Xây dựng phương pháp định lượng paracetamol và methionin trong chế phẩm pasafe bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước

Sắc ký lỏng tương tác thân nước sử dụng pha tĩnh và pha động đều phân cực, có thể phân tích được các chất phân cực như acid amin, đồng thời cũng có khả năng lưu giữ các chất có độ phân c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ PHƯƠNG HUẾ

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL VÀ METHIONIN TRONG CHẾ PHẨM PASAFE BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ PHƯƠNG HUẾ

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL VÀ METHIONIN TRONG CHẾ PHẨM PASAFE BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này được hoàn thành tại Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà và ThS Vũ Ngân Bình

Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà và ThS Vũ Ngân Bình là người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo, luôn động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Cuối cùng xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2019

Sinh viên

Vũ Thị Phương Huế

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 2

1.1.1 Đặc điểm về paracetamol và methionin 2

1.1.2 Một số phương pháp phân tích acid amin và paracetamol 4

1.2 Tổng quan về sắc ký lỏng tương tác thân nước 7

1.2.1 Pha tĩnh 7

1.2.2 Pha động 8

1.2.3 Cơ chế tách 9

1.2.4 Ưu điểm 10

1.2.5 Nhược điểm 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.2 Nguyên vật liệu 12

2.2.1 Hóa chất 12

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 12

2.3 Nội dung nghiên cứu 13

2.4 Phương pháp nghiên cứu 13

2.4.1 Khảo sát bước sóng phát hiện 13

2.4.2 Khảo sát pha tĩnh 13

2.4.3 Khảo sát pha động 14

2.4.4 Khảo sát nồng độ định lượng của paracetamol và methionin 15

2.4.5 Thẩm định quy trình 15

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1.Quy trình chuẩn bị mẫu 19

3.1.1 Chuẩn bị mẫu thử 19

3.1.2 Chuẩn bị nền mẫu tự tạo 21

3.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 21

3.1.4 Chuẩn bị các mẫu thử thêm chuẩn 22

3.1.4.1 Các mẫu thử thêm chuẩn methionin 22

3.1.4.2 Các mẫu thử thêm chuẩn paracetamol 23

3.2 Quy trình chuẩn bị dung môi pha động 24

3.3 Khảo sát diều kiện sắc ký 25

3.3.1 Lựa chọn bước sóng phát hiện 25

3.3.2 Khảo sát pha tĩnh 26

3.3.3 Khảo sát pha động 29

3.3.3.1 Khảo sát thành phần pha động 29

3.3.3.2 Khảo sát tốc độ dòng 31

3.3.4 Khảo sát nồng độ định lượng của methionin và paracetamol 32

3.4 Phương pháp phân tích methionin và paracetamol 33

3.5 Thẩm định phương pháp 33

3.5.1 Độ thích hợp hệ thống (system suitability) 33

3.5.2 Độ chọn lọc (selectivity) 34

3.5.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính (linearity) 35

3.5.4 Độ chính xác của phương pháp (precision) 36

3.5.5 Độ đúng (accuracy) 37

3.5.6 Độ ổn định của phương pháp (robustness) 37

3.6 Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm viên nang mềm trên thị trường 42 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 Kết luận 45

4.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Sắc ký đồ

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt

ACN Acetonitrile Acetonitril

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HILIC Hydrophilic Interaction Liquid

Chromatography

Sắc ký lỏng tương tác thân nước

PAR Paracetamol Paracetamol

MET Methionine Methionin

NP - LC Normal Phase Liquid

RSD (%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích acid amin và paracetamol 5 Bảng 2.1 Các điều kiện pha động khảo sát 14 Bảng 3.1 Kết quả độ đồng đều khối lượng của viên nang mềm Pasafe 19 Bảng 3.2 Quy trình pha dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp 22 Bảng 3.3 Quy trình pha các mẫu thêm chuẩn methionin 23 Bảng 3.4 Quy trình pha các mẫu thêm chuẩn paracetamol 24 Bảng 3.5 Quy trình pha các dung dịch formic và formic thêm DEA 25 Bảng 3.6 Kết quả độ ổn định hệ thống 33 Bảng 3.7 Kết quả độ chọn lọc 34 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát đường chuẩn 35 Bảng 3.9 Kết quả độ chính xác của phương pháp 36 Bảng 3.10 Kết quả độ đúng của paracetamol 37 Bảng 3.11 Kết quả độ đúng của methionin 37 Bảng 3.12 Kết quả đánh giá độ ổn định của phương pháp 39 Bảng 3.13 Kết quả định lượng paracetamol trong chế phẩm 43 Bảng 3.14 Kết quả định lượng methionin trong chế phẩm 43

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo paracetamol 2 Hình 1.2 Chuyển hóa paracetamol ở gan 3 Hình 1.3 Công thức cấu tạo methionin 3 Hình 1.4 Chế phẩm viên nang mềm Pasafe 4 Hình 1.5 Cơ chế tách trong HILIC 10 Hình 3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu thử 21 Hình 3.2 Phổ hấp thụ UV của paracetamol và methionin 26 Hình 3.3 Kết quả khảo sát cột Zorbax CN ở bước sóng 210 nm 27 Hình 3.4 Kết quả khảo sát trên các cột silica ở bước sóng 210 nm 28

Hình 3.5 Kết quả khảo sát một số dung môi thân nước trên cột Zorbax

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích

píc và nồng độ của paracetamol và methionin 36 Hình 3.10 Ảnh hưởng chung của các yếu tố khảo sát lên các đáp ứng 40

