Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng isoniazid, rifampicin, pyrazinamid trong huyết tương

Để góp phần nâng cao chất lượng điều trị, giảm tỉ lệ bệnh nhân kháng thuốc cần cho bệnh nhân sử dụng các thuốc đảm bảo sinh khả dụng và áp dụng hiệu chỉnh liều điều trị đối với một số bệ

trường đại học dược Hà Nội

nguyễn thị hương

nghiên cứu xây dựng phương pháp

định lượng isoniazid, rifampicin, pyrazinamid trong huyết tương

luận văn thạc sĩ dược học

Hà Nội - 2008

trường đại học dược Hà Nội

Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp tôi nhận được sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo và các cán bộ bộ môn Hóa phân tích, Phòng thí nghiệm trung tâm trường Đại học Dược Hà Nội, sự quan tâm giúp đỡ của người thân, gia đình và bạn bè Những sự giúp đỡ quý báu ấy đã giúp tôi hoàn thành khoá luận này, đồng thời cũng cho tôi hiểu biết thêm nhiều điều về tư duy trong công việc và ứng xử trong cuộc sống

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thị Kiều Anh người thầy đã dành nhiều thời gian, công sức tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ bộ môn hóa phân tích, phòng thí nghiệm trung tâm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã

động viên, khích lệ tôi rất nhiều để tôi có thêm sự nhiệt tình và say mê nghiên cứu khoa học

Hà Nội, tháng 12 năm 2008

Học viên

Nguyễn Thị Hương

Mục lục

đặt vấn đề 1

Chương 1 Tổng quan tài liệu 3

1.1 TìNH HìNH BệNH LAO THế GIớI Và VIệT NAM 3

1.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình bệnh lao tại Việt Nam 4

1.1.3 Sự kháng thuốc của vi khuẩn lao 5

1.2 Phác đồ và liều điều trị lao hiện nay 7

1.3 tổng quan về Rifampicin, isoniazid, pyrazinamid 8

1.3.1 Rifampicin 8

1.3.2 Isoniazid 12

1.3.3 Pyrazinamid 15

1.3.4 Định lượng đồng thời Isoniazid, Rifampicin, Pyrazinamid 17

1.4 vài nét về sắc kí lỏng hiệu năng cao 17

1.4.1 Khái niệm 17

1.4.2 Sắc ký phân bố pha đảo 17

1.4.3 Một số thông số đặc trưng 18

1.4.4 Hệ thống máy HPLC 20

1.4.5 Các phương pháp định lượng bằng HPLC 20

1.5 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh Học 21

Chương 2 Nguyên - vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 24

2.1 nguyên - vật liệu dùng trong nghiên cứu 24

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi 24

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 24

2.2.1 Trong nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân

tích 25

2.2.2 Trong xác định nồng độ Isoniazid, Rifampicin, Pyrazinamid trong huyết tương bệnh nhân lao uống đồng thời ba thuốc 25

2.2.3 Trong hiệu chỉnh nồng độ thuốc trong huyết tương 25

2.3 nội dung nghiên cứu 25

2.4 phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1 xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 26

2.4.2 Định lượng Isoniazid, Rifampicin, Pyrazinamid trong huyết tương 29

2.4.3 áp dụng hiệu chỉnh nồng độ thuốc bằng thay đổi liều điều trị 30

Chương 3 Kết quả thực nghiệm 31

3.1.Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 31

3.1.1 Xây dựng phương pháp phân tích 31

3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích 33

3.2 ứng dụng 42

3.2.1 Định lượng Isoniazid, Rifampicin, Pyrazinamid trong huyết tương 42

3.2.2 Phục vụ hiệu chỉnh nồng độ thuốc trong huyết tương 50

Chương 4 Bàn luận 52

4.1 Về phương pháp phân tích Isoniazid, Rifampicin, Pyrazinamid trong huyết tương bệnh nhân 52

4.1.1 Phương pháp xử lý mẫu: 52

4.1.2 Phương pháp phân tích định lượng đồng thời Isoniazid, Rifampicin, Pyrazinamid trong huyết tương bệnh nhân 52

4.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích 52

4.2 Về ứng dụng 54

Kết luận và kiến nghị 56

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t

AFB :Trùc khuÈn kh¸ng cån kh¸ng acid

DOTS :Ho¸ trÞ liÖu ng¾n ngµy cã gi¸m s¸t trùc tiÕp HPLC :S¾c kÝ láng hiÖu n¨ng cao

Danh mục bảng

Bảng 1.1: Liều điều trị thuốc lao theo quy định chương trình chống lao quốc

gia .8

Bảng 2.1 : Nồng độ RMP, INH, PZA điều trị cần đạt và nồng độ cần hiệu chỉnh liều ở thời điểm 2h 30

Bảng 3.1: Chương trình dung môi pha động 33

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của INH, PZA, RMP 35

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp phân tích 37

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp phân tích 39

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát giới hạn định lượng của phương pháp 39

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ ổn định của INH, PZA, RMP trong thời gian phân tích 40

Bảng 3.7: Kết quả nồng độ thuốc trong huyết tương bệnh nhân 44

Bảng 3.8: Kết quả nồng độ thuốc trong huyết tương bệnh nhân 45

Bảng 3.9: Kết quả nồng độ thuốc trong huyết tương bệnh nhân 46

Bảng 3.10: Kết quả hiệu chỉnh nồng độ RMP 51

Bảng 3.11: Kết quả hiệu chỉnh nồng độ PZA 51

Danh mục hình

Hình 3.1 : Sơ đồ quy trình xử lí mẫu 31

Hình 3.2: Sắc đồ mẫu huyết tương trắng 34

Hình 3.3: Sắc đồ mẫu huyết tương trắng thêm INH, PZA, RMP 34

Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ INH trong huyết tương 35

Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ PZA trong huyết tương 36

Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ RMP trong huyết tương 36

Hình 3.7: Biểu đồ minh hoạ giá trị RSD% của các nồng độ INH so với yêu cầu phân tích thuốc trong dịch sinh học 37

Hình 3.8: Biểu đồ minh hoạ giá trị RSD% của các nồng độ PZA so với yêu cầu phân tích thuốc trong dịch sinh học 38

Hình 3.9: Biểu đồ minh hoạ giá trị RSD% của các nồng độ RMP so với yêu cầu phân tích thuốc trong dịch sinh học 38

Hình 3.10: Biểu đồ minh hoạ độ ổn định của INH trong HT sau 7, 14 ngày bảo quản 41

