuộc vào nguồn giống tôm bố mẹ ngoài tự nhiên Số lượng cung cấp thay đổi theo mùa và hàng năm không thể đoán trước của tôm bố mẹ tự nhiên đã dẫn đến tình trạng thiếu hụt nghiêm trọng nguồn bố mẹ và hậu ấu trùng Việc sử dụng nguồn giống bố mẹ tự nhiên cũng gây cản trở các cơ hội để tăng cường sản xuất thông qua việc kiểm soát sự lây lan của dịch bệnh và chọn giống theo các đặc điểm mong muốn như tốc độ sinh trưởng nhanh và miễn dịch tốt Một trong số các yếu tố thúc đẩy sự tăng trưởng nhanh chóng của ngành công nghiệp là sự chuyển đổi nhanh chóng từ việc sử dụng tôm giống bố mẹ tự nhiên đến việc sử dụng các giống tôm bố

mẹ thuần hóa, thành công trong gia hóa tôm thẻ chân trắng này đã thay đổi bộ mặt của nuôi trồng thủy sản, cụ thể là tôm thẻ chân trắng từ Châu Mỹ tới Châu Á, từ đó sản lượng của ngành công nghiệp nuôi tôm toàn cầu từ 1,5 triệu tấn năm 2002 đã tăng lên 3 triệu tấn trong năm 2012 [66] Không giống như tôm thẻ chân trắng dễ dàng nuôi trong điều kiện nhà nuôi đến giai đoạn phù hợp có thể lai tạo, việc nuôi trồng tôm sú trong điều kiện nuôi nhốt và tối ưu hóa điều kiện sinh sản trên thực tế

là rất khó khăn [29]

Cho đến giai đoạn hiện nay, đã có rất nhiều các nghiên cứu gia hóa tiêu biểu

đã có những thành công bước đầu và là cơ sở quan trọng cho các nghiên cứu gia hóa tôm sú trong thời gian sắp tới, có thể kể đến như: Vào năm 2002 tại Australia,

sự cần thiết phải đầu tư nghiên cứu gia hóa nguồn giống tôm sú bố mẹ là ưu tiên cao nhất đối với ngành công nghiệp nuôi tôm sú Để đáp ứng ưu tiên này, một dự án

Trang 24

gia hóa khép kín vòng đời tôm bố mẹ đã được xây dựng với sự hợp tác của các tổ chức: Viện Khoa học Biển Australia và Bộ Nông nghiệp Queensland đã được khởi xướng Kết quả sau 5 năm nghiên cứu cho thấy dòng tôm gia hóa ở thế hệ thứ ba có sức sinh trưởng và sống sót tốt hơn so với tôm có nguồn gốc tự nhiên Điều đó có nghĩa là chúng ta không còn phụ thuộc hoàn toàn vào nguồn tôm bố mẹ thu thập trên biển, thường chỉ có theo mùa và sản lượng thất thường trong cung cấp, nhờ vậy

sẽ chủ động hơn trong sản xuất.Tuy nhiên, tính về sản lượng trứng của tôm gia hóa

ở thế hệ thứ 3 thường kém hơn so với tôm tự nhiên từ biển với số lượng khoảng 250.000 và 100.000 tương ứng Mặc dù vậy kết quả này cũng đã tốt hơn rất nhiều

so với các con số trước đây, sản lượng chỉ khoảng 40.000 trứng Bên cạnh đó, kết quả khảo sát cho thấy, tỷ lệ sống của ấu trùng của tôm gia hóa cao hơn so với nguồn gốc tự nhiên với các trị số 45% so với 30% sống sót tương ứng, lý giải cho điều này, một số chuyên gia cho rằng việc sản xuất ít trứng giúp số lượng trứng này dự trữ được nhiều năng lượng hơn và kèm theo đó là khả năng tồn tại tốt hơn Một câu hỏi được đặt ra là: sản lượng trứng và khả năng sống sót của ấu trùng được tạo ra bởi tôm gia hóa có đáp ứng được nhu cầu mà ngành công nghiệp nuôi tôm đòi hỏi hay không? Đây vẫn là vấn đề cần thêm thời gian để chứng minh [67] Năm 2009 Nigel và cộng sự đã chọn lọc được các gia đình có tỉ lệ hình thành ấu trùng cao hơn, sản lượng cao hơn, thành công của nghiên cứu này được dự đoán sẽ giúp thương mại hóa các giống tôm sú, tiến tới giảm giá thành và tăng năng suất tôm sú, mở rộng cơ hội cạnh tranh của tôm sú với tôm thẻ chân trắng [64] Năm 2013 dự án

“Gia hóa tôm sú và chọn giống tôm sú ở Thái Lan” đang tiếp tục được thực hiện Tuy nhiên có thể nhận thấy khả năng sinh sản của thế hệ F1 gia hóa so với tự nhiên

là thấp hơn [97] Kể từ năm 2001, công ty Moana Technologies đã cung cấp ra thị trường giống tôm sú gia hóa, đây là các giống sạch bệnh đã được thương mại hóa ở một số nước Châu Á như Thái Lan, Ấn Độ và Việt Nam Gần đây, Moana đã tiến hành xây dựng một chương trình chọn giống tôm sú ở Haiwai dựa vào các giống tôm bố mẹ bắt được từ tự nhiên tại 7 địa điểm của Châu Á Tôm gia hóa đã được

