chương 4 kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp sinh học

Trong ngành Dược có nhiều phương pháp khác nhau để kiểm tra chất lượng của thuốc như phương pháp hoá học, phương pháp vật lý, phương pháp sinh học. Phương pháp hoá, vật lý tiến hành nhanh, chính xác nhưng chỉ áp dụng được với các chất thành phần hoá học đã biết. Một số dược phẩm có yêu cầu về hiệu lực tác dụng, hoặc những tính chất riêng biệt như độ an toàn của vaccine, độc tính bất thường hay yếu tố gây sốt của một số loại thuốc…Những tiêu chuẩn này không thể xác định được bằng phương pháp lý, hoá mà phải dùng phương pháp sinh học. Đại cương: 1. Nguyên tắc của phương pháp sinh học: Phương pháp sinh học dựa trên nguyên tắc: So sánh hiệu lực tác dụng hoặc các đặc tính riêng của chất thử với chất chuẩn tương ứng trong cùng điều kiện và thời gian thí nghiệm. Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, hai loại thử nghiệm được áp dụng nhiều nhất là: - Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật - Kiểm nghiệm thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật.

KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC

Giảng viên: Bùi Thu Phương

Trường Cao đẳng Y Dược Tuệ Tĩnh-Hà Nội.

Trong ngành Dược có nhiều phương pháp khác nhau để

kiểm tra chất lượng của thuốc như phương pháp hoá học, phương pháp vật lý, phương pháp sinh học.

Phương pháp hoá, vật lý tiến hành nhanh, chính xác nhưng chỉ áp dụng được với các chất thành phần hoá học

đã biết Một số dược phẩm có yêu cầu về hiệu lực tác dụng, hoặc những tính chất riêng biệt như độ an toàn của vaccine, độc tính bất thường hay yếu tố gây sốt của một số loại thuốc…Những tiêu chuẩn này không thể xác định được bằng phương pháp lý, hoá mà phải dùng phương pháp sinh học.

I MỞ ĐẦU

vô khuẩn và đếm SL VSV trong 1 g(1ml) DP

Nêu được vai trò của PP sinh học trong KN chất kháng sinh, và TB được thử nghiệm ĐL chất KS bằng PP khuếch tán.

Mục tiêu bài học

1 Đại cương về vi sinh vật

2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

3 Thử vô khuẩn

4 Thử giới hạn vi sinh vật

5 Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương

pháp thử vi sinh vật

I Đại cương

5

1 Nguyên tắc của phương pháp sinh học:

- Phương pháp sinh học dựa trên nguyên tắc:

- So sánh hiệu lực tác dụng hoặc các đặc tính riêng của chất thử với chất chuẩn tương ứng trong cùng điều kiện và thời gian thí nghiệm.

- Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, hai loại thử nghiệm được áp dụng nhiều nhất là:

- - Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật

- - Kiểm nghiệm thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật.

2 Chất chuẩn:

- Chất chuẩn là một yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng chất thử Chất

chuẩn được chia làm hai loại:

- Chất chuẩn gốc

- Chất chuẩn thứ cấp

- Chất chuẩn phải được bảo quản trong các ống thuỷ tinh ở nhiệt độ thích hợp

tuỳ theo mẫu (thường ở nhiệt độ < 50C) trong điều kiện khô, tránh ánh sáng.

3 Đánh giá kết quả:

- Thử nghiệm sinh học thường có thời gian thí nghiệm kéo dài và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tính chất đáp ứng của sinh vật thí nghiệm, người làm thí

nghiệm, các điều kiện thử nghiệm

- Các yếu tố này thường không ổn định Vì vậy kết quả thử nghiệm sinh học phải được đánh giá bằng toán thống kê Độ chính xác của phép thử được thể hiện bằng giới hạn tin cậy.

