KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH học p1

vô khuẩn và đếm SL VSV trong 1 g1ml DPNêu được vai trò của PP sinh học trong KN chất kháng sinh, và TB được thử nghiệm ĐL chất KS bằng PP khuếch tán.. Xác định hoạt lực kháng sinh bằng p

Trường Đại học Duy Tân

Khoa Dược

Bộ môn Phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất

CHƯƠNG V - KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC

(2 giờ)

Giảng viên: Phan Thị Thu Trang Email: phantttrang47@gmail.com

SĐT: 0702396147

vô khuẩn và đếm SL VSV trong 1 g(1ml) DP

Nêu được vai trò của PP sinh học trong KN chất kháng sinh, và TB được thử nghiệm ĐL chất KS bằng PP khuếch tán.

Mục tiêu bài học

Nội dung bài học

1 Đại cương về vi sinh vật

2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

3 Thử vô khuẩn

4 Thử giới hạn vi sinh vật

5 Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử vi sinh vật

I Mở đầu

1.1 Nguyên tắc của phương pháp sinh học:

- So sánh hiệu lực tác dụng hoặc các đặc tính riêng của chất thử với chất chuẩn tương ứng trong cùng một điều kiện và thời gian thí nghiệm.

- Trong KN thuốc:

+ KN thuốc bằng các phương pháp thử trên động vật.

+ KN thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật.

1.2 Chất chuẩn:

- Chất chuẩn gốc

- Chất chuẩn thứ cấp

3 Đánh giá kết quả:

- Đánh giá bằng toán thống kê.

- Độ chính xác của phép thử được thể hiện bằng giới hạn tin cậy.

I Mở đầu

II Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật

2.1 Nguyên tắc:

2.2 Động vật thí nghiệm:

- Phải đồng đều, thuần khiết về nòi giống

- Khoẻ mạnh, không nhiễm bệnh

- Không có thai

- Được nuôi dưỡng đầy đủ

II Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật

2.4 Liều:

- Là lượng chế phẩm thử đưa vào cơ thể động vật một lần cho từng mục đích thí nghiệm.

II Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật

2.5 Các thử nghiệm trên ĐV được áp dụng trong KNT:

- Thử độc tính bất thường

- Thử chất hạ huyết áp

- Thử chất gây sốt

- Định lượng các hormon: gonadorelin,

corticotrophin,insulin, oxytocin, menotrophin

- Kiểm tra tính an toàn của vaccin và sinh phẩm.

- Xác định hiệu lực của các vaccin và antitoxin.

III Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử

vi sinh vật

3.1 Đại cương về vi sinh vật

Vi sinh vật

Nấm men Nấm

Vi khuẩn

Vi sinh vật

Nấm mốc

Đặc điểm Phân loại

Sinh sản

Tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram Hình thể

Đặc tính quá trình hô hấp

3.1 Đại cương về vi sinh vật

❖ Sự ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đối với quá trìnhphát triển của vi sinh vật (VSV):

➢ Nhiệt độ:

- Bào tử: chỉ bị tiêu diệt ở 120oC / 30 – 40 phút → tiệt trùng

3.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

❖ Phân loại:

- Môi trường tự nhiên: động vật hay thực vật

- Môi trường tổng hợp: hoá chất thuần khiết,hòa tan trong nước

- Môi trường bán tổng hợp: nguyên liệu tự nhiên và tổng hợp

→ Đáp ứng các điều kiện: - Đầy đủ chất dinh dưỡng

- pH trong khoảng quy định

- Vô trùng

3.2.1 Kĩ thuật pha chế môi trường

1 Chuẩn bị dụng cụ hoá chất - Dụng cụ: men/thủy tinh

- Nguyên liệu, hóa chất: chất lượng, tinh khiết

2 Cân đong nguyên liệu - Chính xác (nhất là nguyên tố vi lượng gây

ức chế vi khuẩn)

3 Hoà tan nguyên liệu - Nước cất / nước khử khoáng

- Thạch: đun cho tan

4 Điều chỉnh pH - NaOH 1N, HCl 1N

5 Làm trong môi trường - Lọc qua vải gạc/giấy

6 Đóng ống tiệt trùng - Thông thường: 110oC/30phút,120oC/20phút

- Các chất phân hủy bởi nhiệt → nhiệt độ thấp

❖ Pha chế môi trường từ hỗn

hợp bột môi trường chế sẵn

- Pha: nước cất/nước khử khoáng

- Kiểm tra pH

- Môi trường bột khô: được giữ ở 10 - 12oC trong điều kiện khô, tránh ánh sáng.