Trang 25

kiểm tra và kiểm định qua nhiều gia đoạn, 3 giống tôm với khoảng 75 đến 80 gia đình đến nay vẫn đang tiếp tục phát triển, các thế hệ từ F6 đến F9 của các giống này hiện đang được khảo nghiệm tại Việt Nam [43] Gia hóa tôm sú là một công việc rất khó khăn đòi hỏi thời gian, vật chất và sự đầu tư nghiên cứu của các chuyên gia nuôi trồng thủy sản, do đó các chương trình gia hóa trên thế giới đã được hình thành Bảng 1.1 là số liệu thống kê một số chương trình gia hóa tôm sú trên thế giới

từ những năm đầu cho đến nay

Ở Việt Nam, cho đến nay cũng đã có một số nghiên cứu bước đầu về gia hóa tôm sú có thể nhắc đến như: Nghiên cứu gia hóa tôm sú của tác giả Hoàng Tùng thực hiện tại Đại học Thủy sản Nha Trang năm 2005 và mới đây là nghiên cứu gia hóa tôm sú và khép kín vòng đời tôm sú ở Việt Nam của tác giả Nguyễn Duy Hòa năm 2009 Tuy nhiên hiện chưa có công bố nào về sự thành công trong gia hóa tôm

sú tại Việt Nam [63]

Bảng 1 1 Một số chương trình gia hóa tôm sú trên thế giới [63]

Aquacop in Tahiti (French

Polynesia)

Chương trình nghiên cứu của các nhà khoa học Pháp Chương trình này đã sản xuất thành công tôm giống trong điều kiện nuôi nhốt lên đến thế hệ thứ 3 và khả năng sống sót là khá tốt

SEAFDEC in the Philippines

Chương trình nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản và Philippine, chương trình này sản xuất giống tôm tại cac ao nuôi, tuy nhiên kết quả thu được về khả năng sống sót

là khá thấp

National Center for Genetic

Engineering and Biotechnology in

Thailand

Chương trình nghiên cứu của các nhà khoa học Thái Lan sản xuất các giống tôm từ môi trường ao nuôi, tuy nhiên nó không thành công do những hạn chế về an toàn sinh học trong ao đất, khả năng sống sót và chất lượng tôm giống thu được thấp

Trang 26

CSIRO in Australia

Chương trình này được thực hiện bởi các nhà khoa học Australia, kết quả đã thuần hóa được tôm giống bố mẹ, sức sinh trưởng và sinh sản đã được cải thiện, tuy nhiên hiện vẫn chưa được thương mại hóa trên quy mô quốc

tế

MOANA Technologies Inc

Dự án này được sản xuất thương mại chọn dưới sự chọn lọc di truyền giống tôm đa dạng

từ tôm bố mẹ thuần hóa Kể từ 2008, tôm sú giống từ Moana đã được thương mại hóa ở

Ấn Độ, Thái Lan và Việt Nam

1.3.1 Chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh

Khi dịch bệnh bùng phát, người dân thường sử dụng thuốc Doxicyline, Oxy Tetracycline để điều trị Tuy nhiên, cách làm này không hữu hiệu vì bệnh có thể tái phát mạnh sau 2 tuần đến 1 tháng Hiện tại chưa có thuốc đặc hiệu để trị bệnh nên công tác phòng ngừa tổng hợp bao gồm tẩy trùng ao nuôi, ngăn cản sự xâm nhập của các sinh vật mang mầm bệnh vào ao nuôi và sử dụng tôm giống sạch bệnh được khuyến cáo như một biện pháp an toàn sinh học [33] Do đó cần có các phương pháp phát hiện sớm sự hiện diện virus gây bệnh trên đàn tôm giống trước khi thả nuôi và trên ao nuôi tôm công nghiệp nhằm hạn chế nguy cơ bùng phát dịch bệnh

a Các phương pháp chẩn đoán dựa trên DNA

Phương pháp PCR

Trang 27

PCR (Polymerase Chain Reaction) được biết đến như là một kỹ thuật có độ nhạy và độ chính xác cao được ứng dụng cho việc chẩn đoán tác nhân virus gây bệnh trên tôm Việc chẩn đoán WSSV bằng kỹ thuật Nested PCR [27], YHV bằng RT-PCR [98], và IMNV, IHHNV với việc sử dụng kỹ thuật Nested RT-PCR [70, 73] là những phương pháp chuẩn mà Cơ quan Quốc tế về Dịch bệnh Động vật (OIE) đã công nhận và đang được sử dụng tại các phòng thí nghiệm ở Mỹ, Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản Ngoài ra, phương pháp chẩn đoán đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh hại bằng Multiplex RT-PCR cũng đã được phát triển

và ứng dụng [11, 12, 71] Một kỹ thuật khác, Realtime PCR, có khả năng định lượng số bản sao virus cũng đã được công bố [47, 75]

Mặc dù PCR đã là một trong những phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất trong phát hiện các bệnh của tôm, tuy nhiên cũng đã có những báo cáo về các kết quả dương tính giả đã được báo cáo trong một số nghiên cứu của các nhà khoa học của Thái Lan [81] và Ấn độ [41] Điều này cho thấy, các mồi nên được thiết kế chỉ trong vùng bảo thủ của virus