I Đại cương

II Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật

1 Nguyên tắc:

- Dựa trên sự đáp ứng của động vật thí nghiệm đối với

các chế phẩm được đưa vào cơ thể (liều lượng theo

quy định của từng thí nghiệm) để đánh giá chất

lượng của chế phẩm cần thử

Kiểm nghiệm thuốc bằng các phép thử trên động

vật dựa trên sự đáp ứng của động vật thí nghiệm

đối với các chế phẩm được đưa vào cơ thể một

liều lượng theo qui định của từng thí nghiệm để

đánh giá chất lượng của chế phẩm cần thử

7

II Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật

3 Thử in vivo và in vitro:

-Thử in vitro: tiến hành trên các cơ quan cô lập

của động vật, như tim, tử cung, ruột, máu…

-Thử in vivo: thực hiện trên cơ thể động vật

sống, dựa vào kết qua các thông số để đánhgiá

tác dụng và chất lượng của thuốc

II Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật

1 0

5 Các thử nghiệm trên ĐV được áp dụng trong KNT:

- Thử độc tính bất thường

- Thử chất hạ huyết áp

- Thử chất gây sốt

- Định lượng các hormon: gonadorelin,

corticotrophin,insulin, oxytocin, menotrophin

- Kiểm tra tính an toàn của vaccin và sinh phẩm

- Xác định hiệu lực của các vaccin và antitoxin

5 Các thử nghiệm trên ĐV được áp dụng trong KNT

5.1 Thử độc tính bất thường

• Nguyên tắc:

Độc tính bất thường của mẫu thử được đánh giá bằng số chuột nhắt sống và chết trong thời gian 48 giờ sau khi chuột nhận được một lượng thuốc thử thích hợp bằng đường tiêm hoặc đường uống.

Thí nghiệm này thường được áp dụng cho các thuốc đông dược có dược liệu độc như ô đầu, phụ tử hay các chế phẩm đông dược mới.

II Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật

• Đánh giá kết quả:

Sau 48h dùng thuốc ở lần thứ nhất, nếu không có chuột nào chết, mẫu thử đạt yêu cầu Nếu có một hay nhiều chuột chết trong thời gian trên phải làm lại thí nghiệm lần thứ hai.

Thí nghiệm lần thứ hai được tiến hành với 10 chuột cân nặng từ 20g Sau

48h nếu không có chuột nào chết thì mẫu thử đạt yêu cầu Nếu có một hay nhiều chuột chết, mẫu thử không đạt yêu cầu.

5.2 Thử chất gây sốt

• Nguyên tắc:

Là một phương pháp sinh học để kiểm tra chất lượng mẫu thử, dựa trên sự tăng thân nhiệt của thỏ sau khi được tiêm thuốc thử cần thử vào tĩnh mạch tai.

Các dịch tiêm truyền yêu cầu bắt buộc phải thử chất gây sốt Các thuốc tiêm nếu ghi trên nhãn

“không có chất gây sốt” hoặc có thể tích từ 15ml trở lên cũng phải thử chất gây sốt.

• Động vật thí nghiệm:

Thực hiện trên thỏ trưởng thành, khoẻ mạnh, đực hoặc cái (không có thai) nặng từ 1,5kg trở lên.

Thỏ được nuôi đầy đủ với các chất kháng sinh Nhiệt

độ nhà chăn nuôi và phòng thí nghiệm không chênh lệch nhau quá 3 0 C Trong 3 ngày trước ngày thí nghiệm , thỏ được lấy nhiệt độ 3 lần/ngày vào buổi sáng, mỗi lần cách nhau 1 h

Chỉ dùng thỏ có nhiệt độ từ 38 - 39,8 0 C Trong thời gian lấy nhiệt độ không cho thỏ ăn, nhưng có thể cho uống nước Những con thỏ có sự chênh lệch nhiệt độ giữa các lần đo trong ngày ≥0,6 0 C không được dùng để thí nghiệm.

• Dụng cụ thí nghiệm:

Các dụng cụ thuỷ tinh: bơm tiêm, kim tiêm phải được rửa sạch và khử trùng 250 0 C/ 30 phút hoặc 200 0 C/ 1 h

• Phương pháp tiến hành:

Thí nghiệm được thực hiện trên 3 thỏ có nhiệt độ khác nhau không quá 1 0 C

Lấy nhiệt độ ban đầu: Trước khi tiêm chất thử, lấy nhiệt độ thỏ 2 lần, mỗi lần cách nhau 30 phút Hai nhiệt độ này không được chênh nhau quá 0,2 0 C Nhiệt độ ban đầu là trung bình cộng của 2 lần đo.