Hình 3.11: Biểu đồ minh hoạ độ ổn định của PZA trong HT sau 7, 14 ngày bảo quản 41

Hình 3.12: Biểu đồ minh hoạ độ ổn định của RMP trong HT sau 7, 14 ngày bảo quản 42

Hình 3.13: Sắc đồ mẫu huyết tương bệnh nhân 43

Hình 3.14: Nồng độ RMP huyết tương sau 2h uống thuốc 47

Hình 3.15: Phân bố tỷ lệ bệnh nhân theo khoảng nồng độ RMP huyết tương 48

Hình 3.16: Nồng độ INH huyết tương sau 2h uống thuốc 48

Hình 3.17: Phân bố bệnh nhân theo khoảng nồng độ INH huyết tương 48

Hình 3.18: Nồng độ PZA huyết tương sau 2h uống thuốc 49

Hình 3.19: Phân bố bệnh nhân theo khoảng nồng độ PZA huyết tương 50

đặt vấn đề

Theo ước tính của WHO có khoảng 1/3 dân số trên thế giới bị nhiễm vi khuẩn lao, hàng năm có khoảng 3 triệu người chết do lao Khoảng 95% những trường hợp nhiễm lao mới và 99% những trường hợp tử vong thuộc về các nước đang phát triển, trong đó hơn 70% thuộc về các nước châu á Năm 2004, 8,8 triệu người mắc lao mới đã được ghi nhận

Việt nam đứng thứ 13 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu Trong khu vực Tây - Thái Bình Dương, Việt nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philipin về số lượng bệnh nhân lao cũ cũng như bệnh lao mới xuất hiện hàng năm

Số thuốc chống lao không nhiều, trong khi đó các thuốc chống lao mới vẫn còn rất ít và còn đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng, bệnh nhân khó tiếp cận trong điều kiện Việt nam Như vậy các thuốc điều trị bệnh lao hiện đã và đang sử dụng tuy không mới nhưng vẫn là vũ khí quan trọng nhất

để điều trị bệnh lao

Theo hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid là 3 trong 6 loại thuốc chống lao thiết yếu, tiêu diệt vi khuẩn lao,

đây là các loại thuốc chống lao đường uống được khuyến cáo dùng trong giai

đoạn tấn công của phác đồ điều trị lao Để tiêu diệt được vi khuẩn lao nồng độ thuốc trong huyết tương phải đạt được nồng độ điều trị Vì vậy nếu nồng độ của Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid trong huyết tương thấp dẫn đến nguy cơ kháng thuốc, thất bại trong điều trị và tái phát bệnh lao sau điều trị

Theo WHO, hiện nay bệnh lao kháng thuốc là một vấn đề toàn cầu, đặc biệt nghiêm trọng là tình trạng kháng đa thuốc Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là đối với bệnh nhân kháng đa thuốc Chi phí điều trị bệnh nhân lao kháng đa thuốc tăng lên 100 lần so với bệnh nhân lao không kháng thuốc và thậm chí không điều trị được ở một số trường hợp Một trong những nguyên nhân của tình trạng trên là do có sự giảm sinh khả dụng của một số hoạt chất trong các chế phẩm thuốc chống lao hỗn hợp nhiều thành phần Mặt khác, có sự khác biệt rất lớn giữa các cá thể về nồng độ thuốc

trong huyết tương mặc dù bệnh nhân được uống cùng liều như nhau Nguy cơ tái phát và thất bại điều trị gia tăng khi nồng độ thuốc trong huyết tương không đạt ngưỡng điều trị Để góp phần nâng cao chất lượng điều trị, giảm tỉ

lệ bệnh nhân kháng thuốc cần cho bệnh nhân sử dụng các thuốc đảm bảo sinh khả dụng và áp dụng hiệu chỉnh liều điều trị đối với một số bệnh nhân mà nồng độ thuốc trong huyết tương không đạt ngưỡng điều trị Để đáp ứng yêu cầu trên cần có phương pháp định lượng nhằm theo dõi, đánh giá nồng độ các thuốc chống lao trong huyết tương

Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây

dựng phương pháp định lượng Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid trong huyết tương“ nhằm mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

2 ứng dụng để xác định đồng thời nồng độ Rifampicin, Isoniazid,

Pyrazinamid trong huyết tương bệnh nhân lao nhằm phục vụ cho việc hiệu chỉnh liều điều trị dựa trên nồng độ thuốc

Chương 1

Tổng quan tài liệu

1.1 TìNH HìNH BệNH LAO THế GIớI Và VIệT NAM

1.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới

Bệnh lao hiện nay vẫn là một vấn đề lớn của toàn cầu Hậu quả của bệnh lao đối với xã hội là rất lớn Có đến 1/3 dân số thế giới nhiễm lao tức là khoảng hơn 2 tỷ người nhiễm lao 2,5% gánh nặng bệnh tật toàn thế giới là do bệnh lao Tử vong do bệnh lao đứng hàng thứ 7 trong các nguyên nhân gây tử vong trên toàn thế giới và là nguyên nhân tử vong hàng đầu cho phụ nữ trẻ (hơn 1/2 nguyên nhân tử vong ở phụ nữ là do bệnh lao) [22] Hàng năm có khoảng 8 - 9 triệu bệnh nhân lao mới được phát hiện và khoảng 3 triệu bệnh nhân lao tử vong Năm 2004 tổng số mắc lao là 14.6 triệu bệnh nhân (229/100.000) ước tính năm 2005 vẫn còn có khoảng 8,8 triệu bệnh nhân lao mới, 1,6 triệu người tử vong do lao, trong đó có 195.000 người đồng nhiễm

lao/HIV [25]

ở các nước phát triển, 50 năm vừa qua, phạm vi tác động của bệnh lao

đã đang được được thu hẹp lại Tỷ lệ mắc lao 25/100.000 dân ở hầu hết các nước ở Đụng Âu, và dưới 10/100.000 dân ở các nước như Mỹ, Canada, và Australia Tuy vậy tỷ lệ mắc lao thấp trên không ổn định vì hiện tượng lây truyền bệnh do di dân [27]

Tần suất mắc bệnh lao gia tăng do các nguyên nhân chính là: đại dịch HIV, tỷ lệ phát hiện bệnh lao thấp (theo WHO tỷ lệ này chỉ chiếm khoảng 40

đến 45%), do có nhiều bệnh nhân không được điều trị ở các nước có thu nhập thấp, thêm vào đó là hiện tượng lao đa kháng thuốc gia tăng (do điều trị không