Ngoài ra, phương pháp Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) [69] là kỹ thuật mới, có độ nhạy cao và nhanh chóng có thể chẩn đoán bệnh cho các loài thủy sản Nó là một hệ thống chẩn đoán có hiệu quả khuếch đại cao với lượng DNA được khuếch đại đến 109-1010 lần trong vòng 15-60 phút sử dụng 4 mồi, hai mồi bên trong và hai mồi bên ngoài Khuếch đại và phát hiện gen có thể được hoàn thành chỉ trong 1 bước, bằng cách ủ hỗn hợp mẫu, primers, DNA polymerase ở nhiệt độ cố định (khoảng 65°C) Phương pháp LAMP cho phép phát hiện tác nhân gây bệnh ở nồng độ 1fg so với 10 fg của phương pháp nested PCR

Các phương pháp dựa trên nguyên lý lai phân tử DNA

Các phương pháp dựa trên nguyên lý lai phân tử DNA bao gồm: Dot blot [32], lai tại chỗ [26], lai southern blot [94], cảm biến sinh học [127] Nghiên cứu của Shekhar và cộng sự [79] trong việc so sánh độ nhạy của DNA dot blot và PCR cho thấy rằng: mặc dù PCR có độ nhạy cao hơn để phát hiện bệnh, tuy nhiên DNA

Trang 28

dot blot có một lợi thế hơn PCR trong việc có thể áp dụng đối với những mô khó thực hiện PCR do có nhiều yếu tố ức chế như: cuống mắt, mắt, lớp biểu bì…

b Phương pháp phát hiện dựa trên phản ứng miễn dịch

Các phương pháp chẩn đoán miễn dịch sử dụng cả hai loại kháng thể đa dòng (PAb) và kháng thể đơn dòng (MAb) đã được phát triển để phát hiện virus gây bệnh đốm trắng Một phương pháp dot blot nhanh chóng và đơn giản đã được phát triển để phát hiện hai loại virus WSV và YHN gây bệnh ở tôm Người ta đã thành công trong việc tạo kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú, từ đó sản xuất các que thử nhanh sử dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện sớm virus gây bệnh [80] Đặc điểm của các phương pháp phát hiện dựa trên phản ứng miễn dịch là giá thành thấp, khả năng phát hiện nhanh và có thể đánh giá mức độ nhiễm bệnh của tôm [127]

c Phương pháp chẩn đoán khác

Microarray cũng là phương pháp được sử dụng trong chẩn đoán bệnh tôm Ứng dụng của Microarray DNA trong thủy sản đã hiểu rõ 30 gen liên quan tới miễn dịch và 6000 gen biểu hiện dự đoán tại các mô của tôm Phương pháp ứng dụng microarray miễn dịch đã được áp dụng trong sàng lọc tôm sú bố mẹ có khả năng kháng bệnh Kết quả cũng chỉ ra mức độ biểu hiện cao của protein hemocyanin trong tôm bố mẹ có khả năng kháng bệnh Kết quả cũng bộc lộ sự biểu hiện của một

số gen miễn dịch (crustin, lysozyme, Mo-penaeidin, transglutaminase and type proteinase inhibitor) đã tăng lên đáng kể, sau khi bị lây nhiễm Phân tích

Kazal-microarray DNA của tôm có thể cung cấp các manh mối quan trọng để nghiên cứu các quy tắc bên trong của tế bào và giữa các gen liên quan tới miễn dịch Hơn nữa, microarray DNA có thể cũng cung cấp các công cụ hữu ích để nhận diện các gen marker kháng bệnh cho các chương trình chọn giống sạch bệnh và khám phá cơ chế miễn dịch của tôm [58]

1.3.2 Phát triển các chỉ thị phân tử

Trang 29

Sự phát triển của các marker di truyền dựa trên DNA đã có tác động mang tính cách mạng trên di truyền động vật Với các marker DNA, theo lý thuyết có thể quan sát và khám phá sự đa dạng di truyền trong toàn bộ hệ gen Các marker di truyền phổ biến trong nuôi trồng thủy sản bao gồm: allozymes, mitochondrial DNA, Restriction Fragment Length Polymophism (RFLP), Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Amplified Fragment Length Polymophism (AFLP), microsatellite, SNP, và các marker EST đã được phát triển ở các mức độ khác nhau trên một số loài tôm [95, 111, 122, 134] Ứng dụng của các marker DNA đã cho phép tiến bộ nhanh chóng trong nghiên cứu về sự đa dạng di truyền và giao phối cận huyết, nhận diện các loài, và xây dựng bản đồ liên kết di truyền độ phân giải cao đối với các loài thủy sản nghiên cứu sử dụng những marker di truyền sẽ làm giảm nghi ngờ trong thúc đẩy sự nhận diện của các gen trong các locus tính trạng số lượng (QTL) Mở rộng, gia tăng số lượng các marker phân tử, xây dựng các bản đồ

di truyền với mật độ dày, giải mã toàn bộ hệ gen sẽ cung cấp các công cụ hữu ích nhằm cải thiện ngành thủy sản thông qua các chương trình chọn tạo [19, 21]

Allozyme marker

Allozyme là các dạng alen khác nhau của protein tạo bởi một locus gen đơn,

và được quan tâm như một marker bởi tồn tại sự đa hình và bởi chúng đại diện cho một protein Kể từ năm 1960, phân tích allozyme đã trở thành phổ biến nhất trong các phương pháp phân tử trong nghiên cứu di truyền thủy sản và là marker sớm nhất sử dụng trong nghiên cứu di truyền thủy sản