Tiêm thuốc: Thể tích tiêm từ 0,5 – 10ml/ 1kg thỏ

Theo dõi nhiệt độ thỏ ở những khoảng thời gian ít nhất 30 phút trong 3 giờ sau khi tiêm

Phương pháp thử trên động vật còn được áp dụng để kiểm nghiệm nhiều loại dược phẩm có tính chất đặc biệt: Định lượng các hormon, corticotropin (ACTH), insulin, adrenalin, định lượng heparin, vitamin D, Oxytocin, digitalin và các chế phẩm chứa glucosid trợ tim, kiểm tra độ an toàn và hiệu lực của vacxin…

III Kiểm nghiệm thuốc

bằng phương pháp thử vi

sinh vật

1 Đại cương về vi sinh vật

Vi sinh vật

19

1 Đại cương về vi sinh vật

Đại cương về vi sinh vật

Vi sinh vật là những cơ thể sống có kích thước rất nhỏ

mà mắt thường không nhìn thấy được Trong tự nhiên, vi sinh vật tồn tại rất phong phú và đa dạng, chúng đóng vai trò tích cực vào vòng tuần hoàn vật chất Nhiều loại vsv được ứng dụng trong các lĩnh vực y tế, công nghiệp, nông nghiệp như các vsv có khả năng lên men rượu, sinh tổng hợp kháng sinh, vitamin, acid amin, vi sinh vật

cố định đạm ở thực vật…

Để phục vụ cho việc kiểm nghiệm thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật, ta cần tìm hiểu một số đặc điểm chính của hai nhóm vi sinh vật là vi khuẩn và vi nấm.

Nấm men Nấ

Đặc điểm

Phân loại

Sinh sản

Tính chất bắt màu thuốc nhuộm

Gram

Hình thể

Đặc tính quá

trình hô hấp

21

1 Đại cương về vi sinh vật

- Vi khuẩn (Bacteria)

• Đặc điểm:

Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào có cấu tạo tế bào tiền nhân (Procaryote), có kích thước rất nhỏ, khoảng 0,2- 2,0 x 2- 8 μm Vi khuẩn có nhiều hình m Vi khuẩn có nhiều hình dáng khác nhau: hình cầu, hình que, xoắn, dấu phẩy Vi khuẩn sinh sản vô tính, một số tạo bào tử Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ có một bào tử Một số vi khuẩn có khả năng di động nhờ lông (flagella)

• Phân loại:

Với mục đích phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc, ta cần tìm hiểu vi khuẩn theo các nhóm dựa trên hình thể, tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram

và khẳ năng hô hấp của chúng.

1 Đại cương về vi sinh vật

+ Phẩy khuẩn (Vibrio): Vibrio cholerae (Vk hình lò xo).

Theo tính chất bắt mầu thuốc nhuộm Gram

• Sinh sản của vi khuẩn:

- Vi khuẩn sinh sản bằng cách phân đôi tế bào

- Tốc độ phát triển của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy tĩnh thay đổi theo thời gian và tuân theo một quy luật nhất định bao gồm 4 pha: Pha lag, pha logarit, pha ổn định và pha tử vong

- Sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường lỏng có thể quan sát sau khoảng 18- 24 giờ nuôi cấy: làm đục môi trường, tạo váng trên bề mặt hoặc lắng cặn ở đáy ống nghiệm.

- Trong môi trường đặc, vi khuẩn tạo thành các khuẩn lạc có đặc tính riêng về hình dạng, kích thước, màu sắc.

Những tính chất trên giúp cho việc xác định vi khuẩn trong quá trình kiểm nghiệm thuốc.

1 Đại cương về vi sinh vật

Hình 1: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn

1 Đại cương về vi sinh vật

- Vi nấm (Microfungi)

• Đặc điểm:

Vi nấm có cấu tạo tế bào nhân thật

(Eucaryote), tế bào rất nhỏ Nấm không

có chất diệp lục, sống hoại sinh hoặc ký

sinh, sinh sản vô tính hoặc hữu tính.