đủ hoặc không được điều trị), thiếu trang thiết bị chẩn đoán và điều trị bệnh nhân lao kháng đa thuốc và siêu kháng thuốc, tình hình bệnh nhân siêu kháng thuốc vẫn chưa được xác định trên toàn cầu, lan truyền bệnh lao bởi sự di dân

từ các nước nghèo sang các nước giàu Ngoài ra, bệnh lao cũng được bùng

phát bởi các yếu tố khác như đói nghèo, các đại dịch lớn trong các quốc gia và

sự bất ổn về chính trị [27]

Mặc dù, có rất nhiều nỗ lực trong công tác phòng chống bệnh lao và tình hình bệnh lao hiện mắc và tử vong do lao trên toàn thế giới đã có dấu hiệu bình ổn, nhưng các chuyên gia cho rằng phải qua năm 2020 gánh nặng bệnh lao mới giảm Hiện nay, trên toàn cầu cứ 1 giây có thêm 1 người nhiễm lao và

cứ 15 giây có 1 người bị chết vì lao Phần lớn người mắc lao ở tuổi lao động (chiếm đến75% tổng số người mắc lao) Khoảng 95% bệnh nhân lao và 99% những trường hợp tử vong do lao thuộc về các nước đang phát triển Gánh nặng lao lớn nhất là ở vùng phụ cận Saharan thuộc châu Phi và vùng Đụng Nam á [22]

Trước những thách thức của tình hình dịch tễ bệnh lao và đảm bảo thành công của công tác phòng chống lao trong giai đoạn này, ngày 22/06/2007, WHO đã kêu gọi triển khai chương trình hành động mang tính toàn cầu mang tên “The Global MDR-TB and XDR-TB Response Plan 2007-2008” (kế hoạch toàn cầu phòng chống bệnh lao đa kháng thuốc và kháng đa thuốc cực mạnh giai đoạn 2007-2008) [4]

1.1.2 Tình hình bệnh lao tại Việt Nam

Bệnh lao ở nước ta hiện nay vẫn là một trong các bệnh nhiễm trùng phổ biến Theo đánh giá của WHO (2008) [29], Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có tình trạng bệnh lao trầm trọng nhất thế giới và là một trong 10 nước

có gánh nặng bệnh lao cao nhất châu á Trong khu vực tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ 3 sau Trung Quốc và Philipin về số bệnh nhân lao lưu hành cũng như số bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm, đồng thời là một trong những nước có tỷ lệ lao kháng thuốc cao nhất trên thế giới (32,5%)

Năm 1995, Việt Nam bắt đầu triển khai điều trị lao bằng hoá trị liệu ngắn ngày có giám sát trực tiếp (DOTS) Giai đoạn 2001-2003, chương trình chống lao Việt Nam đã được triển khai hầu hết tại các xã, huyện và dân số cả nước đã được bảo vệ bởi DOTS

Việt Nam là nước đầu tiên ở châu á đạt được mục tiêu do WHO đề ra

về công tác chống lao năm 1996 Ngày thế giới phòng chống lao 23/3/2004, Việt Nam là 1 trong 6 nước trên toàn thế giới (đồng thời là nước duy nhất trong số 22 quốc gia có gánh nặng bệnh lao cao) được nhận giải thưởng của WHO về thành tích đã đạt được mục tiêu do WHO đề ra và kết quả trong công tác chống lao có tính bền vững trên 4 năm [3]

Chính phủ, Bộ Y tế và Chương trình chống lao quốc gia Việt Nam đã và

đang hết sức nỗ lực trong công tác phòng chống bệnh lao Tuy nhiên, những thách thức to lớn vẫn đang đặt ra với chương trình chống lao quốc gia Việt Nam Những khó khăn thách thức đó là: tình hình dịch tễ bệnh lao vẫn duy trì

ở mức cao; sự gia tăng tỷ lệ bệnh nhân lao tái phát, lao kháng thuốc; đồng nhiễm Lao/HIV (là một trong những nguyên nhân làm cho tình hình dịch tễ bệnh lao tại nước ta không giảm mặc dù tỷ lệ phát hiện và tỷ lệ điều trị khỏi cao); bệnh lao trong nhà tù; phối hợp y tế công- tư trong công tác phòng chống lao (chỉ đạo, quản lý về chuyên môn không đáp ứng kịp với sự phát triển mạnh của hệ thống y tế tư nhân); những khó khăn trong việc tiếp cận dịch vụ chăm sóc sức khỏe trong chiến lược DOST đối với người dân tộc thiểu

số, vùng sâu vùng xa, dân nghèo thành thị và các đối tượng đăc biệt tại các trại giam, các trung tâm cai nghiện

1.1.3 Sự kháng thuốc của vi khuẩn lao

Vi khuẩn lao có khả năng kháng thuốc cao Sự kháng thuốc của vi khuẩn lao do nhiều nguyên nhân, các nguyên nhân có mối liên quan và phối hợp với nhau Một số nguyên nhân chính gây kháng thuốc liên quan đến điều trị bệnh lao như sau:

- Điều trị bệnh lao không đúng Khi điều trị bệnh lao bằng đơn trị liệu

thì những vi khuẩn đột biến kháng thuốc sẽ không bị tiêu diệt, vì vậy cần phối hợp thuốc chống lao để điều trị Phác đồ điều trị không phù hợp sẽ dễ dàng làm xuất hiện những chủng vi khuẩn kháng thuốc Liều thuốc điều trị không

đủ cũng không thể diệt được hết vi khuẩn và những vi khuẩn đã tiếp xúc với thuốc sẽ có đột biến và tự điều chỉnh để thích nghi với thuốc Nếu tình trạng

này xảy ra, sự kháng thuốc xuất hiện và khi đó ngay cả nồng độ thuốc hiệu chỉnh cao hơn cũng không diệt được những vi khuẩn này

- Không tuân thủ điều trị Bệnh nhân không dùng thuốc đều đặn hay tự

bỏ trị khi các triệu chứng bệnh lao đã hết sẽ làm cho các vi khuẩn thuộc quần thể nằm trong tế bào bị acid ức chế và những vi khuẩn phân chia không thường xuyên chưa bị tiêu diệt sẽ trở nên kháng thuốc Vì vậy việc theo dõi tuân thủ điều trị là vô cùng quan trọng

