Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sinh học

TB được mục đích, nguyên tắc, PP thử vô khuẩn và đếm SL VSV trong 1 g1ml DP Nêu được vai trò của PP sinh học trong KN chất kháng sinh, và TB được thử nghiệm ĐL chất KS bằng PP khuếch

Trường Đại học Duy Tân

Khoa Dược

Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm

Kiểm nghiệm thuốc bằng

phương pháp sinh học

4

3

2

1 Nắm được những đđ cơ bản về hình thái,

tính chất nuôi cấy của VK, vi nấm để áp dụng trong

thử nghiệm VSV

Biết KT làm một môi trường nuôi cấy VSV và nêu được các PP tiệt trùng

TB được mục đích, nguyên tắc, PP thử

vô khuẩn và đếm SL VSV trong 1 g(1ml) DP

Nêu được vai trò của PP sinh học trong KN chất kháng sinh, và TB được thử nghiệm ĐL chất KS bằng PP khuếch tán

Mục tiêu bài học

Nội dung bài học

1 Đại cương về vi sinh vật

2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

3 Thử vô khuẩn

4 Thử giới hạn vi sinh vật

5 Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử vi sinh vật

I Mở đầu

1 Nguyên tắc của phương pháp sinh học:

- So sánh hiệu lực tác dụng hoặc các đặc tính riêng của chất thử với chất chuẩn tương ứng trong cùng một điều kiện và thời gian thí nghiệm

- Trong KN thuốc:

+ KN thuốc bằng các phương pháp thử trên động vật

+ KN thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật

- Đánh giá bằng toán thống kê

- Độ chính xác của phép thử được thể hiện bằng giới hạn tin cậy

II Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật

1 Nguyên tắc:

- Dựa trên sự đáp ứng của động vật thí nghiệm đối với các chế phẩm được đưa vào cơ thể (liều lượng theo quy định của từng thí nghiệm) để đánh giá chất lượng của chế phẩm cần thử

2 Động vật thí nghiệm:

- Phải đồng đều, thuần khiết về nòi giống

- Khoẻ mạnh, không nhiễm bệnh

- Không có thai

- Được nuôi dưỡng đầy đủ

II Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật

4 Liều:

- Là lượng chế phẩm thử đưa vào cơ thể động vật một lần cho từng mục đích thí nghiệm

II Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật

5 Các thử nghiệm trên ĐV được áp dụng trong KNT:

- Kiểm tra tính an toàn của vaccin và sinh phẩm

- Xác định hiệu lực của các vaccin và antitoxin

III Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử

vi sinh vật

1 Đại cương về vi sinh vật

Vi sinh vật

Nấm men Nấm

Vi khuẩn

Vi sinh vật

Nấm mốc

Đặc điểm Phân loại

Sinh sản

Tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram Hình thể

Đặc tính quá trình hô hấp

1 Đại cương về vi sinh vật

 Sự ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đối với quá trình phát triển của vi sinh vật (VSV):

 Nhiệt độ:

- Tế bào sinh dưỡng: chết ở 60 oC /20 - 30 phút

- Bào tử: chỉ bị tiêu diệt ở 120 oC / 30 – 40 phút → tiệt trùng

2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

 Phân loại:

- Môi trường tự nhiên: động vật hay thực vật

- Môi trường tổng hợp: hoá chất thuần khiết,hòa tan trong nước

- Môi trường bán tổng hợp: nguyên liệu tự nhiên và tổng hợp

→ Đáp ứng các điều kiện: - Đầy đủ chất dinh dưỡng

- pH trong khoảng quy định

- Vô trùng

2.1 Kĩ thuật pha chế môi trường

1 Chuẩn bị dụng cụ hoá chất - Dụng cụ: men/thủy tinh

- Nguyên liệu, hóa chất: chất lượng, tinh khiết

2 Cân đong nguyên liệu - Chính xác (nhất là nguyên tố vi lượng gây

ức chế vi khuẩn)