Vi nấm gồm: Nấm men (Yeast) và Nấm

mốc (Mold)

1 Đại cương về vi sinh vật

Sự ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đối với quá trình phát triển của vi sinh vật

Sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật liên quan chặt chẽ đến các điều kiện của môi trường bên ngoài Đa số các yếu tố đều có một đặc tính tác dụng chung biểu hiện ở 3 điểm tác động: Tối thiểu, tối ưu, cực đại

Các yếu tố bên ngoài có ảnh hưởng đến đời sống của vi sinh vật

là vật lý, hoá học và sinh học, trong đó các yếu tố vật lý là đáng chú ý nhất Yếu tố vật lý bao gồm nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…

1 Đại cương về vi sinh vật

Sự ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đối với quá trình phát triển của vi sinh vật (VSV):

28

 Nhiệt

độ:

- Tế bào sinh dưỡng: chết ở 60 oC /20 - 30 phút

- Bào tử: chỉ bị tiêu diệt ở 120 oC / 30 – 40 phút → tiệt trùng

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường nuôi cấy là những chất dinh dưỡng thích hợp nhằm đảm bảo cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển

Môi trường cần có 3 điều kiện sau: Đầy đủ chất dinh dưỡng theo yêu cầu thí nghiệm, có pH trong khoảng quy định và phải vô trùng

Môi trường gồm 3 loại:

- Môi trường tự nhiên

2.1 Kĩ thuật pha chế môi trường

30

1 Chuẩn bị dụng cụ hoá chất - Dụng cụ: men/thủy tinh

- Nguyên liệu, hóa chất: chất lượng, tinh khiết

2 Cân đong nguyên liệu - Chính xác (nhất là nguyên tố vi lượng gây

ức chế vi khuẩn)

3 Hoà tan nguyên liệu - Nước cất / nước khử khoáng

- Thạch: đun cho tan

5 Làm trong môi trường - Lọc qua vải gạc/giấy

6 Đóng ống tiệt trùng - Thông thường: 110oC/30phút,120oC/20phút

- Các chất phân hủy bởi nhiệt → nhiệt độ thấp

 Pha chế môi trường từ hỗn hợp

bột môi trường chế sẵn

- Pha: nước cất/nước khử khoáng

- Kiểm tra pH

-Môi trường bột khô: được giữ ở 10 - 12 oC

trong điều kiện khô, tránh ánh sáng

-Môi trường đã pha chế được bảo quản ở 4 –

10 oC trong 1 – 2 tháng tuz theo thành phần

môi trường

2.2 Bảo quản môi trường

31

2.3 Các phương pháp tiệt trùng

Tiệt trùng bằng hơi nước

Tiệt trùng bằng nhiệt khô Tiệt trùng gián đoạn

(phương pháp Tyndall)

Khử trùng nhiệt độ thấp (phương pháp Pasteur)

Phương pháp lọc

Phương pháp dùng tia bức xạ

Tiệt

trùng

32

1.Tiệt trùng bằng nhiệt khô

- Tiệt trùng dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt như bông, băng, vải, gạc…

- 180 o C/ 30 phút, 170 o C/ 1 giờ, 160 o C/2 giờ 2.Tiệt trùng bằng hơi nước

- Tiệt trùng môi trường nuôi cấy và các dụng cụ phẫu thuật.

Khử trùng nhiệt độ thấp

(phương pháp Pasteur)

- Tiệt trùng môi trường dễ bị hỏng bởi nhiệt

- Đun cách thuỷ 60 o C/ 30 phút, hoặc 73 o C/ 15 phút → làm lạnh đột ngột <10 o C

3.Phương pháp lọc -- Tiệt trùng các chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệtMàng lọc có kích thước lỗ lọc ≤ 0,22µm

4.Phương pháp dùng tia bức xạ -Tia UV được dùng để tiệt trùng các buồng pha chế, tủ cấy vi sinh

vật.

- Phối hợp dùng hoá chất để khử nấm 33

2.3 Các phương pháp tiệt trùng

 Mục đích:

→ Phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, vi khuẩn nấm trong các chế phẩm như dịch tiêm truyền, một số loại thuốc tiêm, thuốc tra mắt và các dụng cụ y tế mà theo tiêu chuẩn riêng cần phải vô trùng

 Nguyên tắc:

Vi sinh vật có trong chế phẩm thử sẽ phát triển trên các môi trường dinh dưỡng thích hợp, chúng làm đục môi trường lỏng, tạo váng trên bề mặt hoặc lắng cặn ở đáy ống nghiệm Trên môi trường đặc vi khuẩn, vi khuẩn nấm mọc thành các khuẩn lạc đặc trưng

34

3 Thử vô khuẩn

 Môi trường:

- Môi trường Thioglycolat (phát hiện VK hiếu khí và kỵ khí)

- Môi trường Soybean - casein (phát hiện VK hiếu khí và

nấm)

→ Có thể dùng các môi trường khác:

• MT canh thang cao thịt - pepton → vi khuẩn hiếu khí

• MT Wilson - Blair → vi khuẩn kị khí

• MT Sabouraud lỏng → vi nấm

35

3 Thử vô khuẩn

0,50 g

2,50 g

5,50 g

5,00 g

15,0 g

0,50 g

Cao nấm men(có khả năng tan trong

nước) Casein thủy phân bởi pancreatin

Natri thioglycolat

(hoặc acid thioglycolic 0,3 ml)

Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha)

Nước

pH sau khi tiệt khuẩn:

1 ml

1000 ml7,1 ± 0,2

Ví dụ: Môi trường thioglycolat không có thạch

0,50 g2,50 g5,50 g0,75 g5,00 g15,00

g0,50 g

Cao nấm men (có khả năng tan trong

nước) Casein thủy phân bởi pancreatin

Natri thioglycolat

(hoặc acid thioglycolic 0,3 ml)

Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha)

Nước

pH sau khi tiệt khuẩn

1,0 ml

1000 ml7,1 ± 0,2

Ví dụ: Môi trường thioglycolat có thạch

Casein thủy phân bởi pancreatin

Bột đậu tương thủy phân bởi

papain Natri clorid

1000 ml7,3 ± 0,2

Ví dụ: Môi trường Soybean - casein

 Kiểm tra chất lượng môi trường:

 Độ vô trùng

- Lấy 1-2 ống/bình môi trường mới làm → ủ ở 30 - 35 oC ít nhất trong 4

ngày đối với môi trường phát hiện vi khuẩn, và 25 - 28 oC ít nhất trong

7 ngày với môi trường phát hiện vi nấm Sau thời gian nuôi cấy, các ống môi trường không được có vi sinh vật mọc

39

3 Thử vô khuẩn

 Kiểm tra chất lượng môi trường:

 Khả năng dinh dưỡng

- Cấy vào mỗi ống môi trường khoảng 100 tế bào các VSV sau:

+ Vi khuẩn hiếu khí: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa

+ Vi khuẩn kỵ khí: Clostridium sporogenes

+ Vi nấm: Candida albicans, Aspergillus niger

- Nuôi cấy 30 - 35oC / 3 ngày (vi khuẩn), 25 - 28oC / 5 ngày (vi nấm)

→ Vi sinh vật phải phát triển tốt trên các môi trường

40

3 Thử vô khuẩn

 Lấy mẫu thử:

-Toàn bộ số ống/lọ thuốc được khử trùng hoặc được phân bố vô trùng trong cùng một điều kiện → lô thuốc

- Lô <100 đơn vị, lấy 3 đơn vị

- Nếu nhiều hơn thì cứ 50 đơn vị lấy thêm 1 đơn vị nhưng ≤ 10

Dựa vào tiêu chuẩn ngành hoặc tiêu chuẩn cơ sở của từng sản phẩm để lấy mẫu cho thích hợp

41

3 Thử vô khuẩn

 Kiểm tra tác dụng ức chế vi sinh vật của chế phẩm thử :

Mục đích: kiểm tra chế phẩm có tác dụng ức chế VSV do chất bảo quản hay

không

 Tiến hành:

-Lấy ít nhất 2 ống của mỗi loại môi trường, cấy chế phẩm cần thử vào 1 trong 2 ống

-Cấy khoảng 100 tế bào (0,1 ml nhũ dịch VSV được pha ở nồng độ thích hợp) vào

cả 2 ống của các môi trường tương ứng

-Nuôi cấy 30 - 35oC/4 ngày (vi khuẩn) và 25 - 28oC/7 ngày (vi nấm)

42

3 Thử vô khuẩn

 Kiểm tra tác dụng ức chế vi sinh vật của chế phẩm

thử :

 Đánh giá kết quả:

43

Giống nhau giữa 2 ống (mọc

Ống có chất thử, VSV phát triển yếu hoặc không phát

 Xử lý kết quả:

- Tác dụng ức chế → loại bỏ bằng cách pha loãng, trung hoà, hoặc dùng phương pháp màng lọc

3 Thử vô khuẩn