Trình tự amino acid khác nhau giữa các chuỗi polypeptide của các dạng alen khác nhau của enzyme phản ảnh sự thay đổi trong trình tự của DNA Tùy thuộc vào bản chất của các phân tử amino acid, kết quả, các protein sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau (dựa trên cả điểm đẳng điện và kích thước) khi di chuyển trên gel tinh bột trong điện trường

Mitochondrial DNA marker

Trang 30

Các nghiên cứu gần đây đang cho thấy rằng sự đa hình trong các trình tự hệ gen ty thể cao hơn hệ gen nhân Hệ gen ty thể có thuộc tính chứa tỷ lệ đột biến cao hơn, điều này có thể là kết quả của sự thiếu cơ chế sửa chữa trong suốt quá trình tái bản và kích thước nhỏ hơn Hầu như toàn bộ hệ gen ty thể được phiên mã ngoại trừ vùng D-loop

Marker mtDNA đã được sử dụng và rất phổ biến trong nghiên cứu di truyền giữa các loài thủy sản, một vài marker được sử dụng để nhận diện loài thủy sản bố

mẹ Trong những ngày đầu nghiên cứu, các marker này kết hợp với allozyme là những thành phần quan trọng để khám phá đặc điểm di truyền của các loài thủy sản Năm 2004, mtDNA đã được sử dụng để nghiên cứu về di truyền quần thể của các loài tôm Đoạn trình tự 617 giàu AT của hệ gen ty thể đã được khuếch đại và giải trình tự Kết quả phân tích cho thấy 15 vị trí đa hình do sự thêm và mất nucleotide,

165 vị trí đa hình do sự thay thế 100 kiểu gen đơn bội đã được xác định Kết quả cho thấy vùng giàu AT nói trên là marker có hiệu quả trong nghiên cứu cấu trúc di truyền và đa dạng di truyền [60]

Tôm giống tự nhiên ở những vùng khác nhau sẽ khác nhau về sức sinh sản,

tỷ lệ sinh trưởng, khả năng chống chịu bệnh và rất nhiều đặc tính khác Ví dụ như ở Thái Lan, ấu trùng tôm sinh ra từ tôm giống có nguồn gốc ở vùng biển Andaman có sức sống và sinh trưởng nhanh hơn ấu trùng tôm sinh ra từ tôm giống có nguồn gốc

ở các vùng khác Những nghiên cứu về mặt di truyền thông qua vùng mtDNA cũng cho thấy quần thể tôm sú ở vùng biển Andaman rất khác biệt so với quần thể tôm sú

ở Vịnh Thái Lan [49, 50] Do đó, việc phân tích, đánh giá cấu trúc di truyền và sự

đa dạng của quần thể tôm sú là bước đầu tiên rất quan trọng trong quản lý nghề nuôi trồng tôm sú, cũng như trong nghiên cứu gia hóa và chọn giống tôm sú

Năm 2000, toàn bộ genome ty thể lần đầu tiên được giải mã [96] Genome ty thể tôm sú có kích thước 15984 bp, bao gồm các gen mã hóa 13 protein, 22 tRNAs

và 2 rRNAs Nhiều nghiên cứu cho thấy các gen ty thể cytochrome oxidase I (COI)

và 16S rRNA là những gen bảo thủ, mức độ tiến hóa chậm nên thường được sử

Trang 31

dụng trong nghiên cứu về tiến hóa ở mức độ loài [52, 91] Ngược lại, vùng điều khiển của genome ty thể (mtCR hay D-loop) là vùng tiến hóa nhanh, cung cấp nhiều thông tin để phát hiện thêm nhiều kiểu đơn bội (mitochondrial haplotype) D-loop là vùng rất quan trọng với việc đánh giá đa dạng di truyền bên trong và giữa các quần thể của loài [28] Nghiên cứu gần đây về đa dạng kiểu đơn bội ở các quần thể tôm

sú vùng Ấn Độ-Thái Bình Dương dựa trên trình tự đoạn D-loop cho thấy đã có tổng

số 262 kiểu đơn bội (haplotype) được phát hiện trong số 316 cá thể thuộc 8 quần thể khác nhau [99] Mức độ đa dạng kiểu đơn bội là rất cao trong các quần thể và số lượng kiểu đơn bội sẽ còn được tiếp tục phát hiện thêm nếu phân tích với số lượng

cá thể và quần thể lớn hơn

RFLP

Marker RFLP được xem là chỉ thị đầu tiên trong cuộc cách mạng nghiên cứu

về hệ gen, tạo nên sự khác biệt hoàn toàn trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh học Nguyên lý của phương pháp RFLP là việc sử dụng các enzyme nhận biết các vị trí nucleotide đặc hiệu từ 4-8 cặp base (bp) và cắt ở tất cả các vị trí có trình tự đặc hiệu xuất hiện Với những sự thay đổi về indel, sự thay thế base, và sự sắp xếp lại trình

tự DNA làm cho các trình tự nhận biết thay đổi và dẫn tới các đoạn cắt ở các mẫu khác nhau là khác nhau, RFLP có thể cho phép tìm thấy sự khác nhau giữa các cá thể, quần thể và giữa các loài thông qua phương pháp điện di trên gel agarose Ngoài ra, các đoạn có kích thước khác nhau còn có thể được phát hiện sử dụng phương pháp phân tích Southern blot, trong đó, DNA được cắt nhỏ, được phân tách thông qua điện di trên gel agarose, tiếp đó sản phẩm được chuyển qua màng và lai với các mẫu dò có đánh dấu

Phương pháp phân tích mtRFLP đã được các nhà nghiên cứu sử dụng khá phổ biến trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể tôm sú ở các vùng khác nhau