3 Hoà tan nguyên liệu - Nước cất / nước khử khoáng

- Thạch: đun cho tan

4 Điều chỉnh pH - NaOH 1N, HCl 1N

5 Làm trong môi trường - Lọc qua vải gạc/giấy

6 Đóng ống tiệt trùng - Thông thường: 110oC/30phút,120oC/20phút

- Các chất phân hủy bởi nhiệt → nhiệt độ thấp

 Pha chế môi trường từ hỗn

hợp bột môi trường chế sẵn

- Pha: nước cất/nước khử khoáng

- Kiểm tra pH

- Môi trường bột khô: được giữ ở 10 - 12 oC trong điều kiện khô, tránh ánh sáng

- Môi trường đã pha chế được bảo quản ở 4 – 10 oC trong 1 – 2 tháng tuz theo thành phần môi trường

2.2 Bảo quản môi trường

2.3 Các phương pháp tiệt trùng

Tiệt trùng bằng hơi nước

Tiệt trùng bằng nhiệt khô

Tiệt trùng gián đoạn (phương pháp Tyndall)

Khử trùng nhiệt độ thấp (phương pháp Pasteur)

Phương pháp lọc

Phương pháp dùng tia bức xạ Tiệt trùng

1.Tiệt trùng bằng nhiệt khô

- Tiệt trùng dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt như bông, băng, vải, gạc…

- 180 o C/ 30 phút, 170 o C/ 1 giờ, 160 o C/2 giờ 2.Tiệt trùng bằng hơi nước

- Tiệt trùng môi trường nuôi cấy và các dụng cụ phẫu thuật

- Tiệt trùng môi trường dễ bị hỏng bởi nhiệt

- Đun cách thuỷ 60 o C/ 30 phút, hoặc 73 o C/ 15 phút → làm lạnh đột ngột <10 o C

3.Phương pháp lọc - Tiệt trùng các chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệt - Màng lọc có kích thước lỗ lọc ≤ 0,22µm

 Mục đích:

→ Phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, vi nấm trong: thuốc tiêm, dịch tiêm truyền, thuốc tra mắt, các dụng cụ y tế mà phải vô trùng

 Nguyên tắc:

- Vi khuẩn/nấm cấy vào môi trường có chất dinh dưỡng và nước, ở nhiệt độ thích hợp → phát triển → biến đổi môi trường

3 Thử vô khuẩn

 Môi trường:

- Môi trường Thioglycolat (phát hiện VK hiếu khí và kỵ khí)

- Môi trường Soybean - casein (phát hiện VK hiếu khí và nấm)

→ Có thể dùng các môi trường khác:

• MT canh thang cao thịt - pepton → vi khuẩn hiếu khí

• MT Wilson - Blair → vi khuẩn kị khí

• MT Sabouraud lỏng → vi nấm

3.Thử vô khuẩn

L-Cystin 0,50 g

Dextrose (C6H12O6.H2O) 5,50 g

Cao nấm men(có khả năng tan trong nước) 5,00 g

Casein thủy phân bởi pancreatin 15,0 g

(hoặc acid thioglycolic 0,3 ml)

Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha) 1 ml

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 ± 0,2

Ví dụ: Môi trường thioglycolat không có thạch

L – Cystin 0,50 g

Dextrose (C6H12O6.H2O) 5,50 g

Thạch bột (có độ ẩm nhỏ hơn 15%) 0,75 g

Cao nấm men (có khả năng tan trong nước) 5,00 g

Casein thủy phân bởi pancreatin 15,00 g

(hoặc acid thioglycolic 0,3 ml)

Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha) 1,0 ml

Nước 1000 ml

pH sau khi tiệt khuẩn 7,1 ± 0,2

Ví dụ: Môi trường thioglycolat có thạch

Casein thủy phân bởi pancreatin 17,0 g

Bột đậu tương thủy phân bởi papain 3,0 g

Dikali hydrophosphat 2,5 g

Dextrose monohydrat 2,5 g

pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 ± 0,2

Ví dụ: Môi trường Soybean - casein

 Kiểm tra chất lượng môi trường:

3 Thử vô khuẩn

 Kiểm tra chất lượng môi trường:

 Khả năng dinh dưỡng

- Cấy vào mỗi ống môi trường khoảng 100 tế bào các VSV sau: + Vi khuẩn hiếu khí: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa

+ Vi khuẩn kỵ khí: Clostridium sporogenes

+ Vi nấm: Candida albicans, Aspergillus niger

- Nuôi cấy 30 - 35oC / 3 ngày (vi khuẩn), 25 - 28oC / 5 ngày (vi nấm)

