Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời glycin cystein và amoni glycyrrhizat bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) không tạo dẫn xuất

Hơn nữa, HILIC vẫn có khả năng phân tích những hợp chất phân tử lớn, kém phân cực [18] như amoni glycyrrhizat, có thể ứng dụng để phân tích đồng thời ba chất amoni glycyrrhizat, glycin v

CYSTEIN VÀ AMONI GLYCYRRHIZAT BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC (HILIC) KHÔNG TẠO

DẪN XUẤT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

CYSTEIN VÀ AMONI GLYCYRRHIZAT BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC (HILIC) KHÔNG TẠO

iii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ Ban giám hiệu nhà trường, sự tận tâm giảng dạy từ các thầy, cô giáo trong suốt quá trình năm năm học tập tại trường vừa qua, đặc biệt từ các thầy cô trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành khoá luận

Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Vũ Ngân Bình, ThS Nguyễn Hoàng Lê, hai thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn em, chỉ bảo tận tình từ

những ngày đầu em làm khoá luận, đưa ra hướng giải quyết đúng đắn khi em gặp phải khó khăn trong quá trình làm thực nghiệm

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Đặng Hoàng – Phó trưởng Bộ môn Hoá phân tích và Độc chất, người thầy đã tận tình

hướng dẫn em, chỉ ra hướng nghiên cứu trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên

bộ môn Hoá phân tích và Độc chất đã tạo mọi điều kiện cho em thực hiện khoá luận

Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên em vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2017,

Sinh viên

Đỗ Thị Tuyết Nhung

iv

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ………1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về sắc ký lỏng tương tác thân nước 2

1.1.1 Nguyên tắc 2

1.1.2 Ưu điểm 5

1.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 6

1.2.1 Glycin 7

1.2.2 Cystein 8

1.2.3 Amoni glycyrrhizat 8

1.2.4 Một số phương pháp phân tích acid amin 9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Nguyên vật liệu 13

2.2.1 Hoá chất 13

2.2.2 Chuẩn bị các dung dịch 14

2.2.3 Chuẩn bị đệm 15

2.2.4 Thiết bị, dụng cụ 15

v

2.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.2 Thẩm định quy trình 17

2.3.3 Áp dụng phương pháp chạy mẫu thị trường 19

2.4 Xử lý kết quả 19

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 20

3.1.1 Khảo sát tỷ lệ thành phần pha động 20

3.1.2 Khảo sát điều kiện pha mẫu 20

3.1.3 Khảo sát pH đệm, nồng độ đệm 23

3.1.4 Lựa chọn cột sắc ký, tốc độ dòng 24

3.1.5 Khảo sát nhiệt độ cột 25

3.1.6 Chọn bước sóng phát hiện 26

3.2 Phương pháp phân tích đồng thời glycin, cystein và amoni glycyrrhizat 28

3.3 Thẩm định phương pháp 29

3.3.1 Độ chọn lọc 29

3.3.2 Độ phù hợp hệ thống 30

3.3.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 32

3.3.4 Độ lặp lại của phương pháp 34

3.3.5 Độ thu hồi của phương pháp 35

vi

3.4 Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm thuốc tiêm trên thị trường 37

3.5 Bàn luận chung 38

3.5.1 Phương pháp xử lý mẫu 38

3.5.2 Sắc ký HILIC 38

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

4.1 Kết luận 40

4.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

vii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AG Ammonium glycyrrhrizate Amoni glycyrrhizat

HILIC Hydrophylic interaction liquid

chromatography

Sắc ký lỏng tương tác thân nước

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Quy trình pha dung dịch chuẩn 14

Bảng 2.2: Quy trình pha đệm phosphat 15

Bảng 2.3: Các yếu tố pha động khảo sát 17

Bảng 3.1: Thời gian lưu của chất phân tích ở các tỷ lệ pha động khác nhau 20

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của pH 23

Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ đệm 24

Bảng 3.4: Thời gian lưu các chất tại hai tốc độ dòng và hai cột 25

Bảng 3.5: Thời gian lưu của chất phân tích ở nhiệt độ 26o C và 30oC 26

Bảng 3.6: Kết quả tính chọn lọc 30

Bảng 3.7: Kết quả độ phù hợp hệ thống 31

Bảng 3.8: Quy trình pha các mẫu đường chuẩn 32

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 33

Bảng 3.10: Kết quả độ lặp lại 34

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ thu hồi của phương pháp 35

Bảng 3.12: Kết quả đánh giá hàm lượng AG trong chế phẩm 37

Bảng 3.13: Kết quả đánh giá hàm lượng CYS trong chế phẩm 38

Bảng 3.14: Kết quả đánh giá hàm lượng GLY trong chế phẩm 38

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Cơ chế tách của HILIC 3

Hình 1.3: Công thức cấu tạo glycin 7

Hình 1.4: Công thức cấu tạo cystein 8

Hình 1.5: Công thức cấu tạo amoni glycyrrhyzat 8

Hình 3.1: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp tại bước sóng 254 nm 21