Sự khác biệt di truyền khá rõ ràng giữa quần thể tôm sú ở hai vùng ven biển Đông

Trang 32

và Tây Australia được đánh giá dựa trên kết quả phân tích RFLP của mtDNA [23] Năm 1999, các nhà nghiên cứu Thái Lan cũng sử dụng kỹ thuật RFLP đã tiến hành đánh giá sự đa dạng di truyền của ba quần thể tôm sú thuộc vùng biển Amanda và Vịnh Thái Lan [49] Phương pháp này tiếp tục được sử dụng rộng rãi để khảo sát các quần thể tôm sú ở Thái Lan [50], ở các vùng thuộc Ấn Độ- Thái Bình Dương [22] và ở Việt Nam [10]

tự giữa các mẫu khác nhau có sự khác nhau, vì vậy RAPD có khả năng tương đối cao trong việc phát hiện sự đa hình

Năm 2011, nhóm tác giả Rezvani đã sử dụng marker RAPD để xác định tính

trạng sinh trưởng di truyền của tôm thẻ đuôi đỏ Fenneropenaeus indicus 90 cá thể

tôm ở giai đoạn Postlarvae là sản phẩm của tôm bố mẹ ở các giai đoạn khác nhau từ

1 ngày cho đến 4 tháng được chọn làm vật liệu nghiên cứu Tôm được chia thành 3 nhóm: sinh trưởng nhanh, sinh trưởng bình thường và sinh trưởng chậm (dựa vào khối lượng và kích thước) Các cặp mồi RAPD được sử dụng gồm OPAQ 4,7,9 tuy nhiên OPAQ 4 cho thấy mức độ đa dạng cao nhất với khoảng cách di truyền cao nhất là 0,457 và thấp nhất là 0,091 [77] Ở Việt Nam, năm 2003, nhóm tác giả

Quyền Đình Thi đã sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích đa hình tôm sú (Penaeus monodon) Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra mức độ đa hình trong tập hợp mẫu phân

tích và khả năng ứng dụng kỹ thuật RAPD trong đánh giá đa dạng di truyền [10]

AFLP

Trang 33

Kỹ thuật AFLP được hiểu là sự đa dạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi 2 enzyme giới hạn, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR AFLP là một trong những kỹ thuật nhận dạng vân tay DNA được phát triển bới Vos và cộng sự năm 1995 Kỹ thuật này là một công cự hữu ích để xác định nhiều locus đa hình mà không cần phải biết trước thông tin về trình tự DNA của chúng, phương pháp này có thể đưa ra nhanh chóng một ước lượng về mức độ đa dạng di truyền trong và giữa những quần thể với nhau Trong nghiên cứu của Ventura 2011, một marker DNA đặc hiệu của tôm cái đã đã phát hiện thông qua kỹ thuật AFLP trên hơn 200 cá thể tôm Vùng trình tự được coi

là marker có tổng kích thước vào khoảng 3 kb, và có khả năng nhận diện được giới tính các cá thể [132]

Năm 2011, Vos và cộng sự đã nghiên cứu thiết lập bản đồ di truyền của loài

Artemia franciscana dựa trên kỹ thuật AFLP bản đồ liên kết di truyền là cơ sở của

tạo bản đồ các locus tính trạng số lượng (QTL) hỗ trợ chọn giống Đến năm 2013, nhóm tác giả này đã công bố bản đồ hoàn chỉnh đầu tiên của loài này, trong đó 8 marker di tuyền liên kết với giới tính đã được xác định [108] Ngoài ra, bản đồ liên kết đã được tạo ra đối với một số loài tôm và hầu hết được tạo lập bằng phương pháp AFLP [83, 102] Đối với tôm sú, năm 2005, 6 marker trong đó có 1 marker liên kết với giới tính đã được nhóm tác giả Khammamtong phát hiện thông qua kỹ thuật AFLP [118]

Microsatellite

Microsatellite là vùng lặp lại của hai hay ba base Số lượng các lặp lại thể hiện mức độ đa hình bên trong và giữa các loài Với các trình tự phiên mã, các microsatellite có nhiều khả năng có được thành công trong các nghiên cứu quan hệ

di truyền và phân loại bởi trình tự mồi trên các vùng phiên mã thường rất bảo thủ Đối với loài tôm sú, đã có rất nhiều các nghiên cứu đánh giá mức độ đa dạng di truyền thông qua microsatellite, cụ thể: Nghiên cứu của Pongsomboon và cộng sự năm 2000, đã tìm kiếm các microsatellite trên 79 cá thể từ đó phát hiện ra (GAA)n

Trang 34

là một marker có tần suất xuất hiện cao nhất, tiếp đó là (GATA)n, đây là hai marker microsatellite có mức độ khác nhau cao nhất và chúng được dự đoán sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền giữa các loài tôm [72] Trong đánh giá đa dạng di truyền tôm bố mẹ, microsatellite được chứng minh là marker cung cấp các kết quả tốt nhất Thông qua sự sai khác rất lớn giữa các cá thể, với số lượng lớn các đa hình được phát hiện, microsatellite đã cho thấy các kiểu gen duy nhất với mỗi cá thể [68] Một ứng dụng khác của microsatellite đã được phát triển, đó là xây dựng bản

đồ liên kết di truyền và ứng dụng trong các chương trình chọn giống loài tôm sú Nghiên cứu này được Maneeruttanarungroj và cộng sự thực hiện trong năm năm