→ Vi sinh vật phải phát triển tốt trên các môi trường

3 Thử vô khuẩn

 Lấy mẫu thử:

- Toàn bộ số ống/lọ thuốc được khử trùng hoặc được phân bố

vô trùng trong cùng một điều kiện → lô thuốc

- Lô <100 đơn vị, lấy 3 đơn vị

- Nếu nhiều hơn thì cứ 50 đơn vị lấy thêm 1 đơn vị nhưng ≤ 10 Dựa vào tiêu chuẩn ngành hoặc tiêu chuẩn cơ sở của từng sản phẩm để lấy mẫu cho thích hợp

3 Thử vô khuẩn

 Kiểm tra tác dụng ức chế vi sinh vật của chế phẩm thử :

 Mục đích: kiểm tra chế phẩm có tác dụng ức chế VSV do chất bảo quản hay không

 Tiến hành:

- Lấy ít nhất 2 ống của mỗi loại môi trường, cấy chế phẩm cần thử vào 1 trong 2 ống

- Cấy khoảng 100 tế bào (0,1 ml nhũ dịch VSV được pha ở nồng

độ thích hợp) vào cả 2 ống của các môi trường tương ứng

- Nuôi cấy 30 - 35oC/4 ngày (vi khuẩn) và 25 - 28oC/7 ngày (vi nấm)

3 Thử vô khuẩn

 Kiểm tra tác dụng ức chế vi sinh vật của chế phẩm thử :

 Đánh giá kết quả:

Giống nhau giữa 2 ống (mọc nhanh và phong phú) Không có chất ức chế Ống có chất thử, VSV phát triển yếu hoặc không

phát triển so với ống không có chất thử Có chất ức chế

Phương pháp dùng màng lọc

Phương pháp thử

Phương pháp nuôi cấy trực tiếp

3 Thử vô trùng

 Dụng cụ, thiết bị

- Thuỷ tinh, thép không rỉ hoặc nhựa gồm 2 bộ phận có thể tháo rời, ở giữa có lưới đỡ màng lọc

- Màng lọc: Ø ≈50mm và lỗ màng lọc ≤ 0,45µm

+ Nitrat celleulose: lọc nước, dầu, và dung dịch alcol yếu

+ Acetat cellulose: lọc các dung dịch alcol mạnh

 Áp dụng: kiểm nghiệm các thuốc có tác dụng ức chế vi sinh vật, đặc biệt là kháng sinh, nhưng đòi hỏi thiết bị tốt và điều kiện

vô trùng cao

3.1 Phương pháp dùng màng lọc

3.1 Phương pháp dùng màng lọc

 Tiến hành: Thấm ướt màng lọc → Rót mẫu thử lên màng → Rửa màng lọc → Cấy vào môi trường trong thời gian quy định → Quan sát hiện tượng, nhận định kết quả

Hình ảnh khuẩn lạc mọc trên màng lọc

3.1 Phương pháp dùng màng lọc

Số lượng tối thiểu của đơn vị đóng gói cho vào môi trường

Số lượng trong 1 đơn vị đóng gói cho vào môi trường Số lượng tối thiểu

- Toàn bộ đơn vị đóng gói

- 1/2 đơn vị đóng gói nhưng không dưới 1 ml

- 20 ml

- 10 % đơn vị đóng gói nhưng không dưới 20 ml Chất lỏng kháng sinh - 1 ml

Các chế phẩm khác tan trong nước hoặc

isopropyl myristat - Lấy lượng tương ứng với ít nhất 200 mg thuốcChế phẩm không tan, chế phẩm dạng kem, mỡ

phải phân tán thành nhũ dịch - Lấy lượng tương ứng với ít nhất 200 mg thuốcChất rắn:

- 500 mg

Dụng cụ:

- Chỉ khâu phẫu thuật và chỉ khâu trong thú y

- Băng, bông, gạc phẫu thuật được đóng gói kín

- Chỉ khâu phẫu thuật và các dụng cụ khác được

đóng gói dùng một lần

- Các dụng cụ y tế khác

- 3 sợi (mỗi sợi dài 30 cm)