Hình 3.2: Sắc ký đồ chuẩn đơn cystein tại bước sóng 254 nm 22

Hình 3.3: Phổ hấp thụ AG, CYS, GLY 27

Hình 3.4: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 28

Hình 3.5: Sắc ký đồ các mẫu tại hai bước sóng 254 nm và 200 nm 29

Hình 3.6: Kết quả độ phù hợp hệ thống 31

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất glycin, cystein và amoni glycyrrhizat 33

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Acid amin đóng vai trò rất quan trọng trong cơ thể sống, chúng thường có mặt

trong các thực phẩm bổ sung dinh dưỡng và các thuốc điều trị các triệu chứng suy nhược

do thiếu acid amin Bên cạnh đó, chúng có thể được phối hợp trong các chế phẩm điều trị

với các mục đích khác [6] [15], trong đó, glycin và cystein kết hợp với amoni

glycyrrhizat trong chế phẩm thuốc tiêm nhằm làm giảm tác dụng phụ tăng aldosteron, hỗ

trợ gan thực hiện các phản ứng đào thải độc tố [21] Việc kiểm nghiệm dạng thuốc này

còn gặp phải khó khăn do chứa glycin và cystein là hợp chất rất phân cực, chúng hầu như

không được lưu giữ khi phân tích trực tiếp bằng sắc ký lỏng pha đảo Thông thường, ta sử

dụng phản ứng tạo dẫn xuất cho các acid amin, sau đó định lượng bằng sắc ký pha đảo

[23] hoặc sắc ký trao đổi ion [2] Những phương pháp này còn phức tạp ở khâu chuẩn bị

mẫu, khó khăn khi định tính, định lượng đồng thời cả ba hoạt chất trên trong chế phẩm

Sắc ký lỏng tương tác thân nước là một kỹ thuật mới, có thể giải quyết được vấn

đề này Dựa trên sự kết hợp giữa pha tĩnh phân cực và pha động phân cực [12], ưu điểm

của HILIC là khả năng lưu giữ hợp chất rất phân cực [24] Do đó, HILIC có thể áp dụng

phân tích trực tiếp các acid amin mà không cần tạo dẫn chất Hơn nữa, HILIC vẫn có khả

năng phân tích những hợp chất phân tử lớn, kém phân cực [18] như amoni glycyrrhizat,

có thể ứng dụng để phân tích đồng thời ba chất amoni glycyrrhizat, glycin và cystein

trong một chế phẩm Tính đến thời điểm hiện tại, theo tìm hiểu của tôi, ở Việt Nam và

trên thế giới chưa có nghiên cứu phân tích đồng thời ba chất trên được công bố

Từ những lý do trên, tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp phân tích đồng

thời glycin, cystein và amoni glycyrrhizat bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước

(HILIC) không tạo dẫn xuất” với hai mục tiêu chính:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng glycin, cystein và amoni

glycyrrhizat trong chế phẩm thuốc tiêm bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước

(HILIC) không tạo dẫn xuất

2 Ứng dụng phương pháp này định lượng các thành phần trên trong chế phẩm

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về sắc ký lỏng tương tác thân nước

Khái niệm sắc ký lỏng tương tác thân nước (hydrophilic interaction liquid chromatography - HILIC) lần đầu tiên được đưa ra năm 1990 bởi giáo sư Andrew Alpert,

là một loại sắc ký lỏng hiệu năng cao dựa trên sự kết hợp pha tĩnh phân cực và pha động phân cực gồm dung môi hữu cơ tỷ lệ cao cùng với một dung môi thân nước [11] Đối tượng phân tích HILIC hướng đến thường là các chất phân cực như các acid amin [25], kháng sinh nhóm amino glycosid [24] HILIC có thể được áp dụng phân tích dược chất

và các chất chuyển hoá trên nhiều nền mẫu phức tạp như trong dịch sinh học, thực phẩm