- B ệnh cảnh lâm sàng của bệnh nhân Những bệnh nhân lao có HIV sự

hấp thu thuốc chống lao vào máu kém hơn nhiều so với những bệnh nhân lao không có HIV Ngoài ra, những bệnh nhân lao có HIV còn có nguy cơ xảy ra tương tác thuốc do phải sử dụng các thuốc kháng vi rút đồng thời với các thuốc chống lao Những bệnh nhân có bệnh về rối loạn tiêu hóa cũng làm giảm khả năng hấp thu thuốc lao Một số bệnh nhân lao có các bệnh mạn tính khác phải dùng thuốc điều trị khác như bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng,

đái tháo đường, viêm khớp dạng thấp cũng làm giảm khả năng hấp thu thuốc chống lao và tương tác thuốc có thể sảy ra gây ra tình trạng kháng thuốc Bệnh nhân lao có tổn thương lớn, nhiều tổn thương xơ và hang, khả năng máu tới nuôi dưỡng vùng tổn thương kém do vậy nồng độ thuốc lao tập trung mô cũng thấp, cũng tạo điều kiện thuận lợi gia tăng khả năng kháng thuốc của vi khuẩn

- Cơ địa bệnh nhân Khi sử dụng thuốc lao đường uống, khả năng hấp

thu thuốc chống lao khác nhau rất nhiều giữa các cá thể Có những bệnh nhân khả năng hấp thu thuốc lao uống từ đường tiêu hóa vào máu rất kém, vì vậy mặc dù những bệnh nhân này đã được uống thuốc đủ liều lượng nhưng nồng

độ thuốc trong máu và trong mô bệnh không đạt nồng độ điều trị, như vậy giống như trường hợp dùng thuốc không đủ liều và nguy cơ kháng thuốc xảy

ra Ngoài ra, có những trường hợp bệnh nhân không dung nạp được thuốc lao

do tác dụng không mong muốn của thuốc, do đó phải dùng các loại thuốc khác thay thế, vì vậy không sử dụng được những thuốc tối ưu nên nguy cơ kháng thuốc dễ xảy ra

- Chất lượng thuốc chống lao kém Khi chất lượng thuốc chống lao kém,

cung cấp thuốc lao không đủ và quản lý thuốc lao kém, đồng nghĩa với việc khó đảm bảo đủ nồng độ thuốc lao trong máu, và việc xuất hiện kháng thuốc

1.2 Phác đồ và liều điều trị lao hiện nay

Các phác đồ chính điều trị lao hiện được áp dụng ở Việt Nam [1], [3],

[6], [13]

• Lao phổi mới ở người lớn: 2SRHZ/6HE

• Lao phổi tái phát, lao phổi mạn tính và thể lao nặng: 2SRHZE/ 1RHZE/ 5(RHE)3 [16]

- Lao mới: bệnh nhân chưa được điều trị lao bao giờ hoặc đã điều trị chưa được 1 tháng

- Lao phổi tái trị là những bệnh nhân đã được chẩn đoán mắc lao trước

đây, được điều trị (đủ hoặc chưa đủ thời gian) với kết quả triệu chứng đã hết hoặc thuyên giảm trong 1 tháng hoặc hơn Bệnh nhân quay trở lại với triệu chứng lâm sàng và (hoặc) xét nghiệm (ví dụ AFB dương tính) của một bệnh

đang tiến triển Lao tái trị bao gồm:

+ Điều trị lại sau bỏ trị: bệnh nhân không dùng thuốc 2 tháng trong quá trình điều trị, nay quay laị điều trị với AFB (+) trong đờm

+ Tái phát: bệnh nhân được điều trị lao đủ thời gian, được thầy thuốc xác định khỏi bệnh hoặc hoàn thành điều trị nay mắc bệnh trở lại

+ Thất bại: bệnh nhân có AFB (+) trong đờm sau điều trị thuốc lao 5 tháng

- Lao mạn tính: bệnh nhân có xét nghiệm đờm dương tính hoặc trở nên dương tính sau khi đã được điều trị lại đầy đủ thời gian bằng công thức tái trị

và có giám sát trực tiếp

- Thể lao nặng: lao kê, lao màng não, lao màng tim, lao nhiều bộ phận Liều lượng các thuốc chống lao tính theo cân nặng bệnh nhân ở Bảng 1.1 (theo quy định của CTCLQG) [13]

Bảng 1.1: Liều điều trị thuốc lao theo quy định chương trình chống lao quốc gia

Thuốc chống lao Liều lượng mg/kg cân nặng

Liều hàng ngày Liều cách quãng

- Tên khoa học:

(12Z,14E,24E) (2S,16S,17S,18R,19R,20R,21S,22R,23S) -

5,6,9,17,19-pentahydoxy - 23 - methoxy - 2,4,12,16,18,20,22 - heptamethyl - 8 -

[N-(4-methyl-1-pipeainyl) pentadecatrienoimino] - 1,2dihydronaphtho [2,1-b] furan

- 21 - yl acetat

- Tính chất [14]

Bột kết tinh màu đỏ cam, hoặc đỏ nâu, không bền khi bị ẩm Dễ tan

trong cloroform, tan trong methanol, tan ít trong nước, ethanol, ether Dung

dịch rifampicin không bền và biến đổi tuỳ thuộc vào pH và nhiệt độ, dung

dịch pH kiềm dễ bị oxy hóa bởi oxy không khí chuyển RMP sang dạng

quinon, ở pH acid RMP bị thuỷ phân ra hợp chất 3-formyl rifampicin SV Các

nhóm ester bị thuỷ phân ngay ở pH trung tính

1.3.1.2 Dược động học [5], [9]

RMP hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, nồng độ thuốc trong huyết tương

có sự dao động rất lớn giữa các cá thể và khác nhau giữa các tài liệu công bố,

khi uống liều 600 mg sau 2- 4 giờ đạt Cmax huyết tương 7 - 9 àg, 7 - 10 àg , 4

- 32 àg

RMP liên kết với protein huyết tương với tỷ lệ 80-94% Thuốc phân bố

rộng rãi vào các mô và dịch cơ thể, khuếch tán vào dịch màng phổi, dịch não

tủy khi bị viêm Thuốc vào cả nhau thai và sữa mẹ Nồng độ thuốc trong thành

hàng lão, nhu mô phổi và thận cao hơn so với huyết tương, nồng độ thuốc trong màng phổi và xương thấp hơn huyết tương Khả năng thấm vào dịch não tủy, dịch màng phổi và chất bã đậu chỉ đạt tối đa 20% so với trong huyết tương

RMP chuyển hóa ở gan, thuốc bị khử acetyl thành chất chuyển hóa có hoạt tính 25-O-desacetyl- rifampicin và các chất chuyển hóa khác không còn hoạt tính như rifampin quinon, desacetyl rifampin quinon và 3 formyl- rifampin

