Xây dựng phương pháp định lượng imipenem và meropenem trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Xuất phát từ yêu cầu thực tế lâm sàng cần xác định nồng độ imipenem và meropenem trong huyết tương để xây dựng mô hình dược động học của thuốc tương ứng với cá thể bệnh nhân, chúng tôi c

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian hoàn thành khóa luận, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới

cô Vũ Ngân Bình – người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi từng thao tác trong quá trình thực hiện đề tài Tôi xin cảm ơn học viên cao học Nông Thị Thanh Phương, Nguyễn Thị Thu Thủy đã tạo điều kiện cho tôi được tiếp cận mẫu huyết tương bệnh thực tế Hơn nữa, tôi xin cảm ơn thầy Lê Đình Chi, cô Phạm Thị Thanh Hà, thầy Ngô Minh Thúy cùng toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa phân tích – Độc chất trường đại học Dược Hà Nội, các cán bộ Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã luôn nhiệt tình giải đáp, giúp đỡ tôi trong quá trình làm nghiên cứu

Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô, ban giám hiệu trường đại học Dược Hà Nội đã tận tâm giảng dạy, tạo điều kiện học tập tốt nhất cho tôi trong năm năm học vừa qua

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh động viên tinh thần để tôi có thể hoàn thành khóa lụận

Do sự thiếu sót về kinh nghiệm và thời gian thực hiện nên đề tài không tránh khỏi nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô và bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội ngày 25 tháng 4 năm 2017

Sinh viên Nguyễn Thị Hương

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ……… …1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……… 3

1.1 Tổng quan về nhóm kháng sinh carbapenem 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Dược động học 3

1.1.3 Phổ tác dụng 4

1.1.4 Tính chất lý hóa 4

1.1.5 Liên quan giữa các thông số PK/PD đến hoạt tính diệt khuẩn của kháng sinh nhóm carbapenem 6

1.1.6 Một số phương pháp phân tích đã được nghiên cứu để định lượng imipenem và meropenem trong huyết tương 7

1.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 10

1.2.1 Nguyên tắc 10

1.2.2 Các phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 10

1.2.3 Tổng quan về phân tích thuốc trong dịch sinh học 11

CHƯƠNG 2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… ……… …… 13

2.1 Hóa chất, thiết bị 13

2.1.1 Hóa chất 13

2.1.2 Thiết bị 13

2.2 Nội dung, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 14

2.2.2 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

3.1 Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng imipenem và

meropenem trong huyết tương 18

3.1.1 Quy trình xử lý mẫu 19

3.1.2 Lựa chọn cột sắc ký 23

3.1.3 Lựa chọn thành phần pha động 23

3.1.4 Lựa chọn chế độ gradient pha động 23

3.1.5 Lựa chọn tốc độ dòng 25

3.1.6 Lựa chọn bước sóng 26

3.1.7 Điều kiện sắc ký xây dựng được 27

3.2 Thẩm định phương pháp 27

3.2.1 Chuẩn bị dung dịch chạy sắc ký 27

3.2.2 Thẩm định phương pháp 29

3.3 Ứng dụng phương pháp HPLC đã xây dựng để định lượng imipenem và meropenem trong huyết tương bệnh nhân 47

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……… 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các thông số dược động học của imipenem và meropenem 3

Bảng 1.2 Tóm tắt các nghiên cứu đã thực hiện định lượng nồng độ carbapenem trong máu 9

Bảng 3.1 Pha các dung dịch chuẩn 28

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống của phương pháp 29

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính tuyến tính của imipenmem 33

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tính tuyến tính của meropenem 34

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát LLOQ của Imipenem và Meropenem 36

Bảng 3.6 Kết quả độ đúng, độ chính xác trong ngày của imipenem và meropenem 38

Bảng 3.7 Tóm tắt khoảng dao động độ đúng, độ chính xác trong ngày của hai kháng sinh 39

Bảng 3.8 Kết quả độ đúng, độ chính xác khác ngày 40

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ ổn định của hai carbapenem sau ba chu kỳ đông rã 41

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ ổn định trong ngày của hai carbapenem 42

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ ổn định dài ngày của hai carbapenem 43

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi của imipenem và meropenem 46

Bảng 3.13 Kết quả định lượng một số mẫu máu của bệnh nhân dùng imipenem 47

Bảng 3.14 Kết quả định lượng mẫu máu bệnh nhân dùng meropenem 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của imipenem 4