3

Hình 1.1: Cơ chế tách của HILIC

Đây cũng coi là một nhược điểm của HILIC do quá trình phân tích rửa giải phụ thuộc nhiều vào sự solvat hoá trên bề mặt các hạt pha tĩnh, cột HILIC cân bằng chậm, khả năng lặp lại kém, bị ảnh hưởng nhiều bởi các yếu tố như pH, sự thay đổi nhỏ trong tỷ

lệ pha động Đối với một số hợp chất, nhiệt độ quá trình tách và loại detector có thể ảnh hưởng đến thời gian lưu, hình dạng pic sắc ký

b Pha tĩnh

Như đã được đề cập ở trên, pha tĩnh HILIC phân cực, điều này giúp tạo nên một lớp chất lỏng thân nước bao trên bề mặt pha tĩnh lưu giữ chất phân tích Khi tăng nhóm chức phân cực trên pha tĩnh, lớp chất lỏng thân nước trên bề mặt pha tĩnh sẽ tăng lên, tăng thời gian lưu giữ chất phân cực

Khi phân loại về mặt hoá học, pha tĩnh HILIC được phân loại thành các loại sau:

 Silica: Hạt silica có chứa nhóm silanol (-SiOH), đóng vai trò thiết yếu tạo nên bề mặt phân cực của silica

- Nhóm này có 4 loại: Silica xốp hoàn toàn (được sử dụng phổ biến do dung tích cột lớn tăng khả năng chứa một lượng mẫu tiêm lớn hơn, đồng thời kích thước hạt đa dạng hơn); silica xốp bề mặt; silica nguyên khối (ứng dụng còn hạn chế với HILIC); ethylene bridged hybrids (sử dụng trong vùng pH rộng)

 Dẫn xuất silica:

4

- Dẫn xuất silica trung tính: gồm amid silica, diol silica, cyanopropyl silica (ứng dụng với HILIC còn hạn chế), cyclodextrin silica (được ứng dụng tách các chất trong dịch chiết dược liệu và các amino acid)

- Dẫn xuất silica ion lưỡng cực: sulfoalkyl betain silica

- Dẫn xuất silica tích điện dương gồm amino propyl , silica bao latex

- Dẫn xuất silica tích điện âm: silica liên kết poly(succinimid), poly aspartic silica, poly hydroxyethyl A, poly sulfoethyl A

c Pha động

HILIC thường sử dụng pha động là lượng lớn dung môi hữu cơ đồng tan với nước kết hợp với một dung môi thân nước Các dung môi hữu cơ được sử dụng cho pha động HILIC bao gồm acetonitril (ACN) (được sử dụng phổ biến nhất), tetrahydrofuran, dioxan, các rượu nồng độ cao [13] Hỗn hợp ACN ở tỷ lệ 60% - 97% với nước hoặc đệm thường được sử dụng, với lưu ý cần duy trì tỷ lệ nước thấp nhất là 3% để hydrat hoá hoàn toàn các hạt pha tĩnh Khi đó, chất phân tích sẽ phân bố vào cả hai pha, nhìn chung, tỷ lệ dung môi hữu cơ pha động càng cao, thời gian lưu của các chất phân cực càng tăng

Acetonitril là dung môi hữu cơ thường được dùng trong HILIC, với dung môi là rượu, cần được sử dụng ở nồng độ cao để đảm bảo thời gian lưu tương đương với các dung môi hữu cơ khác Như vậy, sắp xếp theo chiều tăng dần lực rửa giải chất phân tích, các dung môi hữu cơ được sắp xếp như sau: aceton < acetonitril < iso – propanol < ethanol < methanol < nước [27] Theo đó, thứ tự rửa giải sẽ là: chất kém phân cực sẽ ra khỏi cột sớm, sau đó là các chất phân cực, tính chất này ngược với sắc ký pha đảo

HILIC có thể thực hiện ở chế độ đẳng dòng với tỷ lệ cao dung môi hữu cơ hoặc chạy chương trình dung môi với tỷ lệ cao dung môi hữu cơ khi bắt đầu và kết thúc với tỷ

lệ thấp dung môi hữu cơ

pH của pha động ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tách và thời gian lưu do thay đổi mức độ ion hoá của cả chất phân tích và lớp nước trên bề mặt pha tĩnh HILIC Dung môi thân nước hay được sử dụng là các đệm nhằm ổn định pH pha động Loại đệm được dùng