RMP thải trừ qua mật (chu kỳ gan- ruột) và nước tiểu là chủ yếu Ngoài

ra, thuốc còn thải trừ qua nước bọt, đờm và nước mắt Thời gian bán huỷ của RMP là 3- 5 giờ sau uống liều đầu, khi uống lặp lại là 2- 3 giờ Thời gian bán huỷ kéo dài ở người suy gan

1.3.1.4 Phổ tác dụng và cơ chế [5], [9]

- RMP có tác dụng tốt với các chủng vi khuẩn Mycobacterium đặc biệt là Mycobacterium tuberculosis, vi khuẩn phong Mycobacterium laprae Nồng

độ ức chế tối thiểu với trực khuẩn lao là 0,1 - 0,2 àg/ml

Ngoài ra, RMP là kháng sinh phổ rộng, có tác dụng tốt với các vi khuẩn gram dương và âm (trừ cầu khuẩn đường ruột) như lậu cầu, não mô cầu, liên cầu kể cả chủng kháng methicillin, Haemophilus influenzae

- Cơ chế: RMP gắn vào các tiểu đơn vị β của ARN-polymerase, làm sai lệch thông tin của các enzym này, do đó ức chế sự khởi đầu của quá trình tổng hợp của ARN mới Thuốc có tác dụng diệt khuẩn

1.3.1.5 Chỉ định [5], [9]

- Điều trị tất cả các thể lao bao gồm cả lao màng não

- Điều trị phong (theo phác đồ)

- Phòng và điều trị viêm màng não do H.influenzae và N.meningitidis

- Điều trị nhiễm khuẩn nặng do Staphylococcus kháng methicillin

1.3.1.6 Chống chỉ định [5], [9]

- Mẫn cảm với RMP

- Rối loạn chuyển hóa porphyrin ở những người nhạy cảm

1.3.1.7 Tác dụng không mong muốn [5], [9]

- Rối loạn tiêu hóa: buồn nôn, nôn

- Viêm gan và rối loạn chuyển hóa porphyrin

- Ngoài ra: đau đầu, mệt mỏi, ban da, thiếu máu, giảm tiểu cầu

- Khi dùng chế độ ngắt quãng 2 lần / tuần có thể gặp hội chứng giả cúm

1.3.1.8 Liều dùng [5], [9]

Điều trị lao

Giai đoạn tấn công: 10 mg/kg/24h tối đa 600 mg/24h dùng hàng ngày

Giai đoạn duy trì: 10 mg/kg/24h dùng 2-3 lần/tuần

* Đối với dịch sinh học

 Phương pháp HPLC [8]

o Cột: Apollo Alltech RP 18 (25 cm x 4,6 mm; 5 àm) với bảo vệ cột Alltech (7,5 x 4,6 àm)

o Pha động: methanol - đệm phosphat pH 4,5 (65: 35)

o Cách pha đệm: dung dịch kali dihydrophosphat 0,02M được điều chỉnh pH 4,5 bằng acid phosphoric, lọc qua màng lọc 0,45 àm

o Detector UV: 254 nm

 Dung dịch chế phẩm trong ethanol tác dụng với vanilin và đun nóng tạo tủa màu vàng

1.3.2.3 Dược động học [5], [9]

INH được hấp thu nhanh qua đường tiêu hoá Thời gian sau uống liều

300 mg nồng độ tối đa trong huyết tương đạt tới 3 - 8 àg/ml Thức ăn và các thuốc chứa nhôm làm giảm hấp thu thuốc

INH khuếch tán nhanh vào các tế bào, dịch màng phổi, dịch cổ trướng

và nước não tuỷ Nồng độ INH trong dịch não tuỷ tương đương với nồng độ trong máu

Thuốc được chuyển hoá ở gan nhờ phản ứng acetyl hoá của INH thông qua acetyltransferase có tính di truyền ở người có hoạt tính enzym mạnh, thời gian bán thải của thuốc khoảng 1h, người có hoạt tính enzym yếu thời gian bán thải của thuốc khoảng 3 h

Thận là cơ quan thải trừ chủ yếu của INH Sau dùng INH 24 h, thuốc thải trừ khoảng 75 - 95 % dưới dạng đã chuyển hoá Thời gian bán thải của thuốc là 0,75 - 4,5 h, tùy thuộc vào người có phản ứng Acetyl hoá nhanh hay chậm, ở người acetyl hóa nhanh là 0,75 - 1,8 h; acetyl hoá chậm là 2 - 4,5 h Người suy giảm chức năng gan hoặc suy thận nặng thời gian bán thải chậm hơn

1.3.2.4 Dược lý và cơ chế tác dụng [5], [9]

INH là một trong những thuốc hóa học đầu tiên được chọn trong điều trị lao Thuốc đặc hiệu cao, có tác dụng chống lại Mycobacterium tuberculosis và

các Mycobacterium không điển hình khác như M bovis, M kansasii INH diệt

khuẩn phụ thuộc vào nồng độ thuốc ở vị trí tổn thương và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn

Cơ chế tác dụng chính xác của INH vẫn chưa biết, nhưng có thể do thuốc ức chế tổng hợp acid mycolic và phá vỡ thành tế bào vi khuẩn lao

1.3.2.5 Chỉ định [5], [9]

Phòng và điều trị mọi thể lao trong và ngoài phổi, sơ nhiễm và tái phát

1.3.2.6 Tác dụng không mong muốn (ADR) [5], [9]

- Với gan: Viêm gan, hoại tử tế bào gan tăng aminotransferase gan (AST, ALT) Độc tính tăng lên nếu sử dụng đồng thời thuốc độc với gan như PZA, RMP hoặc uống rượu

- Với thần kinh và tâm thần: viêm dây thần kinh ngoại biên, rối loạn tâm thần thể hưng cảm, tăng cơn động kinh, co giật, hay gặp ở người suy dinh dưỡng, nghiện rượu và người có tiền sử bệnh tâm thần

- Các tác dụng không mong muốn khác: thiếu máu, giảm tiểu cầu, mất bạch cầu hạt, các phản ứng dị ứng, sốt, rối loạn tiêu hóa

1.3.2.7 Liều lượng và cách dùng [5], [9]

Tốt nhất là trước ăn 1 giờ hoặc sau ăn 2 giờ Có thể uống thuốc cùng với bữa ăn, nếu bị kích ứng đường tiêu hóa.