Hình 3.11 Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên hàm lượng

Hình 3.12 Mức độ ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát lên thời gian lưu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay có nhiều chế phẩm đa thành phần có chứa các acid amin và các hoạt chất thuộc nhóm khác Trong những chế phầm này, các acid amin có thể được sử dụng với mục đích làm tăng tác dụng điều trị và giảm tác dụng không mong muốn của các hoạt chất khác Một trong những chế phẩm có dạng phối hợp như trên là chế phẩm chứa paracetamol và methionin Paracetamol có tác dụng giảm đau, hạ sốt, khi dùng quá liều có thể gây độc tính trên gan Methionin là acid amin có chưa lưu huỳnh, có tác dụng làm giảm độc tính của paracetamol trên gan, phòng ngừa tổn thương gan [2] Có nhiều phương pháp định lượng riêng paracetamol và methionin, nhưng hiện nay chưa có công

bố nào về phương pháp định lượng cả hai hoạt chất trên trong chế phẩm Về mặt hóa học, paracetamol và methionin có tính chất rất khác nhau Paracetamol có độ phân cực trung bình, có thể định lượng được bằng sắc ký lỏng pha đảo Tuy nhiên methionin có độ phân cực mạnh, do đó ít được lưu giữ và không phân tích được bằng sắc ký lỏng pha đảo Sắc

ký lỏng tương tác thân nước sử dụng pha tĩnh và pha động đều phân cực, có thể phân tích được các chất phân cực như acid amin, đồng thời cũng có khả năng lưu giữ các chất có độ phân cực trung bình như paracetamol Chính vì vậy, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây

dựng phương pháp định lượng acid amin trong chế phẩm đa thành phần bằng sắc

ký lỏng tương tác thân nước” trên đối tượng cụ thể là viên nang mềm Pasafe có chứa 2

thành phần là paracetamol và methionin với các mục tiêu như sau:

- Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích paracetamol và methionin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước

- Ứng dụng phương pháp trên để định lượng paracetamol và methionin trong chế phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Đặc điểm về paracetamol và methionin

Paracetamol (PAR), còn được gọi là acetaminophen, được sản xuất lần đầu tiên vào năm 1877 [11] Paracetamol là thuốc giảm đau, hạ sốt, không có hiệu quả điều trị viêm [2] Paracetamol tương đối không độc với liều điều trị và khi dùng dưới sự hướng dẫn của thầy thuốc Liều tối đa được khuyến nghị cho người trưởng thành là từ 3 đến 4 gam một ngày Tuy nhiên, dùng quá liều paracetamol là nguyên nhân chính gây suy gan cấp [2]

Paracetamol có công thức cấu tạo như hình 1.1:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo paracetamol

Danh pháp: N-(4-hydroxyphenyl) acetamid Tên khác: acetaminophen

Công thức phân tử: C8H9NO2 Phân tử lượng: 151,2 g/mol

Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng, không mùi Hơi tan trong nước, rất khó tan trong cloroform, ether, methylen clorid, dễ tan trong dung dịch kiềm, ethanol 96% [1] Bảo quản: 2ºC - 8ºC, tránh ánh sáng

Paracetamol được chuyển hóa chủ yếu ở gan (90%), gắn kết với sunfat và glucuronid, rồi thải ra nước tiểu Một phần (5%) được thải ra nước tiểu dưới dạng không chuyển hóa, 5% còn lại được oxy hóa thành N – acetyl – p – benzoquinone imine (NAPQI) qua cytochrome P450 ở gan NAPQI là chất độc cho tế bào gan Với liều paracetamol thích hợp sẽ chỉ tạo ra lượng nhỏ NAPQI, lượng này nhanh chóng kết hợp với glutathion của gan, tạo thành các chất không độc thải ra nước tiểu Tuy nhiên khi sử dụng paracetamol liều cao, con đường gắn kết với sulfat và glucuronid bị bão hòa, lượng paracetamol bị chuyển thành NAPQI tăng lên Đến khi lượng dự trữ glutathion ở gan giảm xuống khoảng 70%, NAPQI bắt đầu phản ứng với cấu trúc tế bào gan và gây tổn thương tế bào gan [2] Hình 1.2 miêu tả quá trình chuyển hóa paracetamol ở gan

Hình 1.2 Chuyển hóa paracetamol ở gan

Để giảm độc tính của paracetamol trên gan, người ta hay sử dụng acetylcystein và methionin Trong đó, methionin làm tăng cường tổng hợp glutathion, giúp chuyển hóa NAPQI thành chất không độc, được sử dụng để điều trị ngộ độc paracetamol, phòng ngừa tổn thương gan [2] Methionin còn là một acid amin thiết yếu có trong thành phần của chế

độ ăn và trong công thức của các chế phẩm acid amin để nuôi dưỡng Methionin được dùng theo đường uống để làm giảm pH nước tiểu [2]

Methionin (MET) có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.3 Công thức cấu tạo methionin

Danh pháp: acid 2 – amino – 4 – (methylthio) butanoic

Công thức phân tử: C5H11NO2S Phân tử lượng 149,2 g/mol

Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng hay vẩy trắng Hơi tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96% Tan trong các dung dịch acid và hydroxyd kiềm loãng [1]

Trên thị trường có các chế phẩm chứa paracetamol và methionin nhằm mục đích giảm độc tính của paracetamol trên gan, có thể hạn chế việc quá liều paracetamol, gọi chung là co – methiamol như Paradote Ở Việt Nam cũng có chế phẩm viên nang mềm Pasafe với hàm lượng paracetamol 500 mg (hoặc 325 mg) và methionin 100 mg (hoặc 65 mg)

Hình 1.4 Chế phẩm viên nang mềm Pasafe

1.1.2 Một số phương pháp phân tích acid amin và paracetamol

Methionin là một acid amin, có nhóm acid và base do đó có thể sử dụng phép chuẩn độ môi trường khan để định lượng như trong chuyên luận nguyên liệu methionin trong Dược điển Việt Nam V [1] Ngoài ra methionin chứa S (hóa trị + 2), có thể tham gia phản ứng oxy hóa khử Phương pháp chuẩn độ oxy hóa khử bằng iod được sử dụng để định lượng methionin trong chế phẩm viên nén [1] Tuy nhiên muốn định lượng methionin trong hỗn hợp thì các kỹ thuật sắc ký hay được sử dụng Methionin nói riêng

và acid amin nói chung có thể được phân tách và định lượng bằng nhiều kỹ thuật bao gồm sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion áp suất thấp, sắc ký lỏng pha đảo, sắc ký khí, điện di mao quản, điện di mao quản khối phổ, [18] Một trong các kỹ thuật sắc ký được sử dụng phổ biến nhất hiện nay để phân tích acid amin là sắc ký trao đổi ion sử dụng

dẫn xuất sau cột Ninhydrin và o-phthaldialdehyd (OPA) là hai thuốc thử tạo dẫn xuất