- 100 mg mỗi gói

- Toàn bộ đơn vị đóng gói

- Toàn bộ dụng cụ, cắt nhỏ dụng cụ hoặc tháo rời dụng cụ ra

3.2 Phương pháp nuôi cấy trực tiếp

Dụng cụ - Bơm tiêm, pipet, các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi

trường (đĩa petri) → vô khuẩn

Số lượng - Theo bảng 13.7.1

Kỹ thuật

thử

- Dùng bơm tiêm hoặc pipet lấy mẫu thử→cấy vào môi trường

- Ủ môi trường phát hiện vi khuẩn ở 30 - 35 °C/ ít nhất 4 ngày; nấm ở 25 - 28 °C/ ít nhất 7 ngày; theo dõi

 Lưu ý:

• Lấy mẫu thử:

- Dầu/dd dầu → thêm vào môi trường nuôi cấy 1% tween 80

hoặc các chất nhũ hoá khác với nồng độ thích hợp

- Mỡ/kem → hoà loãng vào dd pepton 0,1% vô trùng theo tỷ lệ 1/10 trước khi cấy vào môi trường (dung dịch pepton cần thêm tween 80 với tỷ lệ 1ml/1lít)

3.2 Phương pháp nuôi cấy trực tiếp

 Lưu ý:

• Kĩ thuật thử:

- Mẫu thử ở dạng bột → cho trực tiếp vào môi trường hoặc làm thành

dung dịch hay nhũ dịch 1% → cấy vào môi trường

- Băng gạc, chỉ khâu phẫu thuật → nếu kích thước và hình dạng cho phép, nhúng toàn bộ mẫu thử vào 100ml môi trường

- Dây truyền dịch : Cho dung dịch pepton 0,1% vô trùng chảy qua để thu được ít nhất 15ml và cấy vào 100ml môi trường

3.2 Phương pháp nuôi cấy trực tiếp

 Ưu điểm:

- Kỹ thuật đơn giản

 Nhược điểm:

- Khả năng phát hiện vi sinh vật giảm khi số lượng vi sinh vật có

ít và phân phối trong một thể tích chất thử lớn

- Phương pháp này không thực hiện được với các chế phẩm có tác dụng ức chế và các chất kháng sinh

3.2 Phương pháp nuôi cấy trực tiếp

- Phát hiện các VK chỉ điểm vệ sinh quy định không được có

trong thuốc là: S aureus, P aeruginosa, E coli, các loài

Salmonella, VK kỵ khí Clostridia

4 Thử giới hạn vi sinh vật

 Nguyên tắc:

- Đếm số VSV qua khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch

- Dựa vào đặc tính hình thái, sinh lý → xác định VK gây bệnh

- Đánh giá chất lượng của thuốc theo TCDĐ hoặc TCCS

 Chuẩn bị mẫu thử:

- Rắn: hòa tan trực tiếp hoặc nghiền mịn với dung môi

- Lỏng (dung dịch thực, nhũ dịch trong nước, chất rắn hòa tan dễ dàng trong nước ): dùng đệm phosphat pH 7,2 hoặc dung dịch natri clorid 0,9 % để hòa loãng

- Lỏng không hòa lẫn trong nước (dầu, kem, sáp): thêm chất nhũ hóa, khuấy trộn cơ học hoặc làm nóng nhẹ 45 °C → tạo nhũ dịch

- Dạng khí dung - lỏng: Làm lạnh bình để các khí hóa lỏng,mở nắp lấy một lượng thích hợp để thử

4 Thử giới hạn vi sinh vật

Đĩa chứng: 1ml nước cất vô trùng + 1ml nhũ dịch VSV

- Cho vào mỗi đĩa 15 - 20 ml môi trường đã nguội dưới 45 oC

- Ủ 30-35oC/24-48 giờ (vi khuẩn) và 25-28oC/48-72 giờ (vi nấm)

4 Thử giới hạn vi sinh vật

 Kiểm tra chất ức chế:

 Nhận xét kết quả:

- Đếm số khuẩn lạc VSV trên các đĩa thí nghiệm

Gọi A là số khuẩn lạc ở đĩa 1

Gọi B là số khuẩn lạc ở đĩa 2

Gọi C là số khuẩn lạc ở đĩa chứng

• Nếu B ≈ A + C → mẫu thử không có chất ức chế

• Nếu B ≈ A hoặc B << A + C → mẫu thử có chất ức chế VSV

4 Thử giới hạn vi sinh vật

 Tiến hành (Phương pháp đĩa thạch):