Liều tấn công: 5 mg/kg/24h dùng hàng ngày

Liều duy trì: 10 mg/kg/lần x 3 lần/tuần hoặc 15 mg/kg/24h x 2 lần/tuần

1.3.2.8 Các phương pháp định lượng

* Đối với nguyên liệu [14]

- Định lượng bằng phương pháp đo acid trong môi trường khan

- Phương pháp đo brom: chất chuẩn có thể là dung dịch brom chuẩn, dung dịch kali bromat chuẩn và lượng brom dư được xác định bằng phương pháp đo natri thiosulfat hoặc đo nitrit

* Đối với dich sinh học [21]

0,3%/ethanol), trichlorocetic acid (1 ml; 10%/ethanol) và 1 ml HCl - KCl (pH

= 2) Hỗn hợp trộn được làm nóng ở 70˚C trong 10 phút, làm lạnh ở nhiệt độ phòng, thêm ethanol và cloroform điều chỉnh thể tích thành 7 ml, ly tâm với tốc độ 3000v/ phút, lấy lớp trên tiêm vào cột ODS

 Dung dịch chế phẩm 0,005% trong nước, ở vùng sóng từ 290nm

đến 350nm có một cực đại hấp thụ ở 310nm Dung dịch chế phẩm 0,0001% trong nước ở vùng sóng từ 230nm đến 290nm có một cực đại hấp thụ ở 268nm với độ hấp thụ riêng từ 640 đến 680

 Đun sôi chế phẩm trong dung dịch natri hydroxyd, hơi bốc lên làm xanh giấy quỳ đỏ

 Tác dụng với dung dịch sắt (II) sulfat tạo màu vàng, thêm dung dịch natri hydroxyd loãng màu biến sang xanh đen

1.3.3.2 Dược động học [5], [9]

PZA được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa Nồng độ đỉnh trong huyết thanh đạt được 2 giờ sau khi uống một liều 1,5 g là khoảng 35 àg/ml và với liều 3 g là 66 àg/ml Thời gian bán thải của PZA khoảng 9 - 10 h, người suy

gan, suy thận thời gian bán thải kéo dài hơn Thuốc phân bố vào các mô và dịch của cơ thể kể cả gan, phổi, dịch não tủy Thuốc bị thuỷ phân ở gan thành chất chuyển hoá chính có hoạt tính là acid pyrazinoic, đào thải qua thận, chủ yếu lọc ở cầu thận Khoảng 70% liều uống đào thải trong vòng 24 giờ

1.3.3.3 Dược lý và cơ chế tác dụng [5], [9]

Có tác dụng diệt khuẩn ở pH 5 - 5,5 và có tác dụng yếu ở pH trung tính

Có tác dụng với mọi thể lao nhưng tốt nhất là các vi khuẩn lao trong các đại thực bào vì thuốc thấm tốt vào nội bào

1.3.3.6 Tác dụng không mong muốn (ADR) [5], [9]

Phản ứng có hại thông thường nhất là gây độc cho gan và phụ thuộc vào liều dùng Gây tăng acid uric máu nên dễ gây các cơn gút cấp Ngoài ra có thể gây buồn nôn, nôn, mệt mỏi

 Detector: 268 nm

 Dung dịch thử: 1 ml chế phẩm + 0,2 ml HClO4 5%, lắc xoáy trong 30 giây, thêm 0,1 ml KH2PO4 4 M lắc xoáy 30 giây Ly tâm với tốc độ

1500 vòng/phút Lấy lớp trên Tiêm chính xác 20 àl vào hệ thống sắc ký

1.3.4 Định lượng đồng thời RMP, INH, PZA [26]

* Trong chế phẩm thuốc chứa đồng thời RMP, INH, PZA

 Cột C18 khử hoạt tính (4,6 mm x 25 cm ; 5àm)

 Pha động: dung dịch A : đệm phosphat pH 6,8 và MeCN (96 : 4) dung dịch B : đệm phosphat pH 6,8 và MeCN (45 : 55) Với chương trình chạy:

Thời gian (phút) Dung dịch A (%) Dung dịch B (%)

* Trong dịch sinh học: như mục 1.3.2.8

1.4 vài nét về sắc kí lỏng hiệu năng cao

Hiện nay sắc kí phân bố pha đảo được dùng nhiều vì nó cho kết quả tách tốt nhất với nhiều đối tượng phân tích

Tuỳ thuộc vào tính chất các pha mà ta có những phương pháp sắc kí khác nhau Với khuôn khổ của khoá luận này chúng tôi chỉ đề cập đến sắc kí phân bố pha đảo

1.4.2 Sắc ký phân bố pha đảo [12], [15]

Nhóm Silanol Dẫn chất Dẫn chất Siloxan

Của Silicagel clorosilan

R là nhóm ít phân cực như: Octyl (C8), Octadecyl (C18), propyl phenyl Dung môi phân cực như: MeOH, MeCN thì ta có sắc kí pha đảo

Trong sắc kí pha đảo: chất phân cực ra trước, các chất ít phân cực và không phân cực ra sau

Quyết định của sự tách các chất là tổng hợp các tương tác :

1.4.3 Một số thông số đặc trưng [12], [15]

* Hệ số dung lượng k’

Quá trình tách trong cột sắc kí là sự tương tác của các chất phân tích với pha tĩnh (nhồi trong cột) dưới tác động của pha động, do đó bản chất của quá trình sắc kí là sự phân bố chất tan giữa hai pha Sự phân bố này được đặc trưng

Chất tan (A, B )

Pha tĩnh Pha động

bằng hệ số dung lượng k’ k’ được xác định bằng tỷ số giữa lượng chất tan A trong pha tĩnh và pha động theo công thức sau:

)M(Q

)S(Q'

số đĩa lí thuyết của cột

Tuỳ theo tính chất, cấu trúc của chất phân tích mà người ta sử dụng các detector khác nhau để phát hiện như: huỳnh quang, UV - VIS, điện hoá Trong đó UV - VIS được dùng phổ biến nhất vì nó đơn giản, khả năng ứng dụng rộng, độ nhạy cao đáp ứng nhu cầu phân tích và kinh tế

* Thời gian lưu (tR)

Thời gian lưu của một chất (tính bằng phút, giây) là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí đến lúc xuất hiện đỉnh pic của nó trên sắc đồ

So sánh thời gian lưu của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều kiện ta sẽ định tính được chất đó

* Số đĩa lí thuyết

Là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc kí nhất

định Mỗi đĩa lí thuyết trong cột sắc kí như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là

H, lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động

Số đĩa lí thuyết N được tính theo công thức sau:

2 RW

t16

RW

t54.5

Trong đó: tR: thời gian lưu (phút)

W: chiều rộng của pic đo ở đáy pic (phút)

W1/2: chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao của pic (phút)

Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000

* Độ phân giải Rs

Là đại lượng biểu thị mức độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một

điều kiện sắc kí đã cho Độ phân giải của 2 pic cạnh nhau được tính theo công thức sau:

B A

A R, B R, S

WW

)t2(tR

+

−

) B ( 2 / 1 ) A ( 2 / 1

A , R B , R S

WW

)tt(18,1R

WA, WB là độ rộng đo ở các đáy pic của chất A và B (đơn vị: phút)

W1/2(A), W1/2(B) là độ rộng đáy pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A

- Phương pháp chuẩn ngoại

- Phương pháp chuẩn nội

- Phương pháp chuẩn hoá diện tích

- Phương pháp thêm chuẩn

Với khuôn khổ của khoá luận này chúng tôi xin trình bày phương pháp chuẩn ngoại

* Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc kí trong cùng điều kiện

So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử

Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm

- Chuẩn hóa 1 điểm: Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử Tính nồng độ mẫu thử theo công thức:

S

S X X

S

CS

ở đây CX : Nồng độ mẫu thử

CS : Nồng độ mẫu chuẩn

SX : Diện tích (chiều cao) pic của chất phân tích trong mẫu thử

SS : Diện tích (chiều cao) pic của chất phân tích trong mẫu chuẩn

- Chuẩn hóa nhiều điểm: Tiến hành qua các bước sau:

Chuẩn bị một dãy các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc kí Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc các chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn

Vẽ đồ thị đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích hoặc chiều cao của pic với nồng độ của chất chuẩn Sử dụng đoạn tuyến tính của

đường chuẩn để tính toán nồng độ của các chất cần xác định

y = ax + b → x = (y – b)/a Trong đó: y là diện tích hoặc chiều cao của pic

x là nồng độ của chất chuẩn

a, b là các hằng số

1.5 Thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học

Mẫu sinh học thường có chứa nhiều tạp chất, lượng mẫu ít và nồng độ chất phân tích thường rất thấp Do vậy, phương pháp phân tích mẫu sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng vào phân tích mẫu

Nội dung thẩm định phương pháp được hướng dẫn trong các tài liệu về phân tích và được quy định trong các dược điển [11]

a Tính chọn lọc - đặc hiệu (selectivity - specificity):

Tính chọn lọc hay tính đặc hiệu là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác có thể là tạp chất, hoặc các thành phần cản trở khác Nói cách khác tính chọn lọc thể hiện khả năng nhận diện ‘chất cần phân tích’ và không bị nhầm lẫn bởi các chất khác Do vậy, kết quả phải thể hiện trên sắc đồ thu được từ mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn pha trong mẫu trắng, chất cần phân tích phân tách hoàn toàn với các pic tạp

b Xây dựng đường chuẩn và xác định khoảng nồng độ tuyến tính (Linearity):

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (Diện tích hay chiều cao) và nồng độ thuốc trong dịch sinh học Mối quan hệ này phải được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một

đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Đường chuẩn phải có ít nhất 5 nồng độ của chất chuẩn được chuẩn bị trong cùng một mẫu dịch sinh học

Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu cần phân tích Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải tuyến tính và có hệ

số R2 không nhỏ hơn 0,98

c Giới hạn định lượng dưới (LLOQ):

Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhận là LLOQ nếu thoả mãn:

- Đáp ứng ở nồng độ này ít nhất phải bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng

- Pic của chất cần phân tích có thể nhận biết, nằm tách riêng và có thể tái lăp với độ đúng từ 80 - 120%

d Độ chính xác

Độ chính xác của một phương pháp là kết quả thống nhất giữa kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất Độ chính xác được biểu thị độ lệch chuẩn (σ) hay

độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) , hoặc sai số tương đối (εr%) Độ chính xác gồm có:

- Độ lặp lại (repeatability): Độ lặp lại được tính khi phép phân tích được

lặp lại trong cùng một phòng thí nghiệm, trong khoảng thời gian ngắn, và do cùng một người phân tích

- Độ tái hiện (reproducibility): Độ tái hiện được xác định bằng cách lặp

lại phép phân tích đó ở một phòng thí nghiệm khác (thường trong nghiên cứu hợp tác giữa nhiều phòng thí nghiệm)

- Độ chính xác trung gian: là độ chính xác được xác định ở cùng một phòng thí nghiệm, nhưng trong ngày khác, hoặc với người phân tích khác, hoặc trên thiết bị khác

e Độ đúng:

Độ đúng của 1 phương pháp phân tích là mức độ gần sát của kết quả phân tích với giá trị thực của chất phân tích Độ đúng có thể thay đổi từ 0 -100%

Đánh giá kết quả: Độ đúng được biểu thị bằng phần trăm của giá trị trung bình so với giá trị thực

Giá trị trung bình thu được sau khi phân tích phải sai lệch không quá 15% so với giá trị thực

f Độ ổn định (Stability of the sample):

Độ ổn định của chất phân tích được khảo sát cả trong dung dịch chuẩn gốc và trong mẫu sinh học, trong điều kiện và thời gian bảo quản dài, trong quá trình xử lí mẫu và sắc kí Để đánh giá độ ổn định, người ta thường so sánh kết quả phân tích mẫu bảo quản với các mẫu mới chuẩn bị Kết quả phải sai khác không quá 5%

Chương 2 Nguyên - vật liệu, nội dung và phương

pháp nghiên cứu

2.1 nguyên - vật liệu dùng trong nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi

- Chất đối chiếu: RMP (hàm lượng 99,4%), INH (hàm lượng 100,1%), PZA (hàm lượng 99,2%) (Viện kiểm nghiệm thuốc TW)

- Hoá chất, dung môi:

+ Methanol (MeOH), acetonitril (MeCN) loại dùng cho HPLC (Merck -

Đức)

+ Na2HPO4.12H2O loại dùng cho phân tích (Merck - Đức)

- Huyết tương trắng: Viện huyết học truyền máu TW

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị

- Hệ thống HPLC Thermo - Finnigan, detector UV-DAD (Mỹ)

- Máy lắc xoáy Labinco (Hà Lan)

- Máy đo pH Mettler (Thụy Sĩ)

- Máy siêu li tâm lạnh Sigma (Mỹ)

- Cân phân tích Mettler (Thụy Sỹ)