2006, tổng số 997 microsatellite bao gồm cả các EST marker đã được nhận diện từ

10100 trình tự EST trong thư viện EST của tôm sú, trong đó 144 marker mới đã được bổ sung vào bản đồ di truyền tôm sú [121]

SNP

SNP là các vị trí của cặp base trong phân tử DNA mà tại đó có sự khác nhau

về trình tự nucleotide giữa các cá thể trong quần thể hoặc giữa các quần thể, sự thay đổi trình tự cặp base được gọi là SNP nếu tần suất xuất hiện của nó trong tập mẫu ≥ 1% Nói một cách đơn giản, SNP là sự đa hình xảy ra giữa các mẫu DNA với cụ thể một nucleotide đơn SNP là marker chiếm đa số trong các marker phân tử của hệ gen Bản đồ SNP quốc tế của người hiện có khoàng 1.42 triệu SNP với tỉ lệ khoảng

1 SNP/ 1,9 kb Căn cứ vào sự phong phú của SNP trong hệ gen, chúng đã trở nên rất hữu dụng trong việc lập bản đồ di truyền với mật độ dày đặc, đây là điều không thể có với các marker phân tử khác Cũng nhờ vào sự phong phú này mà SNP có khả năng cung cấp các thông tin cần thiết hơn và đáng kể hơn trong các nghiên cứu

về kiểu gen Các SNP trong các vùng mã hóa có thể có các chức năng đáng kể nếu kết quả sự thay đổi của các amino acid gây ra sự thay đổi về kiểu hình Các marker SNP kết hợp với sự thay đổi kiểu hình sẽ định nghĩa chính xác đa hình chức năng [86]

Trang 35

Năm 2008, Cheng và cộng sự đã tiếp cận hướng nghiên cứu EST, nhằm tìm kiếm các SNP liên quan tới các tính trạng quan trọng của tôm thẻ chân trắng trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã sử dụng 155411 trình tự EST từ thư viện EST của tôm thẻ chân trắng để phân tích, từ đó 17 225 SNP đã được phát hiện, bao gồm

9546 sự chuyển vị trí, 5124 sự đảo vị trí, 2481 indel… Trong đó 7298 SNP xuất hiện tại các contig đã được chú giải chức năng và 4262 vị trí có khả năng là đột biến 250 SNP khác nhau trong các gen liên quan tới các tính trạng kinh tế đã được nhận diện như các ứng viên marker cho chọn giống [55] SNP cũng đã được sử dụng để nghiên cứu đặc điểm di truyền của tôm thẻ chân trắng, trong nghiên cứu của Du và cộng sự năm 2010, bản đồ di truyền SNP của tôm thẻ chân trắng đã được xây dựng [31] Từ cơ sở dữ liệu đó là các EST, các tác giả đã khám phá các marker SNP, từ đó xây dựng bản đồ di truyền SNP đầu tiên với khoảng 835 SNP liên quan tới kiểu hình, 418 SNP liên quan tới giới tính Bằng phương pháp giải trình tự một

số gen được dự đoán liên quan tới các tính trạng quan trọng, 3 SNP nằm trên các

gen AMY2 và CTSL liên quan tới tính trạng sinh trưởng của tôm sú (P monodon)

đã được phát hiện [112] Bản đồ di truyền SNP được các tác giả đánh giá là tương lai của các nghiên cứu về hệ gen của tôm đặc biệt là nhận diện các marker di truyền hoặc các vùng của các tính trạng quan trọng với giá trị kinh tế cao [31]

EST

EST là các trình tự DNA ngắn tạo thành bởi trình tự của các dòng cDNA được lấy ngẫu nhiên trong thư viện Do vậy chúng đại diện cho từng mô, cơ quan hoặc ở các giai đoạn phát triển khác nhau của một mô, cơ quan EST marker được xem như tổng hợp của các chỉ thị phân tử (SNP, microsatellite, gen chọn lọc,…) bởi thông tin

có được từ EST marker có thể cho phép phát hiện phần lớn các chỉ thị phân tử còn lại Thư viện cDNA/ EST có thể giúp ích một cách hiệu quả và nhanh chóng trong việc nghiên cứu biểu hiện, phát hiện các gen mới, các alen và đa hình Nghiên cứu

về gen thông qua phân tích EST đã được xây dựng cho một số loài tôm như: tôm sú

(Penaeus monodon), Fenneropenaeus chinensis, Marsupenaeus japonicus,

Trang 36

Litopenaeus setiferus, and Litopenaeus vannamei Mặc dù sự hiểu, chú giải chức

năng của các dữ liệu EST của tôm sú hiện nay đang ở giai đoạn đầu Tuy nhiên, nó

dự kiến sẽ mang đến số lượng lớn các gen mới liên quan đến khả năng miễn dịch, sinh sản, nội tiết và tiêu hóa, và các tính trạng khác, cung cấp một cơ hội để hiểu rõ hơn về sinh lý của tôm sú [78] Các nghiên cứu về marker cDNA/EST đã và đang rất được quan tâm trên thế giới cũng như ở Việt Nam trong tiếp cận xem xét các đặc điểm di truyền của tôm Cụ thể: Năm 2002, Tong và cộng sự đã phát triển các marker cDNA/EST đa hình của loài tôm sú và ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng

di truyền Nghiên cứu đã chỉ ra sự đa dạng giữa các quần thể tôm Penaeus chinensis, P japonicus and P vannamei thông qua sử dụng các EST marker Kết

luận của nhóm tác giả cho thấy, các marker cDNA/EST đa hình có khả năng ứng

dụng trong nghiên cứu di truyền quần thể của tôm [90]

