TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.4 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 Nguyên lý chung của sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng là quá trình tách mẫu trên cột với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu được đưa lên cột dưới dạng dung dịch, và cơ chế của sắc ký lỏng bao gồm hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và phân loại theo kích cỡ.
Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, mẫu phân tích được tiêm qua buồng tiêm và đi vào cột nhờ pha động Các thành phần trong mẫu được tách ra trên pha tĩnh trong cột, sau đó đi qua detector để phát hiện và ghi lại tín hiệu trên sắc đồ.
Pha tĩnh phổ biến trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là pha tĩnh với các nhóm silanol trên bề mặt hạt silicagel được liên kết với các nhóm hóa học khác nhau Sự liên kết này tạo ra các hợp chất siloxan có độ phân cực khác nhau, tùy thuộc vào nhóm liên kết.
DI Ễ N Đ ÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR Ầ N H Ư NG ĐẠ O TP.QUY
Khi R là các nhóm ít phân cực nhƣ octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl và pha động phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC)
Khi R là nhóm phân cực như alkylamin hay alkylnitril, pha động là dung môi ít phân cực, dẫn đến việc sử dụng sắc ký pha thuận (NP-HPLC) Hiện nay, kỹ thuật RP-HPLC được ưa chuộng nhờ khả năng tách nhiều hợp chất khác nhau với pha động chủ yếu là nước, mang lại tính kinh tế Cột phổ biến trong kỹ thuật này là cột ODS (RP18) và C8 với kích thước hạt 5 hoặc 10 m Để nâng cao hiệu quả tách, tiết kiệm dung môi và thời gian, sắc ký lỏng nhanh (UPLC) đã được áp dụng rộng rãi, sử dụng hạt chất mang nhỏ (1,7 – 2,2 m) và cột ngắn hơn (5 – 10 cm).
Pha động đóng vai trò quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong sắc ký Mỗi loại sắc ký yêu cầu pha động rửa giải riêng để đạt hiệu quả tách tốt nhất Có hai loại pha động chính: phân cực và ít phân cực, thường được sử dụng trong sắc ký pha đảo và pha thuận Đôi khi, pha động một thành phần không đủ khả năng rửa giải, do đó, người ta thường phối hợp 2 hoặc 3 dung môi để tạo ra dung môi có độ phân cực phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian được gọi là rửa giải gradient nồng độ.
Có nhiều loại detector khác nhau, tùy thuộc bản chất lý hóa của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp:
- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến
Detector huỳnh quang được sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang Đối với những chất không phát huỳnh quang, cần thực hiện quá trình dẫn xuất hóa học để tạo ra sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.
DI Ễ N Đ ÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR Ầ N H Ư NG ĐẠ O TP.QUY
- Detector khúc xạ: thường dùng định lượng hợp chất đường
- Detector độ dẫn: phù hợp các chất có hoạt tính điện hóa
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng nhiều loại detector như tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa và phổ khối (MS) Đặc biệt, detector chuỗi diode (DAD) cho phép thay đổi bước sóng theo chương trình đã đặt trong quá trình sắc ký.
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm 3 phần chính:
- Phần đầu vào gồm pha động, bơm, hệ thống tiêm mẫu
- Phần tách: gồm cột tách, lò cột, có thể có cột phụ trợ
- Phần phát hiện và xử lý số liệu: gồm detector, bộ phận ghi tín hiệu (máy tính) [1], [3], [4]
Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
DI Ễ N Đ ÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR Ầ N H Ư NG ĐẠ O TP.QUY
1.2.2 Một số thông số đặc trƣng
- Hiệu lực của cột sắc ký đƣợc biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột (N) [1], [3], [4], [13], [32] Số đĩa lý thuyết đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: tR: thời gian lưu chất phân tích
W1/2: Độ rộng pic ở ẵ chiều cao pic
Để đánh giá mức độ tách biệt giữa hai chất trên cột sắc ký, người ta thường sử dụng độ phân giải R giữa hai píc cạnh nhau Độ phân giải giữa hai píc (píc số 1 và số 2) được tính theo một công thức cụ thể.