- Bộ màng lọc, đầu lọc đường kính lỗ lọc 0,45 àm; 0,2 àm

- Bộ lọc hút chân không

- Autopipet 1 -10 àl, 10 - 100 àl, 100 - 1000 àl

- Các dụng cụ thủy tinh và trang thiết bị có trong phòng thí nghiệm

2.2 Đối tượng nghiên cứu

2.2.1 Trong nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

- Mẫu trắng: Huyết tương trắng - Viện Huyết học và Truyền máu TW

- Mẫu chuẩn: Hoà tan, pha loãng chất đối chiếu INH, PZA, RMP trong MeOH được các dung dịch chuẩn gốc với được các nồng độ thích hợp Cho dung dịch chuẩn gốc vào huyết tương trắng

2.2.2 Trong xác định nồng độ INH, PZA, RMP trong huyết tương bệnh nhân lao uống đồng thời ba thuốc

Mẫu thử: Huyết tương bệnh nhân sau khi uống đồng thời INH, PZA, RMP Nghiên cứu được tiến hành trên bệnh nhân lao phổi AFB (+): Bệnh nhân 16 tuổi trở lên, chức năng gan thận bình thường (biểu hiện bằng các chỉ

số ure, creatinin, ALT, AST trong giới hạn bình thường), điều trị bằng phác đồ

có RMP, INH, PZA Bệnh nhân đang điều trị nội trú tại Bệnh viện Lao và bệnh phổi Trung ương Chấp thuận tình nguyện tham gia nghiên cứu

2.2.3 Trong hiệu chỉnh nồng độ thuốc trong huyết tương

Huyết tương bệnh nhân lao phổi AFB (+) đang điều trị bằng INH, PZA, RMP đã được xác định là đối tượng bệnh nhân cần hiệu chỉnh liều điều trị

2.3 nội dung nghiên cứu

 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời INH, PZA, RMP trong huyết tương bằng HPLC:

- Quy trình xử lý mẫu: khảo sát các điều kiện xử lý mẫu INH, PZA, RMP trong huyết tương như: chọn các thuốc thử kết tủa protein với các thể tích khác nhau, thời gian lắc xoáy, tốc độ li tâm và thời gian li tâm để lựa chọn phương pháp xử lí mẫu thích hợp

- Lựa chọn điều kiện sắc ký, xây dựng phương pháp phân tích đảm bảo phân tách được riêng INH, PZA, RMP và tách khỏi các thành phần tạp trong huyết tương cho phép xác định lượng INH, PZA, RMP có trong mẫu với độ chính xác thích hợp

- Thẩm định phương pháp phân tích với các chỉ tiêu: tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng, độ chính xác, độ đúng, độ tìm lại, độ ổn định

 ứng dụng phương pháp đã xây dựng xác định nồng độ INH, PZA, RMP trong huyết tương bệnh nhân lao uống đồng thời ba thuốc trên nhằm phục vụ việc hiệu chỉnh liều ở một số bệnh nhân

2.4 phương pháp nghiên cứu

2.4.1 xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

2.4.1.1 Xây dựng phương pháp phân tích

- Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương:

Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lý mẫu INH, PZA, RMP trong huyết tương như: các thuốc thử kết tủa protein với các thể tích khác nhau, thời gian lắc xoáy, tốc độ li tâm, thời gian li tâm

- Xác định điều kiện sắc ký:

Khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống sắc ký HPLC Thermo - Finnigan với các điều kiện sắc ký khác nhau như:

+ Dùng sắc kí phân bố pha đảo và tiến hành khảo sát trên các cột Alltech C18(250 x 4,6 mm; 5àm), Hypersil ODS (150 x 4,6 mm; 5àm), C18 Gemini (250 x 4,6 mm; 5àm), phenyl, CN, với các kích thước cột khác nhau, của các hãng khác nhau

+ Pha động MeCN - đệm dinatri hydrophosphat pH thay đổi

+ Thay đổi thể tích tiêm mẫu

+ Thay đổi lưu lượng dòng

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiến hành định lượng INH, PZA, RMP trong huyết tương bệnh nhân bằng phương pháp HPLC với detector UV - DAD

2.4.1.2 Thẩm định phương pháp

Để đảm bảo phương pháp phân tích định lượng đã xây dựng đạt yêu cầu ứng dụng phân tích thực tế thì phương pháp đó cần được thẩm định với theo các chỉ tiêu: tính chọn lọc, độ chính xác, độ đúng, giới hạn định lượng, độ ổn

định

a Tính chọn lọc:

Chuẩn bị 5 mẫu như sau:

Mẫu 1: huyết tương trắng

Mẫu 2: huyết tương trắng thêm INH

Mẫu 3: huyết tương trắng thêm PZA

Mẫu 4: huyết tương trắng thêm RMP

Mẫu 5: huyết tương trắng thêm INH, PZA, RMP

So sánh sắc đồ của mẫu phân tích (mẫu 2, 3, 4, 5) với sắc đồ của mẫu huyết tương trắng (mẫu 1)

b Khoảng nồng độ tuyến tính:

- Chuẩn bị một thang nồng độ chuẩn của 3 chất trong 500 àl huyết tương trắng để được các nồng độ như sau:

Mẫu 1: có 2 àg/ml INH, 5 àg/ml PZA và 2 àg/ml RMP

Mẫu 2: có 4 àg/ml INH, 10 àg/ml PZA và 5 àg/ml RMP

Mẫu 3: có 6 àg/ml INH, 20 àg/ml PZA và 10 àg/ml RMP

Mẫu 4: có 8 àg/ml INH, 40 àg/ml PZA và 20 àg/ml RMP

Mẫu 5: có 10 àg/ml INH, 80 àg/ml PZA và 30 àg/ml RMP

Thiết lập mối tương quan giữa đáp ứng phân tích và nồng độ hoạt chất ứng với từng hoạt chất thể hiện bằng đường hồi qui tuyến tính và hệ số tương quan r

c Giới hạn định lượng (LOQ):

- Chuẩn bị các mẫu chứa INH, PZA, RMP trong huyết tương trắng với các nồng độ khác nhau Mỗi mẫu tiến hành 5 lần song song

Mẫu 1: có 1 àg/ml INH; 0,2 àg/ml PZA và 0,2 àg/ml RMP

Mẫu 2: có 2 àg/ml INH; 0,5 àg/ml PZA và 0,5 àg/ml RMP

Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký Tính RSD% của diện tích pic cả 3 chất

ở các nồng độ khảo sát