tháng tuỳ theo thành phần môi trường

3.2.2 Bảo quản môi trường

3.2.3 Các phương pháp tiệt trùng

Tiệt trùng bằng hơi nước

Tiệt trùng bằng nhiệt khô

Tiệt trùng gián đoạn (phương pháp Tyndall)

Khử trùng nhiệt độ thấp (phương pháp Pasteur)

Phương pháp lọc

Phương pháp dùng tia bức xạ Tiệt trùng

1.Tiệt trùng bằng nhiệt khô

- Tiệt trùng dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt như bông, băng, vải, gạc…

- 180 o C/ 30 phút, 170 o C/ 1 giờ, 160 o C/2 giờ 2.Tiệt trùng bằng hơi nước

- Tiệt trùng môi trường nuôi cấy và các dụng cụ phẫu thuật.

- Nồi hấp: 121 o C/ 15 phút

Tiệt trùng gián đoạn

(phương pháp Tyndall)

- Tiệt trùng môi trường dễ bị hỏng bởi nhiệt

- Hấp 3 - 4 lần/ không quá 100 o C trong 30 – 40 phút, ủ

ở 28 - 32 o C/ 24 giờ, cách 24 giờ hấp lần tiếp theo

Khử trùng nhiệt độ thấp

(phương pháp Pasteur)

- Tiệt trùng môi trường dễ bị hỏng bởi nhiệt

- Đun cách thuỷ 60 o C/ 30 phút, hoặc 73 o C/ 15 phút → làm lạnh đột ngột <10 o C Phương pháp này không diệt được bào tử

3.Phương pháp lọc - Tiệt trùng các chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệt

❑ Mục đích:

dịch tiêm truyền, thuốc tra mắt, các dụng cụ y tế mà phải vôtrùng

❑ Nguyên tắc:

- Vi khuẩn/nấm cấy vào môi trường có chất dinh dưỡng vànước, ở nhiệt độ thích hợp → phát triển → biến đổi môitrường

3.3 Thử vô khuẩn

19

❑ Môi trường:

➢ Môi trường Thioglycolat

➢ Môi trường Soybean - casein

3.3.Thử vô khuẩn

❑ Kiểm tra chất lượng môi trường:

➢ Độ vô trùng

25 – 28oC ít nhất trong 7 ngày với môi trường phát hiện vi

được có vi sinh vật mọc

3.3 Thử vô khuẩn

❑ Kiểm tra chất lượng môi trường:

➢ Khả năng dinh dưỡng

Pseudomonas aeruginosa

nấm)

3.3 Thử vô khuẩn

❑ Lấy mẫu thử:

- Toàn bộ số ống/lọ thuốc được khử trùng hoặc được phân bố

- Lô <100 đơn vị, lấy 3 đơn vị

Dựa vào tiêu chuẩn ngành hoặc tiêu chuẩn cơ sở của từngsản phẩm để lấy mẫu cho thích hợp

3.3 Thử vô khuẩn

❑ Kiểm tra tác dụng ức chế vi sinh vật của chế phẩm thử :

➢ Mục đích: kiểm tra chế phẩm có tác dụng ức chế VSV do chấtbảo quản hay không

➢ Tiến hành:

- Lấy ít nhất 2 ống của mỗi loại môi trường, cấy chế phẩm cầnthử vào 1 trong 2 ống

- Cấy khoảng 100 tế bào (0,1 ml nhũ dịch VSV được pha ở nồng

độ thích hợp) vào cả 2 ống của các môi trường tương ứng

nấm)

3.3 Thử vô khuẩn

❑ Kiểm tra tác dụng ức chế vi sinh vật của chế phẩm thử :

➢ Đánh giá kết quả:

Giống nhau giữa 2 ống (mọc nhanh và phong phú) Không có chất ức chếỐng có chất thử, VSV phát triển yếu hoặc không

phát triển so với ống không có chất thử Có chất ức chế

➢ Xử lý kết quả:

hoặc dùng phương pháp màng lọc

3.3 Thử vô khuẩn

Phương pháp dùng màng lọc

Phương pháp thử

Phương pháp nuôi cấy trực tiếp

3.3 Thử vô khuẩn

❑ Dụng cụ, thiết bị

- Thuỷ tinh, thép không rỉ hoặc nhựa gồm 2 bộ phận có thể tháorời, ở giữa có lưới đỡ màng lọc

+ Nitrat celleulose: lọc nước, dầu, và dung dịch alcol yếu

+ Acetat cellulose: lọc các dung dịch alcol mạnh

❑ Áp dụng: kiểm nghiệm các thuốc có tác dụng ức chế vi sinhvật, đặc biệt là kháng sinh, nhưng đòi hỏi thiết bị tốt và điều kiện

vô trùng cao

3.3.1 Phương pháp dùng màng lọc

3.3.1 Phương pháp dùng màng lọc

màng lọc → Cấy vào môi trường trong thời gian quy định → Quan sát hiện tượng, nhận định kết quả.

Hình ảnh khuẩn lạc mọc trên màng lọc

3.3.1 Phương pháp dùng màng lọc

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy trực tiếp

Dụng cụ - Bơm tiêm, pipet, các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi

trường (đĩa petri) → vô khuẩn

Số lượng - Theo bảng trên

Kỹ thuật

thử

- Dùng bơm tiêm hoặc pipet lấy mẫu thử→cấy vào môi trường

- Ủ môi trường phát hiện vi khuẩn ở 30 - 35 °C/ ít nhất 4 ngày; nấm ở 25 - 28 °C/ ít nhất 7 ngày; theo dõi

❑ Lưu ý:

• Lấy mẫu thử:

- Dầu/dd dầu → thêm vào môi trường nuôi cấy 1% tween 80

hoặc các chất nhũ hoá khác với nồng độ thích hợp

- Mỡ/kem → hoà loãng vào dd pepton 0,1% vô trùng theo tỷ lệ1/10 trước khi cấy vào môi trường (dung dịch pepton cần thêmtween 80 với tỷ lệ 1ml/1lít)

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy trực tiếp

❖ Đĩa petri ❖ Các kiểu cấy trên thạch đĩa

❖ Vi khuẩn/nấm mọc

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy trực tiếp

❖ Ưu điểm:

- Kỹ thuật đơn giản

❖ Nhược điểm:

- Khả năng phát hiện vi sinh vật giảm khi số lượng vi sinh vật

có ít và phân phối trong một thể tích chất thử lớn

- Phương pháp này không thực hiện được với các chế phẩm

có tác dụng ức chế và các chất kháng sinh

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy trực tiếp

❑ Áp dụng:

tiệt trùng trong quá trình sản xuất

❑ Mục đích:

trong 1g/1ml chế phẩm thử

- Phát hiện các VK chỉ điểm vệ sinh quy định không được có

trong thuốc là: S aureus, P aeruginosa, E coli, các loài

Salmonella, VK kỵ khí Clostridia.

3.4 Thử giới hạn vi sinh vật

❑ Nguyên tắc:

- Đếm số VSV qua khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch

- Dựa vào đặc tính hình thái, sinh lý → xác định VK gây bệnh

- Đánh giá chất lượng của thuốc theo TCDĐ hoặc TCCS

❑ Chuẩn bị mẫu thử:

- Rắn: hòa tan trực tiếp hoặc nghiền mịn với dung môi.

- Lỏng (dung dịch thực, nhũ dịch trong nước, chất rắn hòa tan dễ dàng trong nước ): dùng đệm phosphat pH 7,2 hoặc dung dịch natri clorid 0,9 % để hòa loãng.

- Lỏng không hòa lẫn trong nước (dầu, kem, sáp): thêm chất nhũ hóa, khuấy trộn cơ học hoặc làm nóng nhẹ 45 °C → tạo nhũ dịch.

- Dạng khí dung - lỏng: Làm lạnh bình để các khí hóa lỏng,mở nắp lấy một lượng thích hợp để thử.