5

phổ biến là amoni acetat, amoni format, phosphat (ứng với vùng acid), đệm triethylamin, amoni (ứng với vùng base) …với nồng độ nhỏ (từ 5 mM đến 100 mM) [9] Với các chất phân tích có nhiều dạng ion hoá, như kháng sinh nhóm amino glycosid, cần thay đổi pH đệm để đảm bảo rằng chất phân tích chỉ tồn tại ở 1 dạng ion nhất định Với các chất phân cực trung tính thì không cần sử dụng đệm Trường hợp trao đổi ion ảnh hưởng đến thời gian lưu, có thể giảm thời gian lưu bằng cách tăng nồng độ đệm, tuy nhiên nồng độ đệm tăng có thể ảnh hưởng đến quá trình solvat hoá, hình dạng pic (ví dụ: pic kéo đuôi, kéo dài thời gian tái cân bằng pha tĩnh)

1.1.2 Ưu điểm

Sắc ký pha đảo được sử dụng phổ biến trong phân tích, đặc biệt đối với các chất trong ngành dược Tuy nhiên, với những dược chất phân cực mạnh, chúng không được lưu giữ hoặc lưu giữ không đủ lâu trong sắc ký pha đảo cổ điển, chúng thường được phân tích bằng sắc ký pha thuận (normal phase liquid chromatography – NPLC) hoặc sắc ký cặp ion

HILIC cũng được ứng dụng trong trường hợp phân tích các hợp chất phân cực này, do loại sắc ký này sử dụng cột pha tĩnh phân cực giống NPLC nhưng pha động phân cực lại giống RPLC Nhờ đặc điểm này, HILIC có nhiều lợi thế trong phân tách chất phân cực hơn NPLC hay RPLC

Thứ nhất, HILIC có nhiều ưu điểm trong phân tích các hợp chất rất phân cực so với kỹ thuật tách RPLC hay NPLC Khắc phục nhược điểm không lưu giữ các chất phân cực của RPLC, như đã trình bày ở mục cơ chế tách HILIC, chất phân tích được phân bố ở

cả lớp dung môi thân nước bao trên bề mặt pha tĩnh và pha động khan nước, từ đó tăng thời gian lưu của chất phân tích phân cực Đối với NPLC, tuy có thể lưu giữ các chất phân cực với thời gian lưu phù hợp, nhưng phương pháp này lại sử dụng dung môi pha động độc hại, không thân thiện với môi trường, hoà tan kém các chất thân nước Vì vậy NPLC không phải lựa chọn tối ưu trong trường hợp này Với sắc ký cặp ion, phương

Thứ ba, HILIC có khả năng áp dụng với sắc ký lỏng khối phổ LC-MS [19] nhờ pha động có chứa lượng lớn dung môi hữu cơ đồng tan với nước, thích hợp với LC-MS Đối với RPLC, pha động chứa tỷ lệ nước cao nên không phù hợp với bề mặt của LC-MS, ngược lại, pha động không phân cực của NPLC không những độc hại với môi trường mà rất khó hoà tan các dược chất phân cực, giảm tỷ lệ ion hoá của chất phân tích, có thể gây nhiễu nền hoặc tín hiệu kém [12] khi phân tích bằng LC-MS

1.2 Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu

Acid amin là đơn vị cấu tạo cơ bản của protein, đóng vai trò rất quan trọng trong

cơ thể sống Theo giá trị dinh dưỡng các acid amin được chia làm hai nhóm là nhóm acid amin không thay thế (nhóm acid amin thiết yếu) và nhóm acid amin có thể thay thế (acid amin không thiết yếu) trong đó có glycin và cystein [4]

Dưới đây là công thức cấu tạo chung của các acid amin thường gặp:

7

1.2.1 Glycin

Glycin (GLY) có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.2: Công thức cấu tạo glycin

Danh pháp: acid 2 - aminoacetic acid Tên khác: acid aminoethanoic

Công thức phân tử: C2H5NO2 Phân tử lượng 75,07 g/mol

Tính chất vật lý: Tinh thể glycin màu trắng hoặc gần trắng, vị ngọt, dễ tan trong nước; rất ít tan trong rượu

Tính chất hoá học: pKa: 2,37 (20oC) với pK1: 2,34 và pK2: 9,6; pI: 5,97 [4] Bảo quản: Dưới 40oC, không đông lạnh