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của meropenem 5

Hình 3.1 Quy trình xử lý mẫu carbapenem trong huyết tương trắng 20

Hình 3.2 Tóm tắt quy trình xử lý mẫu carbapenem trong huyết tương bệnh 22

Hình 3.3 Sắc ký đồ chế độ gradient (1) 24

Hình 3.4 Sắc ký đồ chế độ gradient (2) 24

Hình 3.5 Sắc ký đồ chế độ gradient (3) 25

Hình 3.6 Phổ UV của imipenem 26

Hình 3.7 Phổ UV của meropenem 26

Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng 31

Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng thêm imipenem (a) meropenem (b) 31

Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng thêm imipenem và meropenem 32

Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu chuẩn cilastatin pha trong dung dịch MOPS 32

Hình 3.12 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa tỉ số diện tích pic imipenem/meropenem và nồng độ imipenem 33

Hình 3.13 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa tỉ số diện tích pic meropenem/imipenem và nồng độ meropenem 34

Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu huyết tương bệnh dùng imipenem 48

Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu huyết tương bệnh dùng meropenem 49

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Chữ cái viết tắt Nghĩa tiếng anh Nghĩa tiếng việt

DHP – 1 Dehydropeptidase – 1

ES External Standard Chuẩn ngoại

IS Internal Standard Chuẩn nội

HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HQC High Quality Control Mẫu chuẩn nồng độ cao LQC Low Quality Control Mẫu chuẩn nồng độ thấp

LLOQ Lower Limit of Quantification Giới hạn định lượng dưới MIC Minimum Inhibitory

QC Quality Control Mẫu chuẩn

RSD (%) Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

T/MIC Time above MIC Thời gian nồng độ thuốc lớn

hơn nồng độ ức chế tối thiểu UPLC Ultra Performance Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kháng sinh là nhóm thuốc quan trọng hàng đầu hiện nay, đặc biệt ở một nước nhiệt đới với các loại nhiễm khuẩn đa dạng và nguy hiểm như Việt Nam Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý đã dẫn đến hệ lụy là xuất hiện một loạt các chủng vi khuẩn kháng thuốc và nhiều loại kháng sinh đã không còn được sử dụng vì bị đề kháng quá nhiều Nhiều nhóm kháng sinh quý như aminoglycosid, cephalosporin… đang bị đề kháng với tỷ lệ đáng báo động [6] Các kháng sinh được xem như phòng tuyến cuối cùng của con người với vi khuẩn như colistin, carbapenem cũng đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc [7,9] Hiện nay, carbapenem, hay được sử dụng nhất là imipenem và meropenem, được xem là lựa chọn cuối cùng để điều trị các chủng vi khuẩn đa kháng và là lựa chọn hàng đầu trong điều trị kinh nghiệm tại khoa điều trị tích cực (ICU) Để tránh hiện tượng đề kháng carbapenem, cần sử dụng phác đồ kháng sinh hợp lý để tối ưu hóa tác dụng của thuốc và giảm sự đề kháng của

vi khuẩn Carbapenem là một nhóm kháng sinh phụ thuộc thời gian, tức là hiệu lực tác dụng của kháng sinh phụ thuộc khoảng thời gian nồng độ thuốc trong máu cao hơn nồng độ ức chế tối thiểu (T/MIC) [8] Mô hình dược động học của thuốc với từng

cá thể bệnh nhân, đặc biệt là các bệnh nhân nặng như bệnh nhân suy thận, bệnh nhân bỏng nặng…có sự dao động rất lớn so với quần thể thông thường [18] Vì vậy, việc giám sát nồng độ thuốc trong máu trên những bệnh nhân sử dụng carbapenem đặc biệt là nhóm bệnh nhân có thay đổi nhiều về các thông dược động học đóng vai trò quan trọng đối với sự thành công của chiến lược điều trị bằng kháng sinh Hiện nay,

ở Việt Nam đã có phương pháp định lượng imipenem, meropenem và ertapenem bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể áp dụng trong phân tích thường quy [10] Tuy nhiên, phương pháp còn một số điểm có thể cải thiện để thuận lợi cho quá trình phân tích như thời gian phân tích mẫu tương đối dài Xuất phát từ yêu cầu thực tế lâm sàng cần xác định nồng độ imipenem và meropenem trong huyết tương để xây dựng mô hình dược động học của thuốc tương ứng với cá thể bệnh nhân, chúng tôi cải tiến phương pháp trên để rút ngắn thời gian phân tích Đề tài “Xây dựng phương định lượng

imipenem và meropenem trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện với hai mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng imipenem và meropenem trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng

2 Ứng dụng phương pháp trên định lượng nồng độ imipenem và meropenem trong huyết tương bệnh nhân sử dụng các kháng sinh này

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nhóm kháng sinh carbapenem

1.1.1 Nguồn gốc

Carbapenem là dẫn xuất tự nhiên của thienamycin Thienamycin được lấy từ

Streptomyces catteifa nhưng không bền nên không được dùng trong điều trị

Imipenem là dẫn xuất N – formidoyl và meropenem là dẫn xuất demethylcarbamoyl pyrolidinyl của thienamycin bền vững hơn [1]

1.1.2 Dược động học

Carbapenem không hấp thu qua đường tiêu hóa, chỉ dùng đường tiêm tĩnh mạch Thuốc khuyếch tán tốt vào các mô và dịch cơ thể Thuốc được thải trừ chủ yếu qua nước tiểu

Imipenem bị thủy phân bởi enzym dehydropeptidase – 1 (DHP – 1) do thận tiết ra

do đó luôn được phối hợp với một chất ức chế DHP – 1 là cilastatin để kéo dài thời gian bán thải và ức chế tạo chất chuyển hóa gây độc cho thận Meropenem bền với dipeptidase hơn nên không cần phối hợp với thuốc ức chế men DHP – 1 [1]

Các thông số dược động học của imipenem và meropenem được trình bày trong

Cmax (µg/mL)

AUC (mg.h/L)

t1/2

(h)

Vd (L/kg)

% liên kết protein huyết tương

% thải trừ nguyên vẹn

Imipenem 0,25 30 – 35 42,2 1 0,23 –

0,31 20 60 – 70* 0,5 60 - 70 186

Với đường truyền tĩnh mạch:

Imipenem: truyền tĩnh mạch 500 mg imipenem trong 30 phút cho người trẻ và người trung niên, đạt đỉnh nồng độ huyết thanh 30 - 40 mg/lít Nồng độ này đủ để điều trị phần lớn những nhiễm khuẩn [2]

Meropenme: truyền tĩnh mạch chậm liều 500, 1000 mg trong 30 phút cho Cmax trung bình khoảng 23 và 49 µg/mL với giá trị AUC tương ứng là 39,3 và 63,2 μg.h/mL [27]

1.1.3 Phổ tác dụng

Carbapenem là nhóm kháng sinh diệt khuẩn có phổ kháng khuẩn rộng nhất hiện nay Chúng có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn Gram âm và dương, vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí, các vi khuẩn tiết ra β lactamase kể cả chủng kháng methicillin

[1] Imipenem và meropenem có hoạt tính tốt trên Pseudomonas aeruginosa, không

có tác dụng trên Staphylococcus aureus kháng methicillin và Enterococcus faecium

[21]

Imipenem và meropenem được sử dụng điều trị nhiễm khuẩn nặng bao gồm nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi mắc phải tại bệnh viện, nhiễm khuẩn đường ruột, nhiễm khuẩn da và mô mềm, nhiễm khuẩn tiết niệu có biến chứng [21]

1.1.4 Tính chất lý hóa

1.1.4.1 Tính chất lý hóa của imipenem [17]

 Công thức cấu tạo của imipenem như hình 1.1

 Danh pháp: hydroxyethyl]-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid

(5R,6S)-3-[2-(aminomethylideneamino)ethylsulfanyl]-6-[(1R)-1- Công thức phân tử: C12H17N3O4S

 PTL: 299,35

 pKa1 = 3,2; pKa2 = 9,9

 Dạng dược dụng: imipenem monohydrat

 Tính chất vật lý: bột tinh thể màu trắng hoặc gần như trắng đến ánh vàng, hơi tan trong nước, ít tan trong methanol

 Biệt dược gốc: TIENAM® (Merck)

1.1.4.2 Tính chất lý hóa của meropenem [17]

 Công thức cấu tạo của meropenem như hình 1.2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của meropenem

 Danh pháp: (4R,5S,6S)-3-[(3S,5S)-5-(dimethylcarbamoyl)pyrrolidin-

3yl]sulfanyl-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]-4-methyl-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid

 Độ tan: hơi tan trong nước, thực tế không tan trong ethanol 95% và diethyl ete

 Dạng bào chế, hàm lượng: bột pha tiêm tĩnh mạch 500 mg, 1000 mg

 Độ ổn định: Độ ổn định của chế phẩm pha tiêm trong nước được chứng minh lên đến 3 giờ ở 25oC và 12 giờ ở điều kiện bảo quản lạnh (2 – 8oC) [27]

 Biệt dược gốc: MERONEM® (AstraZeneca)