R = Trong đó tR: Thời gian lưu W: Độ rộng đáy píc
W1/2: Độ rộng đỏy pic ở ẵ chiều cao pic
Khi: R = 0,75 hai píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều
R = 1,0 hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%
R = 1,5 hai píc tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%
- Hệ số bất đối AF (assymetry factor) [1], [3], [4], [13], [32]
AF Trong đó: W 1/20 là độ rộng pic ở chiều cao 1/20 a là khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước của pic ở 1/20 chiều cao pic
DI Ễ N Đ ÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR Ầ N H Ư NG ĐẠ O TP.QUY
Sự tương đồng về thời gian lưu của chất phân tích giữa sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử là nền tảng cho phép thử định tính Hệ số Match của detector DAD khi so sánh hai phổ của chuẩn và thử cũng được sử dụng để đánh giá định tính chất phân tích.
So sánh độ lớn tín hiệu của chất phân tích trong sắc ký đồ giữa dung dịch chuẩn và dung dịch thử (dựa trên diện tích hoặc chiều cao píc) trong cùng một điều kiện sắc ký là nền tảng cho phép định lượng.
Các phương pháp định lượng có thể áp dụng [3], [4]:
Phương pháp chuẩn ngoại là kỹ thuật so sánh giữa mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện sắc ký Kết quả hàm lượng của mẫu thử được tính toán dựa trên nồng độ đã biết của mẫu chuẩn, cùng với đáp ứng của chất phân tích, như diện tích hoặc chiều cao píc của cả hai mẫu.
- Phương pháp chuẩn nội: thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện
Chất được thêm vào được gọi là chuẩn nội Dựa trên các dữ liệu về diện tích píc (hoặc chiều cao píc) và nồng độ của chuẩn, có thể xác định hàm lượng của thành phần cần định lượng trong mẫu thử thông qua chuẩn nội và mẫu thử.
Phương pháp thêm chuẩn là kỹ thuật quan trọng trong HPLC, đặc biệt khi có sự ảnh hưởng của các chất phụ như tá dược Trong phương pháp này, dung dịch mẫu thử được bổ sung một lượng chất chuẩn xác định Để đảm bảo tính chính xác, các píc thu được từ dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn cần được thực hiện trong cùng điều kiện sắc ký Kết quả cuối cùng được tính toán dựa trên sự chênh lệch nồng độ của chất chuẩn và độ tăng diện tích hoặc chiều cao píc.
DI Ễ N Đ ÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR Ầ N H Ư NG ĐẠ O TP.QUY
Phương pháp chuẩn hóa diện tích trong HPLC tính toán nồng độ mẫu thử dựa trên tỷ lệ phần trăm diện tích píc chất thử so với tổng diện tích toàn bộ píc trong sắc ký đồ Phương pháp này chỉ chính xác khi đáp ứng của detector đối với các chất là giống nhau; nếu không, cần có hệ số hiệu chỉnh cho từng chất.
Cơ sở của việc xác định tạp chất tương tự như định lượng Đối với phép thử tạp chất không xác định tên hoặc không có tạp chuẩn, có thể tính tỷ lệ tạp chất dựa vào tỷ lệ phần trăm diện tích pic của tạp so với hoạt chất.