Chỉ định: Glycin là một acid amin không thiết yếu, được sử dụng như một thực

phẩm bổ sung, tưới rửa bàng quang trong phẫu thuật tiết niệu, kháng acid dạ dày trong điều trị loét dạ dày [5] Gần đây, glycin được chứng minh có vai trò hạ aldosteron, giảm tác dụng không mong muốn khi điều trị dài ngày với glycyrrhizin [21], ứng dụng bổ sung trong các chế phẩm chứa glycyrrhizin

8

1.2.2 Cystein

Cystein (CYS) có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo cystein

Danh pháp: acid 2-amino-3-sulfanylpropanoic

Công thức phân tử: C3H7NO2S Phân tử lượng: 121,0 g/mol

Tính chất vật lý: Tinh thể màu trắng hoặc không màu, dễ tan trong nước, ít tan trong cồn

Tính chất hoá học: pK1: 2,35 và pK2: 9,05; pI: 5,14 [4]

Bảo quản: Tránh ánh sáng

Tác dụng: Cystein là một acid amin không thiết yếu, sử dụng như thực phẩm bổ

sung, có trong các chế phẩm sử dụng trong nhãn khoa; thuốc nhỏ mắt để ngăn loét giác mạc loét sau bỏng hóa chất Gần đây, cystein được chứng minh có vai trò hỗ trợ phản ứng thải độc ở gan, cải thiện tình trạng bệnh nhân [21], nên được ứng dụng bổ sung trong các chế phẩm bảo vệ gan như amipharghen

1.2.3 Amoni glycyrrhizat

Amoni glycyrrhizat (AG) có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo amoni glycyrrhyzat

9

Tên gọi: ammonium glycyrrhizat

Công thức phân tử: C42H65 NO16 [29] Phân tử lượng: 840,0 g/mol

Tính chất vật lí: Bột kết tinh màu trắng hoặc trắng vàng, hút ẩm Tan ít trong

nước, rất ít tan trong alcol, thực tế không tan trong aceton, hoà tan trong các dung dịch kiềm hoặc acid loãng

Tính chất hoá học: Có tính base yếu

Bảo quản: Tránh tiếp xúc với không khí

Tác dụng: Glycyrrhizic acid, muối amoni và muối kali của nó được sử dụng trong

các sản phẩm giảm cơn ho, virus, nhiễm trùng, các rối loạn tiêu hóa, gan và da Amoni glycyrrhizat là chất làm ngọt, điều hương vị, chất nhũ hóa và chất tạo gel trong thực phẩm và mỹ phẩm [29]

 Với những tác dụng trên, muối amoni glycyrrhizat được kết hợp với glycin và

cystein trong chế phẩm thuốc tiêm truyền tĩnh mạch amipharghen

- Chỉ định: Phục hồi chức năng gan bị bất thường do rối loạn chức năng gan mạn

tính

- Tác dụng phụ: Sốc, giảm kali huyết, và một số tác dụng phụ hiếm gặp: phát ban,

dị ứng

- Chống chỉ định: Bệnh nhân có tiền sử dị ứng với các thành phần của thuốc, bệnh

nhân bị chứng tăng aldosteron, bệnh về cơ, giảm kali huyết

- Bảo quản: Bảo quản ở 15oC đến 30oC, tránh ánh sáng

1.2.4 Một số phương pháp phân tích acid amin

Để phân tích acid amin, người ta sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như điện

di mao quản, sắc ký lỏng khối phổ, tuy nhiên, phương pháp được sử dụng phổ biến nhất

là sắc ký lỏng hiệu năng cao

Các acid amin thường hấp thụ UV-VIS rất kém do trong cấu trúc hầu như không

có nhóm mang màu nên trong các phương pháp phân tích, acid amin thường được tạo dẫn xuất trước hoặc sau cột phân tách để có thể phát hiện bằng detector UV-VIS hoặc

10

detector huỳnh quang [2] Kỹ thuật tạo dẫn xuất trước cột còn có thể cho nhiều dẫn xuất

khác nhau của cùng một acid amin, do đó gây trở ngại cho việc biện giải kết quả phân

tích So với kỹ thuật tạo dẫn xuất trước cột, kỹ thuật tạo dẫn xuất sau cột thường ít bị ảnh

hưởng hơn bởi các biến thiên trong việc thực hiện phép định lượng hơn

Các tác nhân tạo dẫn xuất hóa sau cột hay được sử dụng là ninhydrin và

o-phthalaldehyd Acid amin được tách ra khỏi nhau nhờ cột trao đổi cation sau đó được

cho phản ứng với ninhydrin tạo ra sản phẩm được nhận biết bằng detector UV-VIS hoặc

huỳnh quang Ngoài ra, acid amin có thể được phân tích bằng cách tạo dẫn xuất trước cột,

sau đó các sản phẩm này được tách bằng hệ thống sắc ký pha đảo với detector UV hoặc

huỳnh quang Các tác nhân hay được sử dụng là phenylisothiocyanate (PITC) và

(dimethylamino)azobenzenesulfonyl clorid (DABS-Cl);