1ml chất thử (<300 khuẩn lạc/1ml)

15-20ml thạch casein – đậu tương (45 o C)

Nuôi cấy 30-35 o C/2-3 ngày

1ml chất thử (<100 khuẩn lạc/1ml) 15-20ml thạch Sabouraud + kháng sinh

Nuôi cấy 25-28 o C/4-5 ngày

- Thực hiện với 1 - 2 nồng độ cuối cùng, mỗi nồng độ làm 2-3 đĩa thử

- Đếm số khuẩn lạc để tính số lượng

4 Thử giới hạn vi sinh vật

 Tính kết quả:

- Tổng số VK hiếu khí, vi nấm trong 1g (1ml) được tính:

(Phép thử thực hiện với 2 nồng độ)

A1 : Số khuẩn lạc vi sinh vật trung bình ở nồng độ pha loãng k1

A2 : Số khuẩn lạc vi sinh vật trung bình ở nồng độ pha loãng k2

k1, k2 : Độ pha loãng

 Đánh giá: mẫu thử có ít hơn 10 VSV/1g (1ml) nếu không có khuẩn lạc mọc trên đĩa thử ở nồng độ 10-1

4 Thử giới hạn vi sinh vật

 Mục đích:

- Đánh giá hoạt tính sinh học của thuốc

- Kiểm tra được sự giảm hay mất hoạt lực của chất kháng sinh

- Xác định hoạt lực các chất kháng sinh có cấu trúc phức tạp hoặc một hỗn hợp nhiều thành phần có tác dụng

- Cho biết độ nhạy cảm của vi khuẩn gây bệnh và mức độ kháng thuốc của chúng

- Chọn kháng sinh thích hợp cho bệnh nhân trong điều trị

5.Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử VSV

 Nguyên tắc:

- Hoạt lực của một chất kháng sinh được xác định bằng cách so sánh khả năng ức chế của chủng chỉ thị, bởi những nồng độ đã biết của kháng sinh thử (chưa biết hoạt lực) và nồng độ đã biết của kháng sinh chuẩn (đã biết rõ hoạt lực)

5.Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử VSV

 Chủng chỉ thị:

- Chủng VSV thuần khiết, nhạy cảm với một chất kháng sinh

- Phân lập từ các bảo tàng giống Quốc gia

- Bảo quản trong ống đông khô hoặc trong môi trường thích hợp ở 4 - 10oC

 Chất chuẩn:

- Độ tinh khiết cao

- Đóng ống thủy tinh hàn kín, tránh ánh sáng, dưới 0oC

 Đơn vị hoạt lực: U / UI / IU

 Môi trường và dung môi thử: tùy kháng sinh và VSV chỉ thị

III.5.Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử VSV

Phương pháp

đo độ đục

Phương pháp thử

Phương pháp khuếch tán

5.Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử VSV

Phương pháp khuếch tán

- Cho môi trường đã được cấy chủng chỉ

thị vào đĩa petri (dày 2-5mm)

- Đặt các ống trụ (hoặc giấy tẩm kháng

sinh) chứa chất chuẩn và chất thử như

hình vẽ

- Để ở nhiệt độ phòng 2 giờ

- Ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 16 – 18 giờ

- Đo đường kính vùng ức chế tạo bởi các

nồng độ chuẩn và thử

- Tiến hành với 10 đĩa thử song song

Vị trí đặt chất thử và chất chuẩn với thử nghiệm 3 liều

5.Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử VSV

Tóm tắt

Mục đích, nguyên tắc, phương pháp khuếch tán, đánh giá kết quả

Đại cương Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng

Lọc qua màng lọc Thử vô khuẩn

Nuôi cấy trực tiếp

Dụng cụ, thiết

bị, kĩ thuật thử, đánh giá,

áp dụng

Sự phát triển của VSV

Thử giới hạn nhiễm khuẩn

Xác định hoạt lực kháng

sinh bằng pp thử VSV

Mục đích, nguyên tắc, phương pháp thử, đánh giá kết quả

Tài liệu tham khảo

 Bộ Y tế, Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, 2009

 Ngoài ra

• Trần Tử An, Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, 2011

• Đặng Văn Hòa, Kiểm nghiệm thuốc, NXBGDVN, 2011

• Nguyễn Lân Dũng, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, 2009

• Và 1 số tài liệu tham khảo khác…