Imipenem và meropenem thuộc nhóm kháng sinh β-lactam, không ổn định về mặt vật lý và hóa học Trong cấu trúc imipenem và meropenem có vòng β-lactam dễ

bị mở vòng bởi nhiều tác nhân ái nhân, tác nhân acid – base, ion kim loại, tác nhân oxy hóa và thậm chí là dung môi như nước, alcol [15] Độ ổn định ở nhiệt độ phòng (khoảng thời gian sự phân hủy dưới 10%) với imipenem là khoảng từ 4 đến 10 giờ (tùy thuộc loại dịch truyền) và 9 giờ đối với meropenem [18] Do vậy các dung dịch chuẩn và mẫu huyết tương trong các nghiên cứu thường được pha trong các dung dịch bảo quản như 3–morpholinopropanesulfonic (MOPS) hoặc acid

2–[N–morpholino]ethansulfonic (MES) để đảm bảo độ ổn định của mẫu [0,10, 14,16,24]

1.1.5 Liên quan giữa các thông số PK/PD đến hoạt tính diệt khuẩn của kháng sinh

nhóm carbapenem

Carbapenem là kháng sinh thuộc nhóm β-lactam, nhóm kháng sinh này tác dụng theo cơ chế ức chế tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn và gắn với protein gắn penicillin β-lactam đạt hiệu quả cao nhất khi nồng độ thuốc đạt trên 4 lần nồng độ

thời gian nồng độ thuốc trong máu trên MIC đạt từ 40% trở lên so với khoảng đưa liều được xem là đạt hiệu quả điều trị Với các kháng sinh phân nhóm carbapenem, giá trị khoảng thời gian này có thể thấp hơn Đối với vi khuẩn Gram âm, khoảng thời gian nồng độ thuốc trong máu trên MIC đạt 20% được báo cáo là có tác dụng kìm khuẩn, đạt 40% được báo cáo là có tác dụng diệt khuẩn [8]

Để giá trị T/MIC đạt hiệu quả, có thể tăng liều, giảm khoảng cách đưa thuốc hoặc truyền liên tục [8] Nghiên cứu cho thấy truyền tĩnh mạch liên tục cả imipenem

và meropenem ở mức liều 1 g/24 giờ cho tác dụng vượt trội hơn đưa thuốc ngắt quãng

3 g/24 giờ trong điều trị nhiễm khuẩn P aeruginosa [18] Ứng dụng các thông số

PK/PD có thể giảm liều dùng của thuốc mà vẫn đạt hiệu quả điều trị mong muốn, giúp giảm chi phí điều trị, giảm đề kháng. Do đó, nhiều nghiên cứu về mô hình dược động học cá thể được tiến hành với hai kháng sinh imipenem và meropenem để giám sát điều trị, chỉnh liều hai kháng sinh này phù hợp với đáp ứng lâm sàng, tối ưu hóa chiến lược điều trị bằng kháng sinh và giảm đề kháng thuốc

1.1.6 Một số phương pháp phân tích đã được nghiên cứu để định lượng imipenem

và meropenem trong huyết tương

Các phương pháp phân tích imipenem và meropenem trong huyết tương thường

sử dụng sắc ký lỏng pha đảo kết hợp detector khối phổ hoặc detector tử ngoại – khả kiến Ngoài ra sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) cũng được sử dụng Với meropenem, các nghiên cứu sử dụng cột C18, C8, PFP (pentafluorophenyl propyl)[10, 11, 15, 16, 20, 24].Thông thường, pha tĩnh C18 lưu giữ chất phân tích tốt hơn pha tĩnh C18, tuy nhiên với imipenem là một chất phân cực và pha động sử dụng ít dung môi hữu cơ, các nghiên cứu thường sử dụng cột C8, cột HILIC [10, 14, 16] để pha tĩnh có khả năng lưu giữ chất phân tích tốt hơn Các phương pháp sử dụng detector khố phổ cho kết quả có LOD và LOQ thấp hơn so với detector UV nhưng phương pháp này có giá thành cao và chi phí vận hành lớn

Hầu hết các phương pháp định lượng trong huyết tương đều dùng chuẩn nội, chất chuẩn nội được sử dụng trong các nghiên cứu thường là các kháng sinh cùng nhóm với chất phân tích [10, 11, 14, 16, 20] để đảm bảo các chất chuẩn và chuẩn nội

có cấu trúc gần giống nhau và hạn chế ảnh hưởng của chất chuẩn nội tới kết quả phân tích do các kháng sinh cùng nhóm không được sử dụng đồng thời trên lâm sàng