6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamat (AQC); o-phthalaldehyd (OPA); 9-fluorenylmethyl

cloroformat (FMOC-Cl); tạo sản phẩm được phát hiện bằng detector UV – VIS hoặc

huỳnh quang [3] Dưới đây là một số phương pháp nghiên cứu phân tích các acid amin và

acid glycyrrhizin

Bảng 1: Một số phương pháp phân tích acid amin và acid glycyrrhizin

STT Tác giả Nền mẫu Đối tượng Kỹ thuật

1 Jia.S, Kang

YP [20]

Thực phẩm lên men

23 acid amin LC kết hợp LC-Q-TOFMS

RPLC: tạo dẫn xuất trước cột bằng phenylisothiocyanat Cột C18

Pha động: amoni acetat và acetonitril

Pha tĩnh: cột Spherisorb ODS

glycyrrhetinic

Điện di mao quản Đệm: acetontril và natri dihydro phosphat nồng độ 0,02M điều chỉnh pH 7,5

HPLC Cột C18Pha động: acid phosphoric và acetonitril

Sắc ký cặp ion trên cột pha đảo Cột C18

12

Như vậy, ngoài ưu điểm phân tích tốt các hợp chất phân cực như acid amin [7], HILIC có khả năng áp dụng phân tích các chất có phân tử lượng lớn và kém phân cực như acid glycyrrhizin và muối của nó [31] Do đó, HILIC là lựa chọn thay thế phù hợp khi phân tích đồng thời glycin, cystein và amoni glycyrrhizat Ngoài ra, sự kết hợp amoni glycyrrhizat và hai acid amin glycin và cystein trong một chế phẩm thuốc điều trị các bệnh về gan còn mới, hiện tại, chưa có nghiên cứu về việc phân tích đồng thời ba chất này trong một chế phẩm được công bố Vì vậy, tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này nhằm đưa ra một giải pháp mới cho việc phân tích đồng thời ba chất glycin, cystein và amoni glycyrrhizat

13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là thuốc tiêm truyền tĩnh mạch Amiphargen Mỗi ống tiêm 20 ml chứa:

Amoni glycyrrhizat (Glycyrrhizin) 53 mg (40 mg)

12681 – 11, số lô sản xuất: 3AA0230, 3AA0890

Chuẩn nguyên liệu glycin: Hàm lượng 98,7%, nhà sản xuất Kyowa hakko Bio -

Fujie Pharmaceutical Co.,LTD

Tá dược natri sulfit: Nhà sản xuất Fisher

-14

2.2.2 Chuẩn bị các dung dịch

- Dung dịch tá dược: Cân 0,05 g natri sulfit vào bình định mức 50,00 ml, nước cất vừa đủ thu được dung dịch natri sulfit nồng độ 0,001 g/ml Hút 0,5 ml monoethanol amin, hoà tan trong chuẩn natri sulfit và định mức trong bình định mức 10,00 ml, thu được dung dịch monoethanol amin nồng độ 5% (v/v)

- Dung dịch chuẩn đơn: Cân các chuẩn glycin, cystein và amoni glycyrrhizat theo

khối lượng tương ứng trong bảng 2.1 Chuẩn đơn được hoà tan, định mức bằng dung dịch

natri sulfit 0,001 g/ml

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp pha loãng 10 lần: từ dung dịch chuẩn gốc, hút chính xác

1 ml các chuẩn gốc đơn từng chất, 1 ml dung dịch monoethanol amin; pha loãng bằng nước và định mức trong bình định mức 10,00 ml, bọc tối

Bảng 2.1: Quy trình pha dung dịch chuẩn

- Bảo quản điều kiện thường, bọc tối

- Mẫu placebo: là mẫu chứa 1,00 ml dung dịch monoethanol amin 5% (v/v), 1,00 ml natri sulfit 0,001 g/ml pha loãng bằng nước và định mức trong bình định mức 10 ml Lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Dung dịch mẫu thử: Hút 1,00 ml dung dịch amipharghen vào bình 10,00 ml, định mức vừa đủ bằng nước Bọc tối