1.3.3 Nghiên cứu chức năng của những gen liên quan tới một số tính trạng

quan trọng

Từ các chương trình giải mã cDNA/ EST ở tôm sú (P monodon) đã xác định

được trình tự một số gen liên quan tới miễn dịch, sinh trưởng, và sinh sản [40, 84,

85, 89, 103] Những gen này đã và đang được tiếp tục nghiên cứu nhằm chứng minh chức năng và vai trò của chúng trong cơ thể [18, 82, 88, 92] Tuy nhiên, các gen mã hóa các protein vẫn chưa được phân tích nhiều và số lượng những gen này còn khá

ít ỏi so với số lượng các dòng EST thu được

Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về đặc điểm sinh trưởng, sinh sản và hệ thống miễn dịch của tôm sú còn rất hạn chế do thiếu nhiều những thông tin về genome và sự biểu hiện gen của chúng Do vậy, tiếp cận nghiên cứu cấu trúc của một số gen liên quan đến sinh trưởng, sinh sản, và miễn dịch sẽ là những nguyên liệu quan trọng phục vụ cho những nghiên cứu chức năng sâu hơn Dưới đây là một vài ví dụ cụ thể về một số gen liên quan tới các tính trạng quan trọng:

a Một số gen liên quan tới miễn dịch của tôm

Trang 37

Syntenin

Syntenin của tôm sú là một trong những protein được quan tâm nghiên cứu

Đây là một loại protein trung gian trong quá trình dẫn truyền tín hiệu nội bào

Syntenin tương tác với domain hướng tế bào chất (cytoplasmic domain) của một loại protein xuyên màng syndecan [39] Năm 2002, một đoạn gen syntenin đã được

phân lập từ thư viện cDNA mô máu của tôm sú nhiễm virus gây bệnh đốm trắng [20] Đoạn gen syntenin đã phân lập này có chiều dài 719 bp (mã số GenBank AF335106), trình tự protein suy diễn 233 amino acid với mã kết thúc TAA Brangrak và đồng tác giả (2002) đã chứng minh syntenin biểu hiện mạnh khi tôm bị nhiễm virus gây bệnh đốm trắng Phân tích so sánh trình tự protein cho thấy, syntenin chứa hai PDZ (postsynaptic density protein) domain PDZ domain là vị trí diễn ra các phản ứng tương tác giữa syntein với các protein khác [34] Để nghiên cứu sâu hơn mối liên kết giữa syntenin và sự xâm nhiễm virus ở tôm sú, người ta đã tiến hành các thí nghiệm nhằm xác định các protein tương tác trực tiếp với syntenin [93] Ở nghiên cứu này trình tự đầy đủ của syntenin (kích thước là 969bp) đã được phân lập và biểu hiện Tuy nhiên, trình tự này không được đăng ký trên GenBank Kết quả nghiên cứu của Tonganunt và cộng sự cho thấy syntenin tương tác với alpha-2-macroglobulin ( 2M), một loại protein có trong huyết tương Nhiều nghiên cứu đã cho thấy 2M có vai trò ức chế hoạt động của proteinase và là protein quan trọng trong hệ thống miễn dịch của tôm [10] Cả syntenin và 2M cùng được điều khiển tăng biểu hiện khi tôm nhiễm virus gây bệnh đốm trắng Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy syntenin còn tương tác với nhân tố khởi đầu dịch mã eIF5A và cân bằng sự điều khiển tín hiệu của eIF5A tới p53 cần thiết cho quá trình apoptosis [53]

Hemocyanin

Đầu tiên hemocyanin được biết đến là một protein vận chuyển oxy phân tử Sau đó, nó được chứng minh là một loại protein đa chức năng liên quan đến các phản ứng miễn dịch và các quá trình sinh lý như dự trữ protein, điều khiển thẩm

Trang 38

thấu, chu kỳ lột xác và sự hóa cứng lớp vỏ cu-tin [104] Gần đây, hemocyanin và một số peptide có trình tự tương đồng với trình tự amino acid đầu C của hemocyanin (95-100%) đã được chứng minh có chức năng kháng khuẩn và kháng

nấm [109, 110, 123] Nghiên cứu về hemocyanin ở loài tôm Penaeus japonicus đã

phát hiện hai gen mã hóa hai tiểu phần (subunit) của phức hợp phân tử hemocyanin

là PjHcL và PjHcY Hai gen PjHcL và PjHcY có sự biểu hiện khác nhau ở mức độ phiên mã khi tôm nhiễm WSSV, cụ thể là gen PjHcL có biểu hiện mạnh hơn [119] Năm 2006, Zhang và cộng sự chỉ ra hemocyanin của Litopenaeus vannamei có thể

kết hợp trực tiếp với 8 loài nguồn bệnh vi khuẩn ở tôm [136] Hemocyanin được tách chiết ở tôm sú và cho thấy khả năng kháng nhiều loại virus bao gồm cả virus RNA và DNA [135] Tuy nhiên cơ chế kháng virus của hemocyanin vẫn chưa được sáng tỏ