được sử dụng phổ biến nhất [18] Phương pháp sắc ký phổ biến khác để tách acid amin là sắc ký pha đảo kết hợp với dẫn xuất hóa trước cột hoặc sau cộtvới các thuốc thử hay được

sử dụng như phenylisothiocyanate (PITC); 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl

carbamat (AQC); o-phthalaldehyd (OPA); 9-fluorenylmethyl cloroformat (FMOC-Cl)

[18] Dẫn xuất hóa nhằm hai mục tiêu: (1) để làm cho acid amin kỵ nước hơn và (2) để có thể phát hiện bằng cách sử dụng độ hấp thụ hoặc huỳnh quang [18]

Về phân tích paracetamol, có nhiều phương pháp định lượng paracetamol trong chế phẩm đơn thành phần cũng như đa thành phần Do paracetamol hấp thụ UV tốt nên phương pháp đo quang hay được sử dụng để định lượng Ngoài ra, để phân tích paracetamol trong hỗn hợp còn sử dụng sắc ký pha đảo với cột C8, C18

Một một số phương pháp nghiên cứu phân tích acid amin và paracetamol được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích acid amin và paracetamol

Pha động: đệm phosphate, acetonitril, nước, methanol

Pha tĩnh: cột Hypersil BDS C18

2

D Fekkes và cộng sự

[7]

Dịch sinh học

Trên 40 acid amin

RPLC Dẫn xuất trước cột bằng o-phthaldialdehyd Pha tĩnh: cột Spherisorb ODS

3

Dược điển Việt Nam V

[1]

Chế phẩm viên nén

Methionin Chuẩn độ

Thực hiện phản ứng methionin với iod, chuẩn độ iod dư bằng natri thiosulfat, chỉ thị

hồ tinh bột

Dược điển Việt Nam V Nguyên

liệu Methionin Chuẩn độ đo thế trong

acid acetic khan Dung dịch chuẩn: Acid percloric 0,1 N

5

Dược điển Việt Nam V

[1]

Chế phẩm thuốc tiêm truyền

Paracetamol HPLC

Cột: C18 Pha động: nước và methanol

6

Dược điển Việt Nam V

[1]

Chế phẩm viên nang cứng

Paracetamol Đo quang

Paracetamol, cafein, phenylephrine hydroclorid, dextromethophan hydrobromid

HPLC Cột C8Pha động: đệm natri heptan sulfonat và acetonitril chế độ gradient

Hiện nay, chưa có công bố nào phân tích paracetamol và methionin trên cùng một phương pháp Các phương pháp phân tích acid amin nói chung và methionin nói riêng đa phần là tạo dẫn xuất [7], [9], [12] còn phân tích paracetamol thì sử dụng các phương pháp khá thông dụng như đo quang, sắc ký pha đảo,… Khi phân tích acid amin cùng với các chất có độ phân cực trung bình hoặc yếu như paracetamol thông thường phải sử dụng hai phương pháp khác nhau, một phương pháp RPLC trực tiếp cho chất có độ phân cực trung bình hoặc yếu và một phương pháp RPLC kết hợp dẫn xuất hóa cho các acid amin Sắc ký lỏng tương tác thân nước là kỹ thuật sắc ký có lưu giữ tốt với các chất phân cực như acid amin, đồng thời cũng có khả năng lưu giữ các chất có độ phân cực trung bình như paracetamol Trong công thức của methionin có lưu huỳnh nên có khả năng hấp thụ quang nên tôi tiến hành nghiên cứu bằng HILIC trên detector UV để xây dựng phương pháp tách và định lượng methionin và paracetamol trong chế phẩm

1.2 Tổng quan về sắc ký lỏng tương tác thân nước

Sắc ký lỏng tương tác thân nước (hydrophilic interaction liquid chromatography – HILIC) là một biến thể của sắc ký lỏng thông thường, có hiệu quả trong việc tách các chất phân cực và không tĩnh điện, như các acid amin [16], kháng sinh nhóm amino glycosid [14], peptid [10],… HILIC sử dụng pha động phân cực (như sắc ký pha đảo RP - LC) và pha tĩnh phân cực (như sắc ký pha thuận NP - LC) So với NP - LC, HILIC sử dụng dung môi phân cực ít độc hại hơn Còn so với RP - LC, HILIC lưu giữ các chất phân cực tốt hơn HILIC khắc phục được các nhược điểm của các kỹ thuật sắc ký trước đó nên hiện nay đang được ứng dụng rộng rãi hơn

1.2.1 Pha tĩnh

Giống như NP – LC, HILIC sử dụng các pha tĩnh phân cực, khi tiếp xúc với pha động phân cực sẽ duy trì một lớp chất lỏng thân nước bao trên bề mặt pha tĩnh, lưu giữ các chất phân tích Khi tăng nhóm chức phân cực trên pha tĩnh, lớp chất lỏng thân nước trên bề mặt pha tĩnh tăng lên, làm tăng thời gian lưu giữ chất phân cực

Pha tĩnh trong HILIC phổ biến nhất là silica và các dẫn xuất của nó như amino, diol hay cyano,… Ngoài ra, các pha tĩnh polymer cũng có thể được sử dụng trong HILIC [6] Tuy nhiên, có thể do giá thành đắt và độ phân giải thấp hơn so với các cột silica nên số lượng cột polyme trên thị trường không nhiều cũng như ít nghiên cứu về HILIC trên cột polyme

Dựa vào cấu tạo hóa học, pha tĩnh silica lại được chia làm hai loại là: silica không dẫn xuất và silica dẫn xuất hóa

- Silica không dẫn xuất:

Chất phân tích được lưu giữ lại mạnh mẽ bởi liên kết hydro và tương tác trao đổi với nhóm silanol (-SiOH) Trong đó nhóm –SiOH đóng vai trò thiết yếu tạo nên bề mặt phân cực của silica

Ưu điểm của pha tĩnh silica không dẫn xuất là không bị pha động pH thấp thủy phân, cắt các liên kết, rửa trôi như các pha tĩnh pha liên kết Về độ nhạy, cột silica cải thiện độ nhạy từ 2 đến 10 lần so với các cột pha đảo khi tách các hợp chất phân cực[8]

không dẫn xuất còn không ổn định về mặt hóa học ở pH lớn hơn 8 do có sự hòa tan của silica

- Silica dẫn xuất hóa:

Các pha tĩnh dẫn xuất hóa thu được thông qua việc biến đổi hóa học bề mặt silica và được chia thành các nhóm theo trạng thái tích điện của chúng, bao gồm: trung tính (amid, diol, cyanopropyl, cyclodextrin,…), lưỡng cực (sulfoalkyl betain,…), tích điện dương (amino silica,…), tích điện âm (poly aspartic, poly sulfoethyl A, poly succinimid silica…)

 Amino silica: Cột amino silica có chứa các aminopropyl liên kết với silica Các chất phân tích được lưu giữ bởi liên kết hydro và tương tác trao đổi ion với các nhóm -SiOH Các hợp chất có tính acid có ái lực mạnh hơn với các cột amino silica, đôi khi dẫn đến sự hấp phụ không thuận nghịch Mặt khác, cột amino silica còn kém ổn định khi dung môi rửa giải là nước, dẫn đến lưu giữ chất kém và hình dáng píc xấu đi [8]

 Cyanopropyl silica: Ít tìm thấy các ứng dụng của nó trong HILIC Mặc dù được xem là pha phân cực nhưng do không có liên kết hydro nên sự lưu giữ chất phân tích trên cột này rất kém Và pha tĩnh nãy cũng kém ổn định cơ học khi hoạt động trong điều kiện dung môi phân cực và rất phân cực

 Poly succinimid silica: Một số pha tĩnh silica liên kết phân cực được tạo thành dựa trên phản ứng cộng hóa trị của poly succinimid với aminopropyl silica Phản ứng tạo ra một lớp bề mặt polyamide/imid liên kết ở nhiều vị trí Nhiều pha tĩnh poly succinimid đã được ứng dụng trong phân tách HILIC nhưng ngày càng ít được sử dụng do hiệu quả tách thấp hơn nhiều so với các pha tĩnh HILIC gần đây [8]

1.2.2 Pha động

HILIC thường sử dụng pha động là lượng lớn dung môi hữu cơ đồng tan với nước, kết hợp với một dung môi thân nước [4] Dung môi hữu cơ thường được sử dụng nhất cho pha động là acetonitril (ACN) Ngoài ra còn sử dụng các dung môi hữu cơ khác như tetrahydrofuran, dioxin, các rượu nồng độ cao [5] Lượng dung môi hữu cơ chiếm tỷ lệ từ 60% – 98% lượng pha động Dung môi thân nước có thể là nước, muối, hoặc đệm,…, cần phải duy trì tỷ lệ thấp nhất là 2 - 3% để hydrat hóa hoàn toàn các hạt pha tĩnh [17] Khi

đó, chất phân tích sẽ phân bố vào cả hai pha

Các dung môi được sắp xếp theo chiều lực rửa giải chất phân tích tăng dần như sau: aceton < isopropanol ~ propanol < acetonitril < ethanol < dioxin < dimethyl formamid ~ methanol < nước [6] Theo đó, các chất kém phân cực sẽ được rửa giải nhanh hơn các chất phân cực, khi giảm độ phân cực của pha động sẽ làm tăng thời gian lưu của chất phân tích

pH của pha động ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tách và thời gian lưu do thay đổi

sự phân cực của chất phân tích và pha động, cũng như trạng thái tồn tại của bề mặt pha tĩnh, dẫn đến những thay đổi khác biệt trong việc lưu giữ, do vậy làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích Dung môi thân nước hay được sử dụng là các đệm nhằm ổn định

pH pha động Loại đệm được dùng phổ biến là amoni acetat, amoni format, phosphat (ứng với vùng acid), đệm triethylamin, amoni (ứng với vùng base)… với nồng độ thường sử dụng là 2 – 20 mM (nồng độ 20 mM chỉ sử dụng trong trường hợp tỷ lệ dung môi hữa cơ trong pha động nhỏ hơn 90%) [19] Đối với các chất phân tích có nhiều dạng ion hóa, pH thường được điều chỉnh để đảm bảo rằng các chất phân tích chỉ tồn tại một dạng ion duy nhất và cũng được dùng để điều chỉnh trạng thái tồn tại của chất phân tích và kiểm soát thời gian lưu [6] Đối với các chất phân tích trung tính hoặc trạng thái tồn tại không thay đổi trong khoảng pH 2 - 8, không cần sử dụng đệm trong pha động Ngoài ra nồng độ chất tan trong pha động cũng ảnh hưởng đến việc lưu giữ Thông thường, nồng độ tăng làm giảm thời gian lưu

HILIC có thể được thực hiện ở chế độ đẳng dòng với nồng độ dung môi hữu cơ cao; hoặc chế độ gradient với tỷ lệ cao dung môi hữu cơ cao khi bắt đầu và kết thúc với tỷ lệ thấp dung môi hữu cơ

1.2.3 Cơ chế tách

Về cơ bản có ba cách để mô phỏng về cơ chế tách của HILIC Cách thứ nhất là sự phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh; thứ hai là sự hấp phụ của chất phân tích lên bề mặt của pha tĩnh, thứ ba là pha động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh, sau đó các chất phân tích phân bố lên lớp hấp phụ này [6] Hiện nay, mô phỏng thứ ba được thừa nhận rộng rãi Hình 1.4 minh họa cơ chế tách này:

Hình 1.5 Cơ chế tách trong HILIC

Theo cơ chế này, khi pha động di chuyển qua pha tĩnh phân cực, một phần pha động tương tác với pha tĩnh, tạo thành một phần của pha tĩnh, đó là một lớp chất lỏng chứa nước bao trên bề mặt pha tĩnh Chất phân tích khi qua cột sắc ký sẽ được phân bố giữa pha động và lớp chất lỏng thân nước bao xung quanh pha tĩnh này Như vậy, chất phân tích càng phân cực sẽ được lưu giữ càng lâu trong lớp nước trên bề mặt pha tĩnh Nói cách khác, quá trình phân tách dựa trên độ phân cực của hợp chất và lớp solvate hóa trên bề mặt pha tĩnh Trong trường hợp pha tĩnh có mang điện tích, chất phân tích có thể thêm các tương tác tĩnh điện với pha tĩnh

độ dòng cao , giảm thời gian phân tích Pha động giàu dung môi hữu cơ cũng làm tăng tốc

độ khuếch tán chất tan trong pha động, tăng khối lượng chất tan được vận chuyển

HILIC còn có nhiều ưu điểm so với kỹ thuật RPLC hay NPLC Trong phân tích các hợp chất rất phân cực, HILIC có khả năng lưu giữ tốt các chất này, khắc phục được nhược điểm của RP – LC Còn đối với NP – LC, tuy có thể lưu giữ các chất phân cực với thời gian phù hợp nhưng lại sử dụng các dung môi pha động đắt tiền, độc hại và không thân

thiện với môi trường, hòa tan kém các chất phân cực Vì vậy, HILIC là lựa chọn tối ưu hơn trong trường hợp này

Đối với các chất phân cực hấp thụ UV kém, HILIC có thể giúp đơn giản hóa quá trình chuẩn bị mẫu (không tạo dẫn xuất) sơ với RPLC nhờ khả năng định tính các chất tại bước sóng thấp

HILIC có khả năng áp dụng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS [8] nhờ pha động có chứa lượng lớn dung môi hữu cơ đồng tan với nước, thích hợp với LC-MS Trong khi RPLC có chưa tỷ lệ nước cao trong pha động nên không phù hợp với bề mặt LC-MS, còn NPLC có pha động không những độc hại mà còn rất khó hòa tan các hợp chất phân cực, giảm tỷ lệ ion hóa của chất phân tích, có thể gây nhiễu nền hoặc tín hiệu kém [9] khi phân tích bằng LC-MS

1.2.5 Nhược điểm

Bên cạnh những ưu điểm kể trên, kỹ thuật HILIC còn có các nhược điểm như: thời gian đtạ cân bằng lâu hơn RPLC; pha tĩnh silica kém lưu giữ các anion; tương tác phức tạp, nhiều lớp, khó kiểm soát hơn RPLC và NPLC; phụ thuộc quá nhiều vào dung môi acetonitril, khó tìm dung môi thay thế

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là viên nang mềm Pasafe Công thức của mỗi viên Pasafe như sau:

+Paracetamol: 500 mg +Methionin: 100 mg +Tá dược: PEG 400, gelatin, glycerin, dung dịch sorbitol 70%, methyl paraben, propyl paraben, ethyl vanillin, titan dioxyd, tartrazin yellow, brilliant blue, allura red AC, nước tinh khiết

2.2 Nguyên vật liệu

2.2.1 Hóa chất

- Chuẩn đối chiếu methionin: Sigma (Độ tinh khiết 98%, số lô M9625)

- Chuẩn đối chiếu paracetamol: Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương (Độ tinh khiết

100,04%, số lô 0415019.04)

- Viên nang mềm Pasafe: Nhà sản xuất Công ty liên doanh dược phẩm Mebiphar - Austrapharm; số lô sản xuất: 0080818; số đăng ký: VD-8283-09; hạn dùng:

08/8/2020

- Tá dược: PEG 400, gelatin, glycerin, dung dịch sorbitol 70%, methyl paraben,

propyl paraben, ethyl vanillin

- Acetonitril dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (Merck – Đức)

- Acid formic, acid acetic, amoni acetat, natri hydroxyd, diethylamin (Merck – Đức)

- Nước cất hai lần

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 series và phần mềm Chemstation

- Cột sắc ký: Cột Supelco Ascentis Silica (250 x 4,6 mm, 5µm) (Sigma Aldrich); cột Hypersil Silica (200 x 4,6 mm, 5 µm) (Agilent); cột Zorbax CN (150 x 4,6 mm, 5µm) (Agilent); cột Zorbax Rx Silica (150 x 4,6 mm, 5µm) (Agilent); cột Apollo

Silica Alltech (150 x 4,6 nm, 5µm) (Hichrom)

- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Hà Lan)

- Máy lắc xoáy Labinco L46 (Đài Loan)

- Máy ly tâm Kubota 6500

- Phễu lọc Bunchner, màng lọc cellulose 0,45 µm

- Màng lọc mẫu cellulose 0,45 µm

- Cân phân tích Sartorius TE214S (Đức)

- Micropipet 10 – 100 µL ABMATE pro, 100 -1000 µL Nichipet EX

- Ống ly tâm 2 mL

- Pipet chính xác 0,5 mL; 1 mL; 1,5 mL; 2 mL

- Bình định mức 5 mL; 10 mL; 20 mL; 25 mL; 50 mL

- Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, ống đong, vial

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích paracetamol và methionin trong chế phẩm viên

nang mềm bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC)

- Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, độ ổn định hệ thống theo

hướng dẫn của ICH Q2B và mô hình Plackett Burman - linear

- Ứng dụng phương pháp trên xác định hàm lượng paracetamol và methionin trong

chế phẩm viên nang mềm Pasafe trên thị trường

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Khảo sát bước sóng phát hiện

Tiến hành quét phổ trên píc sắc ký của hai chất chuẩn trong khoảng bước sóng từ

210 đến 400 nm Lựa chọn bước sóng thích hợp của mỗi chất

2.4.2 Khảo sát pha tĩnh

Tiến hành khảo sát các cột sau:

+ Cột Zorbax CN kích thước 150 x 4,6 mm, 5µm (Agilent)