- Các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi chạy sắc ký

15

2.2.3 Chuẩn bị đệm

Các dung dịch đệm phosphat được pha từ kali dihydro phosphat với khối lượng tương ứng như bảng 2.2, điều chỉnh pH bằng acid phosphoric nồng độ tương ứng với nồng độ kali dihydro phosphat để đạt pH khảo sát

Bảng 2.2: Quy trình pha đệm phosphat Nồng độ

Hệ thống máy HPLC Agilent 1100 series và phần mềm Chemstation

Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H

Máy lắc Labinco L46 (Mỹ)

Phễu lọc Bunchner, màng lọc cellulose 0,45 m

Lọc mẫu màng lọc Satorius PTFE 0,45 m

Cân phân tích Sartorius TE214S (Đức)

Máy đo pH Mettler toledo FE20/El20

Pipet chính xác 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml, 2 ml, 3 ml; micro pipet 10 – 100 µl (Đức) Bình định mức 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml

Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, ống đong

16

2.3 Nội dung nghiên cứu

Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời glycin, cystein và amoni glycyrrhizat

trong chế phẩm thuốc tiêm bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) không tạo dẫn

xuất

Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, khoảng

nồng độ tuyến tính, độ lặp lại, độ thu hồi theo hướng dẫn của ICH Q2B

Ứng dụng phương pháp trên phân tích ba thành phần glycin, amoni glycyrrhizat,

cystein trong chế phẩm thuốc tiêm trên thị trường

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu

Dựa trên các nghiên cứu đã được công bố trên thế giới về phân tích acid amin,

amoni glycyrrhyzat sử dụng HILIC, kết hợp với điều kiện trang thiết bị của phòng thí

nghiệm, tôi cố định hai thông số sắc ký là thể tích tiêm mẫu là 5 µl, pha động gồm hai

thành phần acetonitril và đệm phosphat Tiến hành nghiên cứu một số thông số trong quá

trình chạy sắc ký

a Khảo sát điều kiện pha mẫu

Tiến hành chạy sắc ký, khảo sát sự thay đổi độ ổn định, hình dáng của pic sắc ký

b Khảo sát pha động

Từ nguyên tắc quá trình phân tách các chất của HILIC, có thể nhận thấy, kết quả

quá trình phân tách chịu ảnh hưởng rất lớn bởi việc lựa chọn điều kiện pha động Dựa

trên bài các bài báo tham khảo, tôi tiến hành khảo sát các điều kiện pha động như sau:

17

Bảng 2.3: Các yếu tố pha động khảo sát

Nồng độ 3 mM Nồng độ 5 mM

c Khảo sát cột sắc ký và nhiệt độ cột

Cột sắc ký: Cột silica có thể sử dụng làm pha tĩnh HILIC, loại cột này có giá thành rẻ, sẵn có, vì vậy, tôi lựa chọn cột hai cột silica có độ dài khác nhau, cùng kích thước hạt nhồi cột 5 µm để tiến hành khảo sát: cột Agilent Zorbax silica kích thước 4,6 x 250 mm

và cột Apollo silica kích thước 4,6 x 150 mm

Nhiệt độ cột: Dựa trên cơ chế tách của HILIC, nhiệt độ trong quá trình phân tích là một yếu tố ảnh hướng tới thời gian lưu và tính chọn lọc với một số chất phân tích, vì vậy cần cố định nhiệt độ cột trong quá trình phân tích Do dung dịch chuẩn cần bảo quản dưới

30oC nên tôi tiến hành khảo sát và so sánh sự thay đổi thời gian lưu của chất phân tích ở hai mức nhiệt độ: 26oC, 30oC

18

a Độ phù hợp hệ thống

Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của các lần sắc ký

Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,0% [2]

b Độ chọn lọc

Chuẩn bị các mẫu sau:

1 Mẫu trắng: chứa natri sulfit và monoethanolamin

3 Mẫu chuẩn đơn thành phần glycin, cystein, amoni glycyrrhizat pha loãng 10 lần bằng nước cất (hút 1,00 ml mỗi chuẩn đơn, định mức vừa đủ 10,00 ml bằng nước)