Một số phương pháp định lượng carbapenem trong dịch sinh học được trình bày ở bảng 1.3

Bảng 1.2 Tóm tắt các nghiên cứu đã thực hiện định lượng nồng độ carbapenem trong máu

Tác giả Đối tượng Pha tĩnh Pha động Chuẩn nội Detector LOD

LOQ Lương Quốc

Huy (2007) [5] Imipenem Cột C18

Acid boric 0,2 M và methanol

Không dùng chuẩn nội UV ở 298 nm LOD: 0,02 ppm Kato R et al

(2016) [14]

Biapenem, panipenem, imipenem, doripenem và meropenem

Amino HILIC (50×3 mm, 3 µm)

Amoni acetat 10 mM (pH 6,8) và acetonitrile Piperacillin Detector khối phổ

(MS)

LOD: 1,25 ppm; 2,5 – 5 ppm

Không dùng chuẩn nội

UV λ = 210 nm,

230 nm và 298 nm ứng với từng loại kháng sinh

LOD: dưới 1 – 2 ppm LOQ: 2 – 5 ppm

Trần Mạnh

Thông [9]

Imipenem, meropenem và ertapenem

Cột C8

Đệm phosphat 0,1 M

pH 7,4 và methanol 40% trong nước

E Daillya

(2011) [11]

Imipenem, doripenem, ertapenem và meropenem

Cột PentaFluoro Phenyl

LOQ: 0,1 ppm Rigo.R et al

ppm

1.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.2.1 Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích

di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh với tốc độ khác nhau liên quan đến ái lực

tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động [3]

Có nhiều kỹ thuật sắc ký lỏng, trong đó hiện nay sử dụng phổ biến nhất kỹ thuật sắc ký phân bố pha liên kết Sắc ký phân bố pha liên kết sử dụng pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn (hay gặp nhất là silica) Nhóm silanol trên bề mặt hạt silica phản ứng với clorosilan tạo ra dẫn chất có độ phân cực khác nhau Phụ thuộc vào độ phân cực tương đối của pha động và pha tĩnh, người ta phân ra hai loại : sắc

ký pha thuận và sắc ký pha đảo Sắc ký pha đảo là loại hình hay được sử dụng trong phân tích thuốc Kỹ thuật này sử dụng pha tĩnh kém phân cực hơn so với pha động Pha tĩnh hay dùng là dẫn chất C18, C8, phenyl (C6H5) và pha động là các dung môi phân cực như nước, đệm, methanol, acetonitril… Ưu điểm của sắc ký lỏng pha đảo

là sử dụng dung môi thân nước, ít độc hại [3] Tuy nhiên sắc ký lỏng pha đảo không lưu giữ hoặc kém lưu giữ các chất phân cực Phần lớn các nghiên cứu phân tích carbapenem trong huyết tương đều sử dụng sắc ký lỏng pha đảo [9, 15, 16, 20, 25] Carbapenem, đặc biệt là imipenem là những chất tương đối phân cực, sẽ ít bị lưu giữ khi sử dụng cột kém phân cực C18, do đó thường sử dụng pha tĩnh phân cực hơn là cột C8

1.2.2 Các phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: Nồng

độ chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích của pic trên sắc ký đồ Có bốn phương pháp hay được sử dụng trong sắc ký: phương pháp ngoại chuẩn, nội chuẩn, thêm chuẩn và chuẩn hóa diện tích Trong đó phương pháp chuẩn nội thường được

sử dụng trong phân tích thuốc trong dịch sinh học do hạn chế được sai số trong quá trình xử lý mẫu

Phương pháp nội chuẩn được tiến hành như sau: Thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Chất thêm vào được gọi là chuẩn nội

Phương pháp định lượng sử dụng chất chuẩn nôi dựa sự tương quan giữa giữa

tỉ số diện tích (hoặc chiều cao) của chuẩn trên chuẩn nội (SS/SIS) với nồng độ chuẩn ngoại (CS) hoặc tỉ số nồng độ chuẩn ngoại trên chuẩn nội (CS/CIS) Từ diện tích pic chuẩn, chuẩn nội và chất phân tích trong mẫu thử, có thể xác định hàm lượng của thành phần cần định lượng trong mẫu thử [4]

Yêu cầu đối với chất chuẩn nội:

 Trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử

 Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử

 Có nồng độ xấp xỉ nồng độ của chất thử

 Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử

 Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm [4]