3.4 Thử giới hạn vi sinh vật

➢ Tiến hành (Phương pháp đĩa thạch):

1ml chất thử (<300 khuẩn lạc/1ml)

15-20ml thạch casein – đậu tương (45 o C)

Nuôi cấy 30-35 o C/2-3 ngày

1ml chất thử (<100 khuẩn lạc/1ml) 15-20ml thạch Sabouraud + kháng sinh

Nuôi cấy 25-28 o C/4-5 ngày

- Thực hiện với 1 - 2 nồng độ cuối cùng, mỗi nồng độ làm 2-3 đĩa thử.

- Đếm số khuẩn lạc để tính số lượng.

4 Thử giới hạn vi sinh vật

➢ Tính kết quả:

- Tổng số VK hiếu khí, vi nấm trong 1g (1ml) được tính:

(Phép thử thực hiện với 2 nồng độ).

A1 : Số khuẩn lạc vi sinh vật trung bình ở nồng độ pha loãng k1.

A2 : Số khuẩn lạc vi sinh vật trung bình ở nồng độ pha loãng k2.

k1, k2 : Độ pha loãng.

➢ Đánh giá: mẫu thử có ít hơn 10 VSV/1g (1ml) nếu không có khuẩn lạc mọc trên đĩa thử ở nồng độ 10-1.

4 Thử giới hạn vi sinh vật

❑ Mục đích:

- Đánh giá hoạt tính sinh học của thuốc

- Kiểm tra được sự giảm hay mất hoạt lực của chất kháng sinh

- Xác định hoạt lực các chất kháng sinh có cấu trúc phức tạphoặc một hỗn hợp nhiều thành phần có tác dụng

- Cho biết độ nhạy cảm của vi khuẩn gây bệnh và mức độ khángthuốc của chúng

- Chọn kháng sinh thích hợp cho bệnh nhân trong điều trị

3.5.Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử VSV

❑ Nguyên tắc:

- Hoạt lực của một chất kháng sinh được xác định bằng cách sosánh khả năng ức chế của chủng chỉ thị, bởi những nồng độ đãbiết của kháng sinh thử (chưa biết hoạt lực) và nồng độ đã biếtcủa kháng sinh chuẩn (đã biết rõ hoạt lực)

3.5.Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử VSV

43

❑ Chủng chỉ thị:

- Chủng VSV thuần khiết, nhạy cảm với một chất kháng sinh

- Phân lập từ các bảo tàng giống Quốc gia

- Bảo quản trong ống đông khô hoặc trong môi trường thíchhợp ở 4 - 10oC

❑ Chất chuẩn:

- Độ tinh khiết cao

❑ Đơn vị hoạt lực: U / UI / IU.

❑ Môi trường và dung môi thử: tùy kháng sinh và VSV chỉ thị.

3.5.Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử VSV

Phương pháp

đo độ đục

Phương pháp thử

Phương pháp khuếch tán

3.5.Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử VSV

Phương pháp khuếch tán

- Cho môi trường đã được cấy chủng chỉ

thị vào đĩa petri (dày 2-5mm)

- Đặt các ống trụ (hoặc giấy tẩm kháng

sinh) chứa chất chuẩn và chất thử như

hình vẽ

- Để ở nhiệt độ phòng 2 giờ

- Ủ ở nhiệt độ thích hợp trong 16 – 18 giờ

- Đo đường kính vùng ức chế tạo bởi các

nồng độ chuẩn và thử

- Tiến hành với 10 đĩa thử song song.

Vị trí đặt chất thử và chất chuẩn với thử nghiệm 3 liều

3.5.Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử VSV

Tóm tắt

Mục đích, nguyên tắc, phương pháp khuếch tán, đánh giá kết quả

Đại cương Nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng

MT nuôi cấy VSV

Kĩ thuật pha chế

MT Tiệt trùng

6 bước

4 phương pháp

Lọc qua màng lọc Thử vô khuẩn

Nuôi cấy trực tiếp

Thử giới hạn nhiễm khuẩn

Xác định hoạt lực kháng

sinh bằng pp thử VSV

Mục đích, nguyên tắc, phương pháp thử, đánh giá kết quả

Câu 1: Động vật thí nghiệm cần đảm bảo

những yêu cầu gì?

Câu 2: Các thử nghiệm trên động vật được

áp dụng trong kiểm nghiệm thuốc là gì?

Câu 3: Trình bày các phương pháp thử vô

khuẩn

Câu hỏi lượng giá