DI Ễ N Đ ÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR Ầ N H Ư NG ĐẠ O TP.QUY
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…
ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Chất chuẩn AML (hàm lƣợng 99,71 % C 20 H 25 ClN 2 O 5 C 6 H 6 O 3 S; số kiểm soát: WS.0212213.02(02.12)) của Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng
Chất chuẩn HCT (hàm lƣợng 99,55 % C 7 H 8 ClN 3 O 4 S 2 ; số kiểm soát:
0114308.01) của Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng
Chất chuẩn VAL (hàm lƣợng 99,80 % C 24 H 29 N 5 O 3 ; số kiểm soát:
R009P0) của Hội đồng Dƣợc điển Mỹ
Lựa chọn một số chế phẩm chứa 1, 2 hoặc 3 thành phần nhƣ:
- Viên nén bao phim Exforge HCT
- Viên nén Co-Diovan Hydroclorothiazid 12,5 mg
- Viên nén Exforge Amlodipin 5 mg Valsartan 80 mg
- Viên nén Normodipine Amlodipin 5 mg
DI Ễ N Đ ÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR Ầ N H Ư NG ĐẠ O TP.QUY
2.1.3 Dung môi, hóa chất Bảng 2.4: Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm
STT Tên dung môi, hóa chất
1 Kali dihydrophosphat Merck Tinh khiết phân tích
2 Methanol Merck Dùng cho HPLC
3 Acetonitril Merck Dùng cho HPLC
4 Nước cất Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng
5 Acid phosphoric Scharlau Tinh khiết phân tích
2.1.4 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC 20A sử dụng phần mềm LabSolution Ver 1.25
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity DAD sử dụng phần mềm OpenLAB CDS ChemStation Workstation VL
- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Agilent 8453
- Cân phân tích Mettler Toledo AG245
- Cân kỹ thuật Mettler PE 1600
- Bể lắc siêu âm PowerSonic 410
- Bộ lọc hút chân không
- Dụng cụ: các loại pipet, bình định mức, xylanh, cốc có mỏ, màng lọc mẫu 0,45 àm, cỏc lọ tiờm mẫu (vial) …
DI Ễ N Đ ÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR Ầ N H Ư NG ĐẠ O TP.QUY
2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu
- Lựa chọn dung môi pha mẫu: thông dụng, rẻ tiền
- Lựa chọn phương pháp xử lý: siêu âm, lắc cơ học, ly tâm…
2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích đồng thời AML, HCT và VAL, bao gồm:
- Pha tĩnh: Lựa chọn cột sắc ký có khả năng tách tốt và chọn lọc
Để đạt được sắc ký đồ đẹp và tách tốt, cần lựa chọn thành phần, tỷ lệ, pH và tốc độ dòng pha động phù hợp, đảm bảo thời gian lưu của chất phân tích ở mức vừa phải.
- Detector và bước sóng phát hiện: chọn bước sóng tại đó đáp ứng phân tích của AML, HCT và VAL là tối ƣu
Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát để đảm bảo phương pháp nghiên cứu là phù hợp
- Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
- Tính chọn lọc của phương pháp (Độ đặc hiệu)
- Độ chính xác: gồm độ lặp lại và độ tái lặp
- Độ đúng của phương pháp
2.2.4 Ứng dụng phương pháp phân tích một số chế phẩm trên thị trường
- Thu thập một số chế phẩm chứa 2 hoặc 3 thành phần
- Tiến hành phân tích các thành phần trong chế phẩm theo phương pháp đã xây dựng
DI Ễ N Đ ÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR Ầ N H Ư NG ĐẠ O TP.QUY
Nguyên lý phân tích bao gồm việc nghiền mịn mẫu, xử lý bằng phương pháp thích hợp, lọc qua màng lọc 0,45 μm và tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC để ghi lại sắc ký đồ Phương pháp nghiên cứu này cung cấp một quy trình phân tích đơn giản bằng sắc ký lỏng pha đảo (Rp-HPLC), phù hợp với hầu hết các phòng thử nghiệm trong hệ thống kiểm nghiệm Nó sử dụng dung môi phân tích thông dụng, dễ kiếm và ít độc hại, cùng với detector UV-VIS phổ biến, và cách xử lý mẫu đơn giản, dễ thực hiện.
Các số liệu đề tài thu thập từ kết quả thực nghiệm ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời Amlodipin besylat, Hydroclorothiazid và Valsartan
2.3.1.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp:
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát hệ sắc ký lỏng pha đảo với cột C18 và hệ pha động phân cực để phân tích các chất AML, HCT và VAL, vì chúng đều có độ phân cực tốt.
Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký bao gồm việc xác định loại cột sắc ký, pha động, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng và bước sóng phát hiện Mục tiêu là đảm bảo các chất được tách biệt rõ ràng, với các đỉnh sắc ký gọn gàng và cân đối, đồng thời thời gian phân tích phải phù hợp, tối ưu cho ba hoạt chất cần phân tích.
- Lựa chọn cột sắc ký: khảo sát các loại cột có kích cỡ hạt khác nhau và của các hãng sản xuất khác nhau
Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các dung môi pha động, bao gồm ACN, MeOH và dung dịch đệm KH2PO4 0,05M (pH 3,0) với các tỷ lệ khác nhau, dựa trên tài liệu tham khảo.