1.2.3 Tổng quan về phân tích thuốc trong dịch sinh học

Dịch sinh học thường có nền mẫu rất phức tạp và các chất phân tích thường tồn tại ở nồng độ rất thấp Các bước của quá trình phân tích trong dịch sinh học gồm: lấy mẫu, chuẩn bị mẫu, tách, phát hiện, định tính và định lượng

Chuẩn bị mẫu là giai đoạn rất quan trọng nhằm loại bỏ các thành phần tạp không mong muốn và làm giàu mẫu Nếu protein trong huyết tương được tiêm vào cột sắc

ký thì nó có thể bị tủa bởi pha động gây tắc đường dẫn, tăng áp suất hệ thống Phương pháp phổ biến để loại protein là kết tủa protein bằng acid hoặc dung môi hữu cơ tan trong nước, trong đó acetonitril hay được sử dụng nhất Ngoài ra, các phương pháp chiết lỏng lỏng hoặc chiết pha rắn (SPE) cũng được dùng để làm sạch mẫu, làm giàu chất phân tích

Các chất trong dịch sinh học có thể được tách bằng HPLC, UPLC, sắc ký khí (GC)… trong đó HPLC và UPLC hay được sử dụng để phát hiện và giám sát nồng độ thuốc trong máu

Detector khối phổ được sử dụng nhiều nhất trong phát hiện các chất trong dịch sinh học, tuy nhiên, nó có giá thành cao và chi phí vận hành lớn Một số detector khác

có thể dùng như UV, huỳnh quang hay detector diện hóa

Để định lượng các chất trong huyết tương, có thể sử dụng phương pháp ngoại chuẩn hoặc nội chuẩn trong đó nội chuẩn được ưu tiên hơn vì cho kết quả tin cậy hơn Chất chuẩn nội nên được thêm vào ngay khi bắt đầu xử lý mẫu, trước khi thêm tác nhân tủa protein huyết tương Khi dung dịch chuẩn và dung dịch thử được xử lý theo cùng một quy trình, tỉ lệ giữa nồng chất phân tích và chất chuẩn nội luôn là hằng số [19]

CHƯƠNG 2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất, thiết bị

2.1.1 Hóa chất

 TIENAM® (Merck) 500 mg imipenem/500 mg cilastatin: mỗi lọ có chứa 530,1

mg imipenem monohydrate và 530,8 mg cilastatin natri

 MERREM® (AstraZeneca) 1g meropenem: mỗi lọ có 1141,0 mg meropenem trihydrat và 207,9 mg natri carbonat

 Huyết tương trắng (Viện Huyết học và truyền máu trung ương)

 Kali dihydrophosphat (Merck)

 Dikali hydrophosphat (Merck)

 Natri hydroxyd (Merck)

 3 – morpholinopropansulfonic (MOPS) (Sigma – Aldrich)

 Máy li tâm Kubota 6500

 Cân phân tích Sartorius

 Tủ lạnh âm sâu -80oC Model panasonic MDF-594-PB

 Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H

 Máy lắc xoáy Labinco L46

 Máy đo pH Mettler Toledo

 Micropipet 10 – 100 µL ABMATE pro, 100 - 1000 µL Nichipet EX

 Ống ly tâm Eppendorf 1,5 mL

 Máy cô nitơ Hanon HN 200

 Máy sinh khí nitơ PEAK INFINITY 9000

 Bình định mức 5 mL (Merck)

 Màng lọc cellulose acetat kích thước 0,45 µm để lọc dung môi (Sartorius stedim)

2.2 Nội dung, đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung nghiên cứu

2.2.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

 Giới hạn định lượng dưới

 Độ ổn định của mẫu trong huyết tương

2.2.2 Đối tượng nghiên cứu

 Mẫu dùng trong nghiên cứu là mẫu tự tạo của imipenem và meropenem trong huyết tương trắng

 Huyết tương bệnh nhân ở bệnh viện Bỏng sử dụng kháng sinh imipenem và bệnh viện đa khoa tỉnh Phú Thọ sử dụng kháng sinh meropenem

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu

 Tổng quan tài liệu xác định phương pháp xử lý mẫu và điều kiện sắc ký ban đầu

 Thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng theo hướng dẫn của FDA trên các tiêu chí tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc - đặc hiệu của phương pháp, tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác, độ ổn định (độ ổn định qua ba chu kỳ đông

rã, độ ổn định trong ngày, độ ổn định dài ngày), xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

 Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2013

2.2.4 Cách tiến hành thẩm định các tiêu chí

2.2.4.1 Độ chọn lọc, đặc hiệu

Là khả năng phương pháp phân tích nhận diện và phân biệt được chất phân tích

và các thành phần có trong mẫu Phân tích trên các mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau, mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn, chuẩn nội và hỗn hợp, so sánh các sắc ký đồ thu được Tại vị trí các pic chuẩn, chuẩn nội không được xuất hiện các pic tạp của nền mẫu trắng

2.2.4.2 Giới hạn định lượng dưới

Tiến hành phân tích trên 6 mẫu huyết tương trắng và 6 mẫu tự tạo có chứa chất phân tích và chất chuẩn nội ở nồng độ LLOQ dự kiến

Nồng độ thấp nhất của đường chuẩn được chấp nhận là giới hạn định lượng dưới nếu thỏa mãn các tiêu chí sau:

 Đáp ứng của chất phân tích ở LLOQ phải lớn hơn ít nhất 5 lần đáp ứng của mẫu trắng

 Pic của chất phân tích phải được nhận diện rõ ràng, không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác và lặp lại với độ chính xác 20% và độ đúng trong khoảng 80 – 120%

2.2.4.3 Đường chuẩn

Các điều kiện đường chuẩn xây dựng cần đáp ứng:

Đường chuẩn xây dựng bao gồm từ 6 đến 8 mẫu chuẩn bao phủ khoảng nồng

độ làm việc dự kiến, bao gồm LLOQ và phải đáp ứng các điều kiện sau:

 Độ lệch so với nồng độ định danh phải nhỏ hơn 20% ở LLOQ và nhỏ hơn 15% ở các nồng độ khác

 Ít nhất 4 trên 6 điểm chuẩn phải thỏa mãn tiêu chí trên, bao gồm điểm thấp nhất

và cao nhất của đường chuẩn

2.2.4.4 Độ đúng, độ chính xác và tỉ lệ thu hồi

 Độ đúng là giá trị phản ánh độ gần sát của nồng độ chất phân tích định lượng được so với giá trị thực độ đúng được xác định trên tối thiểu 3 mức nồng độ trong khoảng nồng độ làm việc dự kiến, mỗi nồng độ tối thiểu 5 mẫu Độ đúng phải nằm trong khoảng 85 – 115% so với giá trị thực, riêng với LLOQ yêu cầu trong khoảng

80 – 120%

 Độ chính xác là giá trị phản ánh độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biệu thị bằng giá trị hệ số biến thiên CV (%) Yêu cầu giá trị CV ≤ 15%, riêng với LLOQ yêu cầu

Tỉ lệ thu hồi không nhất thiết phải đạt 100% nhưng phải chính xác, ổn định và lặp lại

2.2.4.5 Độ ổn định

 Độ ổn định qua ba chu kỳ đông rã

Được tiến hành ở các nồng độ LQC, MQC, HQC mỗi nồng độ ít nhất ba mẫu Các mẫu được lưu trữ ở nhiệt độ dự kiến bảo quản mẫu trong 24 giờ và để tự rã đông

ở nhiệt độ phòng Khi hoàn toàn rã đông, các mẫu được tái đông ở cùng điều kiện

Được xác định ở 3 mức nồng độ LQC, MQC, HQC mỗi nồng độ 3 mẫu được rã đông hoàn toàn và giữ ở nhiệt độ này từ 4 đến 24 giờ (tùy thuộc thời gian dự kiến duy trì ở nhiệt độ phòng) và phân tích

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng imipenem và meropenem trong huyết tương

Trên cơ sở tham khảo bài báo của tác giả Trần Mạnh Thông và cộng sự [9], chúng tôi tiến hành khảo sát một số điều kiện sắc ký dựa trên điều kiện đã được nhóm tác giả xây dựng để rút ngắn thời gian phân tích mẫu và đáp ứng yêu cầu thực tế định lượng hai kháng sinh imipenem và meropenem trong huyết tương

Chương trình sắc ký được các tác giả xây dựng để định lượng 3 kháng sinh imipenem, meropenem, ertapenem trong huyết tương như sau:

 Thời gian phân tích mẫu: 19 phút

Chúng tôi nhận thấy phương pháp trên còn một số điểm có thể tối ưu như: thời gian phân tích mẫu còn tương đối dài (19 phút), không thuận tiện cho phân tích khối

meropenem trong huyết tương dựa trên cơ sở các điều kiện sắc ký tác giả đã xây dựng