+ Cột Supelco Ascentis Silica kích thước 250 x 4,6 mm, 5 µm (Sigma Aldrich) + Cột Hypersil Silica kích thước 200 x 4,6 mm, 5 µm (Agilent)

+ Cột Zorbax Rx Silica kích thước 150 x 4,6 mm, 5µm (Agilent)

Đánh giá kết quả dựa trên độ chọn lọc, độ phân giải, độ cân xứng píc sắc ký và thời gian phân tích để lựa chọn cột sắc ký phù hợp

2.4.3 Khảo sát pha động

Tiến hành khảo sát thành phần, tỷ lệ (v/v), nồng độ, và tốc độ dòng (f) của pha động như bảng 2.1 Dựa vào khả năng tách các chất, mức độ ổn định của đường nền, hình dáng píc và thời gian lưu của chất phân tích để lựa chọn pha động

Bảng 2.1 Các điều kiện pha động khảo sát Pha tĩnh Pha động Tỷ lệ f (mL/phút)

Cột Zorbax

CN

ACN : CH3COONH4 15 mM 60:40 0,8 ACN : CH3COOH 15 mM 60:40 0,8 ACN : HCOOH 10 mM 60:40 0,8 ACN : (HCOOH 10 mM + DEA 5 mM) 60:40 0,6 ACN : (HCOOH 10 mM + DEA 7,5 mM) 60:40 0,6 ACN : (HCOOH 10 mM + DEA 10 mM) 60:40 0,6

ACN : (HCOOH 2 mM + DEA 1 mM)

60:40 0,6 55:45 0,6 50:50 0,6 ACN : (HCOOH 2 mM + DEA 1,25 mM) 60:40 0,6 ACN : (HCOOH 10 mM + TEA 0,5 mM) 60:40 0,6 Cột Supelco

Ascentis Silica

ACN : CH3COONH4 15 mM 70:30 0,8 ACN : CH3COOH 15 mM 75:25 0,8 Cột Hypersil

Silica

ACN : CH3COONH4 15 mM 75:25 0,8 ACN : CH3COOH 15 mM 70:30 0,8

Cột Zorbax Rx

Silica

ACN : CH3COONH4 15 mM 70:30 0,8 ACN : CH3COOH 15 mM 75:25 0,8 ACN : HCOOH 10 mM 60:40 0,6 ACN : (HCOOH 10 mM + DEA 10 mM) 60:40 0,6

ACN : (HCOOH 10mM + DEA 5 mM)

60:40 0,5 60:40 0,6 60:40 0,7

(Ghi chú: ACN: acetonitril, DEA: diethylamin, TEA: triethanolamin)

2.4.4 Khảo sát nồng độ định lượng của paracetamol và methionin

Khảo sát hỗn hợp chuẩn hỗn hợp paracetamol và methionin ở 2 ngưỡng nồng độ cùng tỷ lệ PAR : MET = 5:1 (như tỷ lệ trong công thức chế phẩm) là PAR là 200 ppm – MET 40 ppm và PAR 100 ppm - MET 20 ppm

Đánh giá kết quả dựa trên diện tích píc và sự đáp ứng tuyến tính giữa diện tích píc

Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống

phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa paracetamol và methionin (chuẩn bị ở phần sau) Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích píc Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích Yêu cầu các giá trị thời gian lưu có RSD% 2,0%, diện tích píc có RSD% 2%

b Độ chọn lọc (selectivity)

- Tính chọn lọc của phương pháp: Là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần

phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu trắng, píc của chất cần phân tích tách hoàn toàn với các píc tạp Trên sắc

ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện píc có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn

- Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp paracetamol và methionin, dung dịch thử và nền mẫu tự tạo, dung môi pha mẫu từ các thành phần của chế phẩm với

- Thời gian lưu píc paracetamol và methion của dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung dịch thử phải tương đương nhau Píc trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các píc khác trong nền mẫu Nền mẫu tự tạo và dung môi pha mẫu không xuất hiện píc ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của píc paracetamol và methionin trên sắc ký đồ của các dung dịch chuẩn Nếu có, đáp ứng của píc tạp phải 1,0% so với đáp ứng píc của mẫu chuẩn Hệ số tinh khiết píc methionin và paracetamol trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử xấp xỉ 1,0 Hệ số chồng phổ UV của píc methionin và paracetamol thu được trong sắc ký đồ dung dịch thử và phổ UV của píc tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn xấp xỉ 1,0

c Đường chuẩn và khoảng tuyến tính (linearity)

- Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo được và nồng độ chất phân tích

- Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được

và nồng độ các chất phân tích

Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp, có nồng độ paracetamol và methionin lần lượt bằng 50%, 75%, 100%, 125%, và 150% nồng độ định lượng và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu đo được và nồng độ Vẽ đồ thị phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ

Đánh giá đường chuẩn dựa vào giá trị và độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn (Δ)

Yêu cầu: r ≥ 0,995

Hệ số chắn tại nồng độ 100%: Y% =

-2,0% Y% 2,0%

d Độ chính xác của phương pháp (precision)

Độ chính xác thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện xác định

+ Độ lặp lại của phương pháp (repeatability): Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của

một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn Tiến hành thí nghiệm 6 lần với cùng một nồng độ mẫu thử, xác định độ lệch tương đối RSD (%) của hàm lượng

+ Độ chính xác trung gian (intermediate precision): Bố trí thí nghiệm tương tự

phần độ lặp lại của phương pháp nhưng tiến hành vào thời gian khác, đổi kiểm nghiệm viên và phân tích trên hệ sắc ký lỏng khác

̅: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

N: Số lần thử nghiệm

Yêu cầu:

+Độ lặp lại: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương

đối RSD (%) của hàm lượng paracetamol và methionin không quá 2%

+ Độ chính xác trung gian: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử trong cùng một ngày

và 12 lần thử trong hai ngày khác nhau, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của hàm lượng paracetamol và methionin không quá 2%

e Độ đúng (accuracy)

Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị

trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng

Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị

lý thuyết

Thêm vào mẫu thử đã được xác định hàm lượng hoạt chất một lượng chính xác chất chuẩn ở 03 mức 75%, 100% và 125% so với hàm lượng paracetamol và methionin có trong mẫu khảo sát Độ thu hồi được tính theo công thức

: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn (µg/mL)

Cn: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử ( g mL)

: nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) ( g/mL)

Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi (98 – 102%) ở mỗi mức nồng độ và giá trị RSD (%) của tỷ

lệ thu hồi phải 2,0 % ở mỗi mức nồng độ

f Độ ổn định của phương pháp (robustness)

Độ ổn định của phương pháp là mức độ lặp lại các kết quả phân tích khi có sự thay đổi nhỏ một số thông số của phương pháp Trong nghiên cứu này, áp dụng mô hình Plackett Burman – linear [21], tiến hành khảo sát sự thay đổi của nồng độ acid formic, nồng độ DEA, tỷ lệ ACN, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện methionin, bước sóng phát hiện paracetamol và trên hai cột cùng bản chất pha tĩnh silica, cùng kích thước là Zorbax

Rx Silica và Apollo Silica Alltech Kết quả đánh giá dựa vào giá trị hàm lượng, thời gian lưu và hệ số cân xứng píc của methionin và paracetamol Tiến hành sắc ký trên 01 mẫu trắng, 01 mẫu chuẩn hỗn hợp paracetamol 40 ppm và methionin 40 ppm, 01 mẫu thử A (dùng cho định lượng methionin, trình bày ở phần sau) và 01 mẫu thử B (dùng cho định lượng paracetamol, trình bày ở phần sau)

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): %

- Tương quan hồi quy tuyến tính:

Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích píc sắc ký và nồng

độ chất phân tích: Y = aC + b

Trong đó: Hệ số góc a: Hàm SLOPE; Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT; Hệ số tương quan R: Hàm CORREL

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1.Quy trình chuẩn bị mẫu

3.1.1 Chuẩn bị mẫu thử

Dựa vào tính chất độ tan của paracetamol và methionin [1], lựa chọn dung môi hòa tan thuốc trong nang là NaOH 0,01%, thu được một hỗn hợp đục trắng Do có các tá dược không tan hết trong NaOH, đem ly tâm hỗn hợp với các tốc độ 6000 vòng/ phút, 9000 vòng/phút, 12000 vòng/phút Kết quả cho thấy với tốc độ 12000 vòng/phút thu được một lớp dịch trong ở dưới Lấy lớp dịch trong pha loãng bằng dung môi pha mẫu là pha động tương ứng với các pha động khảo sát được dung dịch thử

Xác định khối lượng trung bình và độ đồng đều khối lượng của chế phẩm như sau: Cân 20 viên nang, được khối lượng m1 = 28,83 (g) Lấy thuốc ra khỏi nang, lau sạch thuốc trên vỏ nang, tráng sạch vỏ bằng ACN, để khô trong bình hút ẩm Cân khối lượng

20 vỏ đã làm sạch và khô, được khối lượng m2 = 8,16 (g) Tính lượng thuốc trung bình trong 1 viên nang mTB =

= 1,03 (g) tương ứng với 100 mg methionin và 500 mg paracetamol Trộn đều lượng thuốc trong 20 nang Kết quả thu được như bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả độ đồng đều khối lượng của viên nang mềm Pasafe

m nang - m vỏ (g)

m - m TB (g)

Quy trình tóm tắt chuẩn bị mẫu thử được trình bày trong hình 3.1

Hình 3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu thử

3.1.2 Chuẩn bị nền mẫu tự tạo

Do các nhà sản xuất không công bố tỷ lệ thành phần tá dược và thành phần nào được cho vào vỏ, thành phần nào được cho vào ruột nên chuẩn bị nền mẫu tự tạo bằng cách trộn tất cả các thành phần tá dược: PEG 400, dung dịch sorbitol 70%, methyl paraben, propyl paraben, ethyl vanillin (trừ các chất màu) với tỷ lệ như hướng dẫn trong tài liệu tham khảo ―Handbook of pharmaceutical‖ phần cho thuốc nang [15], sau đó xử lý như mẫu thử được dung dịch mẫu nền tự tạo

3.1.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn đơn gốc paracetamol: Cân chính xác khoảng 10,0 mg paracetamol chuẩn vào bình định mức 10,0 mL Hòa tan và định mức vừa đủ bằng NaOH 0,01 M, được dung dịch paracetamol chuẩn có nồng độ khoảng 1 mg/mL (1000 ppm)

- Dung dịch chuẩn paracetamol 40 ppm: Hút chính xác 1,00 mL dung dịch chuẩn gốc paracetamol vào bình định mức 25,0 mL Định mức vừa đủ bằng NaOH 0,01 M

- Dung dịch chuẩn đơn gốc methionin: Cân chính xác khoảng 10,0 mg methionin chuẩn vào bình định mức 10,0 mL Hòa tan và định mức vừa đủ bằng NaOH 0,01 M, được dung dịch methionin chuẩn có nồng độ khoảng 1,00 mg/mL (1000 ppm)

- Dung dịch chuẩn methionin 40 ppm: Hút chính xác 1,00 mL dung dịch chuẩn gốc

- Dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp paracetamol và methionin với các nồng độ bằng 50%, 75%, 100%, 125%, 150% nồng độ định lượng của chúng: Hút chính xác x mL chuẩn gốc paracetamol và x mL chuẩn gốc methionin cho vào bình định mức thích hợp, định mức bằng dung dịch NaOH 0,01 M

Bảng 3.2 Quy trình pha dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp

C%

Nồng độ paracetamol (ppm)

Nồng độ methionin (ppm)

Hệ số pha loãng x (mL)

Định mức (mL)

3.1.4 Chuẩn bị các mẫu thử thêm chuẩn

3.1.4.1 Các mẫu thử thêm chuẩn methionin

- Chuẩn bị 03 mẫu methionin chuẩn 500 ppm: Cân chính xác khoảng 25,0 mg methionin chuẩn vào bình định mức 5,0 mL Hòa tan và định mức vừa đủ bằng NaOH 0,01 M, được dung dịch methionin chuẩn 0,5 mg/mL (5000 ppm)