DI Ễ N Đ ÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR Ầ N H Ư NG ĐẠ O TP.QUY
- Lựa chọn bước sóng: Tiến hành quét phổ hấp thụ UV của AML, HCT và VAL để lựa chọn bước sóng tối ưu trong phân tích
2.3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Xử lý mẫu theo phương pháp đã chọn và tiến hành chạy sắc ký các dung dịch thu được theo các điều kiện đã khảo sát Thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ tiêu quan trọng như tính chọn lọc, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, tính thích hợp hệ thống và độ thô.
* Tính thích hợp của hệ thống [6], [7], [17]:
Để xác định tính thích hợp của hệ thống, cần thực hiện việc tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp với nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính Đồng thời, ghi lại thời gian lưu và diện tích píc của các lần sắc ký.
- Yêu cầu: + Số đĩa lý thuyết ≥ 3000
+ Chênh lệch diện tích píc, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 2,0 %
* Độ đặc hiệu của phương pháp [6], [7], [17]:
Tạo mẫu placebo tự tạo bằng cách sử dụng các thành phần tá dược tương tự như trong chế phẩm nhưng không chứa hoạt chất AML, HCT và VAL Chuẩn bị các mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu thử và mẫu placebo Sau đó, xử lý các mẫu và tiến hành sắc ký theo các điều kiện tương tự như mẫu thử.
Dựa vào đặc tính của detector DAD, tiến hành quét và chồng phổ UV-VIS của từng hoạt chất trong mẫu chuẩn hỗn hợp và mẫu thử để tính toán hệ số Match.
- Tính hệ số tinh khiết píc của các hoạt chất trong mẫu thử
DI Ễ N Đ ÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR Ầ N H Ư NG ĐẠ O TP.QUY
- Yêu cầu: + Trên sắc ký đồ của mẫu placebo thu đƣợc, tại thời điểm tương ứng píc của AML, HCT và VAL không được xuất hiện píc lạ
+ Hệ số chồng phổ UV-VIS phải xấp xỉ 1,0
+ Hệ số tinh khiết píc của các hoạt chất phải xấp xỉ 1,0
Xác lập mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của AML, HCT, VAL bằng cách chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp với nồng độ tăng dần Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn, từ đó xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính và xác định hệ số tương quan hồi quy r.
- Yêu cầu: Phương trình hồi quy là dạng bậc 1 và giá trị r ≥ 0,999
Độ chính xác là chỉ số phản ánh mức độ phân tán của kết quả trong một loạt các phép đo, được thực hiện qua nhiều lần phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới các điều kiện xác định.
Độ lặp lại của phương pháp là chỉ số thể hiện độ chính xác của quy trình phân tích khi được thực hiện trong cùng một điều kiện thí nghiệm và trong khoảng thời gian ngắn.
Tiến hành thí nghiệm 6 mẫu thử song song với nồng độ 100% trên cùng một chế phẩm, nhằm tính hàm lượng của AML, HCT và VAL trong các mẫu thử Kết quả được đánh giá thông qua giá trị RSD để xác định sự phân tán của dữ liệu.
Yêu cầu: RSD của 6 kết quả ≤ 2,0 %
Để đánh giá độ tái lặp của phương pháp, thí nghiệm được thực hiện trong các thời điểm khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau Kết quả lặp lại trong ngày được đánh giá thông qua giá trị RSD, trong khi độ chính xác của phương pháp được phân tích bằng t-test trong Microsoft Office Excel 2007.
Yêu cầu: + RSD của 6 kết quả ≤ 2,0 %
DI Ễ N Đ ÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR Ầ N H Ư NG ĐẠ O TP.QUY
+ Hàm lƣợng trung bình giữa 2 phòng thí nghiệm ≤ 2,0 %
Để xác định độ chính xác của phương pháp, cần thêm chất chuẩn vào mẫu placebo Lượng chất chuẩn được thêm vào nhằm đạt được nồng độ tương ứng với 50%, 100% và 200% nồng độ định lượng Mỗi mức nồng độ sẽ được tiến hành kiểm tra riêng biệt.
- Tính tỉ lệ thu hồi của AML, HCT và VAL chuẩn thêm vào mẫu thử
- Yêu cầu: + Tỉ lệ thu hồi đạt 98,0 % - 102,0 % + Giá trị RSD ≤ 2,0 %