Nghiên cứu gen Ran ở tôm Penaeus japonicus cho thấy, gen này có chiều dài

645 bp và không có intron khi so sánh với genomic DNA Ran protein của P japonicus được kiểm tra hoạt tính bám GTP và tiếp tục phân tích chức năng Kết

quả RT-PCR và Western blot đã chỉ ra rằng các bản phiên mã và protein Ran được phát hiện ở các mô bao gồm: gan tụy, huyết thanh, mang, ruột, tim và cơ Ở tôm nhiễm WSSV và kháng WSSV sau khi nhiễm 4h, gen Ran được điều khiển tăng đáng kể, điều đó chứng tỏ nó đóng vai trò trong miễn dịch của tôm chống lại sự lây

Trang 39

nhiễm virus [114] Trong nghiên cứu gần đây, Ran GTPase của P japonicus liên

kết với chuỗi nhẹ của myosin, tham gia vào cơ chế thực bào [126] Ran GTAase

mới bắt đầu được chú ý nghiên cứu ở tôm P japonicus

Rho protein

Rho cũng là một thành viên thuộc siêu họ Ras (Ras superfamily) Hầu hết các nghiên cứu của các Ras protein về hoạt tính miễn dịch tập trung vào sự điều khiển cơ chế thực bào bởi Rho GTPase [107] và các nhân tố chịu tác động của Rho ảnh hưởng đến sự điều chỉnh vận động của actin trong quá trình thực bào ở động

vật có vú [106] Ở tôm P japonicus, nghiên cứu so sánh sự biểu hiện gen giữa tôm kháng virus WSSV với tôm thường cho thấy: các gen Ranbp, Rho và Rab được điều

khiển tăng đáng kể trong biểu hiện ở tôm kháng virus Đây là bằng chứng chứng tỏ những GTPase này tham gia vào quá trình truyền tín hiệu trong phản ứng bảo vệ ở tôm [125] Ngoài ra, khi xây dựng thư viện EST tôm sú Tassanakajon và cộng sự đã

chỉ ra: khi tôm sú ở trong điều kiện nhiệt độ bắt buộc (heat stress), gen Rho ở mô

máu của tôm sú được biểu hiện tăng [87]

b Các gen liên quan tới sinh sản

Vitellogenin

Vitellogenin (Vg) của tôm sú có kích thước cDNA khoảng 6,8 kb; mã hóa cho 1943 amino acid với khối lượng phân tử là 211 kDa Protein Vg bao gồm các domain giàu systein có mức độ bảo thủ cao Vg là tiền thân của hầu hết các protein trong lòng đỏ trứng, là nguồn dinh dưỡng trong thời kỳ đầu phát triển phôi thai và

ấu trùng và hiện đang là marker sinh học trong xác định giới [131] Các quá trình của sinh học của Vg được điều khiển bởi các hormone nội tiết bao gồm: Crustacean hyperglycemic hormone (CHH), molt-inhibiting hormone (MIH), và gonad-

Trang 40

inhibiting hormone (GIH) mRNA thông tin của gen Vg có cả trong mô gan tụy và

mô buồng trứng tuy nhiên sự biểu hiện của Vg trong hai mô này trong các giai đoạn

phát triển là khác nhau Trong mô buồng trứng gen Vg biểu hiện mạnh trong giai

đoạn đầu tổng hợp lòng đỏ trứng và giảm dần trong các giai đoạn sau Sự biểu hiện

của gen Vg ảnh hưởng trực tiếp tới sự phát triển của buồng trứng chính vì vậy nó có

liên quan rất lớn tới sự sinh sản của tôm [89]

PmSePM

Trình tự cDNA đầy đủ của selenoprotein M precursor (PmSeP) của tôm sú

có kích thước 904 bp với khung đọc mở (ORF) 396 bp và mã hóa cho chuỗi peptide

gồm 131 amino acid Năm 2010 Rachanimuk và cộng sự đã nghiên cứu phân lập và

mô tả các gen chức có liên quan tới sự phát triển buồng trứng của tôm sú giant tiger

shrimp Penaeus monodon thông qua phương pháp nghiên cứu biểu hiện các gen có

chọn lọc suppression subtractive hybridization (SSH) Kết quả của của RT-PCR của nhóm tác giả này cho thấy rằng mức độ biểu hiện của PmSePM đã giảm đáng kể khi

mô buồng trứng của tôm sú phát triển Theo đó, sự biểu hiện của PmSePM có thể sử dụng như marker sinh học để đánh giá mức độ sinh sản của tôm sú trong các giai đoạn trưởng thành [74]

c Các gen liên quan tới sinh trưởng và sinh sản

Ở côn trùng, sự lột xác không còn xuất hiện ở giai đoạn trưởng thành Tuy nhiên, ở động vật giáp xác, quá trình lột vỏ diễn ra trong suốt quá trình trưởng thành

và sinh sản Quá trình lột xác và sinh sản trong động vật giáp xác là quá trình phối hợp, cả hai đều chịu sự kiểm soát của các hormone nội tiết: Crustacean hyperglycemic hormone (CHH), molt-inhibiting hormone (MIH), và gonad-inhibiting hormone (GIH) được tiết ra từ các xoang nằm dưới gốc mắt (eyetalk) Bên cạnh đó các tế bào thần kinh gốc mắt (eyestalk neuropeptides), các hormone

Định dạng
Số trang	102
Dung lượng	1,94 MB

Nghiên cứu xác định một số gen của tôm sú (penaeus monodon) sử dụng phương pháp phân tích thư viện cDNAEST

Tách chiết RNA tôm sú

Phân đoạn cDNA theo kích thƣớc