PCR (polymerase chain reaction)

PP khuếch đại in vitro để tạo ra nhiều bản sao của1 đoạn DNA đích  là công cụ mạnh để , nghiên cứu Y- Sinh học, đặc biệt trong  các tác nhân VSV gây bệnh... RT- PCR Reverse Transcrip

PCR (Polymerase Chain Reaction)

GIỚI THIỆU VỀ PCR

dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis & cs phátminh năm 1985

Chỉ 8 năm sau

hóa học

PP khuếch đại in vitro để tạo ra nhiều bản sao của

1 đoạn DNA đích

 là công cụ mạnh để , nghiên cứu Y- Sinh

học, đặc biệt trong  các tác nhân VSV gây bệnh

Trình tự đích

Chuỗi DNA

Chuỗi DNA xoắn đôi Chuỗi DNA

siêu cuốn

Nhiễm sắc thể

NGUYÊN TẮC CỦA PƯ PCR

 PCR dựa trên qt sao chép DNA trong tb

Caáu truùc DNA

Chuoãi xoaén keùp DNA

Hướng 5’ đến 3’ của

khung Đường- Phosphate

5’ đầu tận

3’ đầu tận

Quy trình PCR: 20-40 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước:

• Biến tính DNA: 94-96 o C/1-2’  tách mạch đôi DNA

- t  độ dài DNA mẫu (30’’  vài phút)

Z = m x 2n Z: số bản sao đạt được

m: số DNA mẫu ban đầu n: số chu kỳ khuếch đại

Chu kỳ PCR

Trình tự đích Trình tự đích

Chu kỳ PCR - Bước 2

Bắt cặp mồi đến đầu tận của trình tự đích

(theo chiều 5‘  3‘)

Chu kỳ PCR - Bước 3

Taq DNA polymerase Kéo dài Primer

Kết thúc chu kỳ PCR đầu tiên

 Tạo 2 copies của Trình tự đích

1 chu kyø = 2 Amplicon

2 chu kyø = 4 Amplicon

3 chu kyø = 8 Amplicon

4 chu kyø = 16 Amplicon

5 chu kyø = 32 Amplicon

6 chu kyø = 64 Amplicon

7 chu kyø = 128 Amplicon

* Các pp SHPT dựa trên PCR

• PCR (Polymerase Chain Reaction)

* RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)

* Real-time PCR

* Multiplex-PCR

* Nested PCR

• Lai phân tử (Dot-Blot)

• Giải trình tự chuỗi (Sequencing)

• RFLP

RT- PCR (Reverse Transcription PCR)

Mục đích: phát hiện 1 trình tự đích từ RNA

Reverse Transcription - Bước 1 –

mồi bắt cặp với trình tự RNA

Reverse Transcription - Bước 2

rTth DNA Polymerase kéo dài Primer

Kết thúc Reverse Transcription - Bước 3

Tổng hợp DNA bổ sung (cDNA) với trình tự đích RNA

Real-Time PCR

Là 1 kỹ thuật PCR sử dụng chất huỳnh quang để

đồng thời phát hiện & định lượng

1 hoặc nhiều trình tự DNA đích trong phản ứng PCR

CHẤT PHÁT HUỲNH QUANG

TIẾN HÀNH PƯ PCR

1 Khu vực PTN PCR đơn giản

2 Trang thiết bị cần thiết cho phòng xét nghiệm PCR

3 Hóa chất, thuốc thử PCR

3.1 Hóa chất tách chiết DNA / RNA

3.2 Thành phần phản ứng PCR (PCR mix)

4 Các bước tiến hành PCR

1 Khu vực PTN PCR đơn giản

2 Trang thiết bị cần thiết

cho một phòng xét nghiệm PCR

Chuẩn bị phản ứng PCR (Pre-PCR)

1 Buồng vô trùng (Dead-air Box)

2 Tủ lạnh chứa thuốc thử

3 Buồng cấy an toàn sinh học

4 Máy ly tâm và/hoặc siêu ly tâm chuẩn cho chẩn đoán

5 Bồn ủ nhiệt khô

6 Tủ lạnh chứa bệnh phẩm

Thực hiện PCR

7 Máy luân nhiệt PCR

(PCR machine)

Khuếch đại

ĐIỆN DI SP KHUẾCH ĐẠI

Đọc kết quả

(Post- PCR)

Thiết bị xem ảnh

ĐIỆN DI SẢN PHẨM KHUẾCH ĐẠI

3 Hóa chất, thuốc thử PCR

3.1 Hóa chất tách chiết DNA / RNA

• Phương pháp Boom:

guanidine thiocyanate (GuSCN) ly giải protein TB, kể cả nuclease

=> DNA / mẫu bám vào các hạt silica

=> ly trích và tinh khiết được DNA từ mẫu

• Phương pháp tủa:

Dung dịch Phenol / Chloroform /Isoamyl Alcohol (P/C/I) biến tính

và tủa protein

=> DNA / pha lỏng kết tủa bởi ethanol / nồng độ muối cao.

Phương pháp cột:

Phương pháp Boom

 Breaking the cell membrance

 Removing proteins

 Precipitating

Phương pháp Phenol-chloroform (tủa)

Ly giải mẫu

Chất tẩy ly giải màng tế bào

Proteinase K phá hủy proteins.

Nạp mẫu vào cột

Nucleic acids gắn vào màng lọc

và các thành phần khác đi qua màng

Rửa cột

Loại bỏ tất cả các chất bẩn có thể hiện diện.

Dung giải, thu DNA

DNA được giải phòng khỏi cột và sẳn sàng cho các ứng dụng sau đó: PCR, lai phân tử, tạo dòng

Phương pháp Cột

 Ổn định và hiệu suất cao hơn làm bằng tay

 Thích hợp với nhiều loại mẫu và hàm lượng mẫu khác nhau

 Giảm công lao động và thời gian

 Số lượng mẫu lớn và linh động

 Chi phí hiệu quả

 Hóa chất có thể tự pha chế

3.2 Thành phần phản ứng PCR

(PCR mix)

• DNA mẫu (template) cần phát hiện

• Enzym khuếch đại: Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus),

rTth DNA polymerase (Thermus thermophilus)

PCR MIX

4 Các bước tiến hành PCR

QUI TRÌNH PCR

1 Phát hiện & định lượng VSV gây bệnh

• Tác nhân khĩ nuơi cấy hay khơng nuơi cấy được

(VK lậu, HBV, HCV, …)

• Tác nhân cĩ thời gian nuơi cấy quá dài

(VK M tuberculosis)

• Tác nhân vi sinh vật nguy hiểm (virus H5N1,…)

• Tác nhân nuơi cấy thất bại vì cĩ mặt rất ít trong bệnh

phẩm, đã bị điều trị bằng KS trước

ỨNG DỤNG PƯ PCR TRONG CHẨN

ĐỐN BỆNH NHIỄM VSV

2 Phát hiện độc tố VSV

PCR trong chẩn đoán xđ lao

• Chẩn đoán xđ nhanh và chính xác

• Chẩn đoán xđ nhiều t/h lao phổi mà soi không thấy, cấy không ra

• Các trường hợp lao ngoài phổi rất khó chẩn đoán

lao màng tim, lao xương

PCR trong chẩn đoán & điều trị HBV

PCR trong điều trị HCV

• Human papilloma virus

– Chẩn đoán chính xác

– Định type