- Chuẩn bị 09 mẫu thử 50% methionin: Cân chính xác khoảng 52 mg thuốc trong nang vào bình định mức 5,0 mL

- Thêm các lượng chuẩn methionin ở mức 25%, 50%, 75% vào mẫu thử 50% methionin, mỗi nồng độ chuẩn làm 3 mẫu Trộn đều và định mức bằng NaOH 0,01% Hỗn hợp thu được ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút Hút lớp dung dịch phía dưới lọc qua màng 0,45 µL Hút chính xác 0,50 mL dung dịch đã lọc vào bình định mức 25,0 mL; định mức bằng MP, được 9 dung dịch ở mức nồng độ khoảng 75%, 100%, 125%

Các dung dịch được ly tâm, lọc Hút 0,50 mL dịch lọc vào bình định mức 25,0 mL và định mức bằng MP Bảng 3.3 dưới đây mô tả cách pha của 9 dung dịch trên

Bảng 3.3 Quy trình pha các mẫu thêm chuẩn methionin

STT

Mức nồng độ (%)

Khối lượng thử (mg)

VMETchuẩn 1 (mL)

VMETchuẩn 2 (mL)

VMETchuẩn 3 (mL)

Bình định mức (mL)

3.1.4.2 Các mẫu thử thêm chuẩn paracetamol

- Chuẩn bị 03 mẫu paracetamol chuẩn 500 ppm: Cân chính xác khoảng 25,0 mg paracetamol chuẩn vào bình định mức 5,0 mL Hòa tan và định mức vừa đủ bằng NaOH 0,01 M, được dung dịch paracetamol chuẩn 0,5 mg/mL (5000 ppm)

- Chuẩn bị 9 mẫu thử 50% paracetamol: mỗi mẫu gồm khoảng 10,4 mg thuốc trong nang vào bình định mức 5,0 mL

- Thêm các lượng chuẩn paracetamol ở mức 25%, 50%, 75% vào mẫu thử 50% paracetamol, mỗi nồng độ chuẩn làm 3 mẫu Trộn đều và định mức bằng NaOH 0,01% Hỗn hợp thu được ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút Hút lớp dung dịch phía dưới lọc qua màng 0,45 µL Hút chính xác 0,50 mL dung dịch đã lọc vào bình định mức 25,0 mL; định mức bằng MP, được 9 dung dịch ở mức nồng độ khoảng 75%, 100%, 125%

Các dung dịch được ly tâm, lọc Hút 0,50 mL dịch lọc vào bình định mức 25,0 mL và định mức bằng MP Bảng 3.4 dưới đây mô tả cách pha của 9 dung dịch trên

Bảng 3.4 Quy trình pha các mẫu thêm chuẩn paracetamol

STT

Mức nồng độ (%)

Khối lượng thử (mg)

VPARchuẩn 1 (mL)

VPARchuẩn 2 (mL)

VPARchuẩn 3 (mL)

Bình định mức (mL)

3.2 Quy trình chuẩn bị dung môi pha động

- Dung dịch muối amoni acetat gốc 1000 mM: Cân chính xác khoảng 3,854 g amoni acetat vào cốc có mỏ, hòa tan bằng 30 mL nước, chuyển vào bình định mức 50,0 mL; thêm nước vừa đủ, lắc đều

- Dung dịch muối amoni acetat 20 mM: Hút chính xác 4,00 mL amoni acetat gốc vào bình định mức 200,0 mL; định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều

- Dung dịch muối amoni acetat 15 mM: Hút chính xác 3,00 mL amoni acetat gốc vào bình định mức 200,0 mL; định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều

- Dung dịch muối amoni acetat 10 mM: Hút chính xác 2,00 mL amoni acetat gốc vào bình định mức 200,0 mL; định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều

- Dung dịch acid acetic gốc 1500 mM: Hút chính xác 860 L acid acetic băng vào bình định mức 10,0 mM; định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều

- Dung dịch acid formic 15 mM: Hút chính xác 2,00 mL acid acetic gốc vào bình định mức 200,0 mL; định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều

- Dung dịch acid formic gốc 1000 mM: Hút chính xác 750 L acid formic đặc vào bình định mức 200,0 mL; định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều

- Dung dịch DEA gốc 1000 mM: Hút chính xác 1000 L DEA đặc vào bình định mức 10,0 mL; định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều

- Các dung dịch acid formic và dung dịch acid formic thêm DEA được pha loãng từ các dung dịch gốc bằng nước, được trình bày ở bảng 3.5

Các dung dịch trên được lọc qua màng 0,45 m và siêu âm trước khi sử dụng

Bảng 3.5 Quy trình pha các dung dịch formic và formic thêm DEA Dung dịch Thể tích acid

formic gốc (µL)

Thể tích DEA/TEA gốc (µL)

Định mức (mL)

Acid formic 2 mM 400 0 200

Acid formic 10 mM 2000 0 200

Acid formic 2 mM + DEA 1 mM 400 200 200

Acid formic 2 mM + DEA 1,25 mM 400 250 200

Acid formic 10 mM + DEA 5 mM 2000 1000 200

Acid formic 10 mM + DEA 7,5 mM 2000 1500 200

Acid formic 10 mM + DEA 10 mM 2000 2000 200

Acid formic 10 mM + TEA 0,5 mM 2000 35 200

3.3 Khảo sát diều kiện sắc ký

3.3.1 Lựa chọn bước sóng phát hiện

Tiến hành chạy sắc ký hỗn hợp chuẩn paracetamol và methionin, pha động là hỗn hợp ACN và acid formic 10 mM + DEA 5 mM, pha tĩnh là cột Zorbax Rx Silica Quét phổ trên píc của hai chất chuẩn trong khoảng bước sóng từ 210 nm đến 400 nm thu được kết quả như trong hình 3.2