1 Mẫu chuẩn hỗn hợp gồm ba thành phần glycin, cystein, amoni glycyrrhizat

1 Mẫu chế phẩm thuốc tiêm amiphargen được pha loãng 10 lần (hút 1,00 ml mẫu thử, định mức vừa đủ 10,00 ml bằng nước)

Tiến hành: Chạy sắc ký 5 mẫu trên, mỗi mẫu 2 lần, so sánh các pic trên sắc ký đồ thu được

Yêu cầu: Thời gian lưu ba chất chuẩn ở các mẫu, được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,0%

19

d Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn

- Cách xác định: Tiến hành 6 phép thử song song trên 6 mẫu thử riêng biệt ở nồng

độ thử 100% Đánh giá sự phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD (%)

- Yêu cầu: Chênh lệch kết quả giữa các lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của glycin, cystein và amoni glycyrrhizat phải không lớn hơn 2,7% (ở mức nồng độ 1%) [8]

e Độ thu hồi

- Xác định độ thu hồi của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu placebo Lượng chuẩn thêm vào ở 3 mức nồng độ: nồng độ 80%, 100%, 120% so với nồng độ chuẩn hỗn hợp ban đầu Tại mỗi mức nồng độ, phân tích lặp lại 3 lần Tính tỷ lệ thu hồi của các chất glycin, cystein và amoni glycyrrhizat thêm vào mẫu placebo

- Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi đạt 97% - 103% tại 3 mức nồng độ [8]

2.3.3 Áp dụng phương pháp chạy mẫu thị trường

Áp dụng phương pháp trên tiến hành phân tích đồng thời ba chất glycin, cystein và amoni glycyrrhizat trong chế phẩm thuốc Hiện tại, trên thị trường có chế phẩm thuốc tiêm truyền tĩnh mạch amipharghen có chứa 3 chất trên, thuốc tiêm này được lựa chọn vào nghiên cứu để phân tích

2.4 Xử lý kết quả

Kết quả được xử lý bằng phần mềm Chemstation và tính toán bằng Microsoft excel 2010

lệ pha động khác nhau:

Bảng 3.1: Thời gian lưu của chất phân tích ở các tỷ lệ pha động khác nhau

Tỷ lệ ACN : đệm phosphat t R AG (phút) t R CYS (phút) t R GLY (phút)

Nhận xét:

- Tỷ lệ ACN : đệm phosphat 72% : 28% sử dụng ít dung môi hữu cơ, thời gian lưu

AG, CYS, GLY đều giảm so với tỷ lệ 75% : 25%, và tR AG = 1,815 phút Khi đó, thời gian AG tương tác với pha tĩnh quá ngắn, khó lặp lại sau mỗi lần tiêm

- Tỷ lệ ACN : đệm phosphat 75% : 25% sử dụng dung môi hữu cơ trung bình, kéo dài thời gian lưu của AG hơn

Như vậy, tôi lựa chọn tỷ lệ ACN : đệm phosphat 75% : 25% và khảo sát thêm các yếu tố khác có thể cải thiện thời gian lưu của AG

Bàn luận: Trong pha động sắc ký HILIC, nước có lực rửa giải mạnh các chất phân

cực, giảm thời gian lưu của chúng, vì vậy khi tăng lượng nhỏ tỷ lệ nước trong pha động (3%), thời gian lưu của các chất phân cực như acid amin thay đổi đáng kể

3.1.2 Khảo sát điều kiện pha mẫu

- Pha chuẩn hỗn hợp: Hút 1,00 ml dung dịch placebo, chuẩn đơn AG, chuẩn đơn CYS, chuẩn đơn GLY vào bình một định mức 10,00 ml, định mức bằng: đệm, pha động (tỷ lệ ACN : đệm phosphat 75% : 25%) , nước

21

- Pha chuẩn đơn: chuẩn đơn AG, CYS, GLY, mẫu placebo được pha loãng 10 lần trong bình định mức 10,00 ml bằng: đệm, pha động, nước (tương tự chuẩn hỗn hợp)

- Bọc kín và tiến hành chạy sắc ký trên cùng một điều kiện

Dưới đây là sắc ký đồ tại bước sóng 254 nm mẫu chuẩn hỗn hợp và chuẩn đơn CYS pha loãng trong các dung môi khác nhau:

Hình 3.1: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp tại bước sóng 254 nm

Pha trong đệm phosphat

Pha trong pha động

Pha trong nước Pic tạp

Pic tạp

pha không có pic tạp này

Pha trong đệm phosphat

Pha trong pha động

Pha trong nước

Pic tạp Pic tạp