3.1.1 Quy trình xử lý mẫu

Chúng tôi tham khảo quy trình xử lý mẫu của nghiên cứu trước đó, xử lý mẫu khi ly tâm với tốc độ dòng 6000 vòng/phút trong 10 phút: nhiều mẫu huyết tương bị đục, xuất hiện nhiều pic tạp, tăng lên tốc độ 9000 vòng/phút trong 15 phút: các mẫu trong, không còn bị vẩn đục, hạn chế được nhiều pic tạp trên sắc ký đồ Do vậy, chúng tôi tăng tốc độ ly tâm lên 9000 vòng/phút trong thời gian 15 phút để hạn chế tạp do protein chưa được loại hết

 Quy trình xử lý mẫu carbapenem trong huyết tương trắng

Bước 1: Hút 200 µL huyết tương trắng, thêm 200 µL dung dịch carbapenem đã pha, và 100 µL dung dịch chuẩn nội, lắc xoáy hỗn hợp 30 giây bằng máy lắc xoáy tốc

độ 1000 vòng/phút

Bước 2: Thêm 500 µL acetonitril vào hỗn hợp đã trộn đều ở trên, lắc xoáy 30 giây để hỗn hợp trộn đều với acetonitril, để yên 5 phút để tủa hoàn toàn protein huyết tương

Bước 3: Ly tâm hỗn hợp trên với tốc độ 9000 vòng/phút trong 15 phút để lắng tủa, hút 500 µL dịch sau khi ly tâm cho vào vial

Bước 4: Cô cạn dung môi bằng máy cô nitơ đến cắn

Bước 5: Hòa tan lại cắn bằng 200 µL dung dịch MOPS 2,64% và tiến hành chạy sắc ký

Sơ đồ tóm tắt quy trình xử lý mẫu carbapenem trong huyết tương trắng được trình bày trong hình 3.1

Cắn

200 µl dịch chạy

Hút 500 µl dịch, cho vào vial

Hòa tan lại bằng 200µl dd MOPS

 Quy trình xử lý mẫu carbapenem trong huyết tương bệnh

Bước 1: Máu bệnh nhân được lấy vào ống tráng Heparin, ly tâm loại tế bào máu Huyết tương bệnh được trộn ngay với dung dịch MOPS tỉ lệ 1:1 và bảo quản ngay ở tủ lạnh âm sâu

Bước 2: Hút 400 µL huyết tương bệnh vào ống eppendorf, thêm 100 µL dung dịch chuẩn nội, lắc xoáy hỗn hợp 30 giây bằng máy lắc xoáy tốc độ 1000 vòng/phút

Bước 3: Thêm 500 µL acetonitril vào hỗn hợp đã trộn đều ở trên, lắc xoáy 30 giây để hỗn hợp trộn đều với acetonitril, để yên 5 phút để tủa hoàn toàn protein huyết tương

Bước 4: Ly tâm hỗn hợp trên với tốc độ 9000 vòng/phút trong 15 phút để lắng tủa, hút 500 µL dịch sau khi ly tâm cho vào vial

Bước 5: Cô cạn dung môi bằng máy cô nitơ đến cắn

Bước 6: Hòa tan lại cắn bằng 200 µL dung dịch MOPS và tiến hành chạy sắc

ký

Quy trình tóm tắt xử lý mẫu huyết tương bệnh được trình bày trong hình 3.2

3.1.2 Lựa chọn cột sắc ký

Qua các tài liệu tham khảo, chúng tôi nhận thấy các phương pháp HPLC được nghiên cứu để định lượng carbapenem trong huyết tương thường sử dụng cột C18 hoặc cột C8 Imipenem và meropenem là hai chất phân cực, sử dụng cột C18 sẽ lưu giữ chất phân tích kém hơn Dựa trên các nghiên cứu đã thực hiện và điều kiện hiện

có, chúng tôi sử dụng cột Apollo C8 (Alltech) là loại pha tĩnh phân cực hơn cột C18

để lưu giữ chất phân tích tốt hơn, kéo dài thời gian lưu của imipenem để tách hoàn toàn chất này khỏi các pic huyết tương

3.1.3 Lựa chọn thành phần pha động

Chúng tôi sử dụng hệ dung môi pha động như sau:

Kênh A: Methanol

Kênh B: Đệm phosphat 0,05 M; pH = 7,4 (phụ lục)

3.1.4 Lựa chọn chế độ gradient pha động

Mẫu huyết tương trắng được thêm imipenem, meropenem, sau đó được xử lý theo quy trình nêu trên và tiến hành chạy sắc ký Chúng tôi tiến hành khảo sát các chương trình gradient trên hệ dung môi trên để tìm ra điều kiện phù hợp nhất, tách được imipenem và meropenem ra khỏi các pic khác trong mẫu huyết tương