PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) và một số ỨNG DỤNG TRONG VI SINH vật

Quá trình khuyếch đại gen: Phản ứng PCR được thực hiện sau khi cho tất cả các thành phần phản ứng vào, bao gồm: mẫu tách chiết ADN, Taq ADN polymerase, dNTP và các thành phần khác Ví dụ

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) VÀ MỘT

SỐ ỨNG DỤNG TRONG VI SINH VẬT

1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp PCR được nhà vi sinh Kary Mullis nghiên cứu phát minh ra vào năm

1980 Những ứng dụng của phương pháp này có ý nghĩa lớn trong chẩn đoán vi sinh, cũng như trong nghiên cứu vì có độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao Với thành

tựu này ông đã nhận được giải thưởng Nobel năm 1993

1.1 Nguyên lý Phản ứng PCR dùng một đoạn mồi (primer) đặc hiệu để khuyếch

đại một đoạn ADN nhỏ đặc hiệu trên phân tử ADN Đoạn ADN này có thể là một gen hoặc là một chỉ là một phần của gen nào đó hoặc là một trình tự không mã hóa Hầu hết kỹ thuật PCR khuyếch đại đoạn ADN có kích thước dưới 10kp, cho dù có một số kỹ thuật có thể cho phép khuyếch đại đoạn ADN có kích thước tới 40 kb Phản ứng PCR hoàn toàn dựa theo quá trình sao chép ADN trong tế bào Trong đó ADN được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn Từ một phân tử ADN chuỗi kép ban đầu được tách ra làm 2 chuỗi đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp ADN mới, chu kỳ nhân lên của ADN trong tế bào có thể chia làm 3 giai đoạn: tách chuỗi kép thành hai chuỗi đơn dùng làm khuôn mẫu tổng hợp ADN

mới, tại nơi 2 chuỗi tách rời nhau, các mồi đặc hiệu đến lai ghép theo nguyên tắc

bổ sung và kéo dài đoạn mồi đã được lai ghép nhờ ADN polymerase để tạo nên

ADN mới Từ 1 phân tử ADN ban đầu sau 1 chu kỳ sao chép đã tạo thành 2 phân

tử ADN chuỗi kép mới Do vậy, một ADN sau n chu kỳ nhân đôi thì sẽ thu được 2

[sup]n-1[/sup] ADN mới [52]

1.2 Các điều kiện để tiến hành kỹ thuật PCR 1.2.1 Thành phần tham gia phản

ứng - Một cặp mồi (5' - 3'): là đoạn ADN có trình tự bổ sung với đoạn ADN nhỏ

trên vùng ADN sẽ được khuyếch đại theo chiều từ 5’ – 3’

Ví dụ mồi cho vi khuẩn Haemophilus influenzae (gen bexA):

Hib 1 : GCG AAA GTG ACC TCT TAT CTC TC

Hib 2 : GCT TAC GCT TCT ATC TCG GTG AA

- Enzyme Taq ADN polymerase hoặc ADN polymerase với nhiệt độ hoạt động tối

ưu là xung quanh 70[sup]o[/sup]C

- Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) gồm : ATP (Adenin), TTP (Thymin), GTP (Guanin), CTP (Cytosin)

- Thang ADN mẫu dùng trong diện di gen

Đệm, nước khử ion, MgCl[sub]2[/sub] 25mM, KCl 50mM 1.2.2 Dàn máy PCR

-Máy điều nhiệt (Thermal cycler):

- Bộ điện di:

- Máy chụp gen:

1.3 Các bước tiến hành phản ứng PCR

1.3.1 Tách chiết ADN

Đây là giai đoạn tách chiết AND ra khỏi tế bào Có nhiều phương pháp tách chiết

như bằng nhiệt độ hoặc bằng KIT thương mại

Ví dụ: tách chiết AND của Haemophilus influenzae

- Cho vi khuẩn vào trong 500ml PBS để có độ đục Mac farland (10[sup]9[/sup]– 5.10[sup]9[/sup] vi khuẩn) Sau đó tiến hành khuấy đều bằng máy Vortex

- Đun cách thuỷ trong 20 phút để giải phóng ADN

- Ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút/10 phút

- Chuyển phần nước nổi (chứa ADN khuôn mẫu) sang ống Eppendorf mới

- ADN khuôn mẫu này được bảo quản trong tủ -70[sup]0[/sup]C nếu không tiến hành phản ứng ngay

1.3.2 Quá trình khuyếch đại gen:

Phản ứng PCR được thực hiện sau khi cho tất cả các thành phần phản ứng vào, bao

gồm: mẫu tách chiết ADN, Taq ADN polymerase, dNTP và các thành phần khác (Ví dụ: Phản ứng PCR của mỗi mẫu chẩn đoán Haemophilus influenzae được thực

hiện với thể tích cuối cùng là 50 ml, bao gồm: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH

8.3), 2 mM MgCl[sub]2[/sub], 200 mM mỗi loại dNTP, 2.5U Taq ADN

polymerase và 40 pmol mỗi mồi) Quá trình khuyếch đại gen trải qua 3 giai đoạn chính [41]:

- Giai đoạn 1: Biến tính ADN khuôn mẫu ở khoảng 95[sup]0[/sup]C (thời gian tuỳ

loại vi khuẩn) để cho 2 sợi ADN tách rời nhau, bộc lộ trình tự chuỗi đích (là đoạn ADN đặc hiệu cần khuyếch đại)

- Giai đoạn 2: Gắn mồi ở khoảng 55[sup]0[/sup]C (thời gian tuỳ loại vi khuẩn) các nucleotide trên đoạn mồi xuôi và mồi ngược sẽ được gắn bổ sung với các

nucleotide ở 2 đầu (trên 2 sợi) của đoạn gen cần tổng hợp

- Giai đoạn 3: Kéo dài mồi ở khoảng 72[sup]0[/sup]C (thời gian tùy loại vi khuẩn)

nhờ hoạt động của Taq ADN Polymerase mà các dNTPs được gắn vào đầu 3’của

đoạn mồi theo trình tự bổ sung với các nucleotide trên ADN khuôn mẫu

Khi quá trình tổng hợp trên được hoàn thành, đoạn mồi đó là một phần của sợi ADN mới tổng hợp Cứ như vậy, 3 giai đoạn trên được lặp đi lặp lại khoảng 30 chu

kỳ Đoạn ADN mới được tổng hợp lại tham gia làm khuôn mẫu cho phản ứng tiếp theo Kỹ thuật PCR cho phép nhân lên bất kỳ một đoạn vật liệu di truyền nào với tốc độ nhanh hơn rất nhiều lần so với sự nhân lên của chúng ở tế bào Chỉ trong khoảng thời từ 2-4 giờ, số lượng bản sao có thể tăng lên tới hàng triệu lần so với ban đầu

1.3.3 Điện di:

Sản phẩm của đoạn ADN khuyếch đại được điện di trên thạch agarose Tùy theo kích thước của ADN mà sử dụng điện trường khác nhau

1.3.4 Đọc kết quả:

Dựa vào ADN mẫu trên nền đèn cực tím, xác định sản phẩm khuyếch đại tương ứng với kích thước của ADN đó

6, 7, 8, 9 (Haemophilus influenzae typ b)

2 Một số ứng dụng của phản ứng PCR trong vi sinh vật

Dựa trên nguyên tắc khuyếch đại đoạn gen đặc hiệu, hiện nay hầu như tất cả các vi sinh vật gây bệnh đều có thể tìm được nhờ PCR Sau đây là một số ứng dụng điển hình:

2.1 Dùng PCR để chẩn đoán những vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn:

- Các xoắn khuẩn: tất cả các xoắn khuẩn đều khó nuôi cấy

Tác nhân gây bệnh giang mai (Treponema pallidum), hiện nay vẫn chưa nuôi cấy

nhân tạo được Người ta có thể dùng nước ối từ mẹ làm bệnh phẩm cho PCR (1) Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh có thể được chẩn đoán rất sớm

- Các tác nhân gây bệnh đường sinh dục: Tác nhân gây bệnh lậu và các viêm niệu đạo sau lậu để khó nuôi cấy Neisseria gonorrhoeae (4) và các tác nhân thường gây

viêm niệu đạo sau lậu (Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum và Mycoplasma genitalium) đã có thể đồng thời tìm được trong một ống PCR duy

nhất với bệnh phẩm là nước tiểu (5) Điều này không những mang lại lợi ích thiết thực cho bệnh nhân mà còn góp phần đắc lực cho nghiên cứu, tìm hiểu, đánh giá tình hình bệnh một cách sát thực hơn, do trước đây không có điều kiện nuôi cấy tìm cǎn nguyên gây bệnh

- Vi khuẩn lao:

Mycobacterium tuberculosis không phải là quá khó nuôi cấy; tuy vậy, chúng mọc rất chậm (thời gian nhân đôi từ 14 - 15 giờ, so với E coli, khoảng 20 phút).

Khoảng 2 tháng sau khi nuôi cấy mới nhìn thấy khuẩn lạc lao Vì vậy, giá trị phục

vụ lâm sàng của phương pháp nuôi cấy bị hạn chế rất nhiều Phương pháp nhuộm soi từ bệnh phẩm thì có độ nhạy rất kém (phải có trên 10[sup]5[/sup] vi khuẩn/ml đờm mới cho kết quả dương tính)

PCR đã góp phần đắc lực giải quyết việc này Nó có thể cho kết quả trong vòng 1

-2 ngày với độ nhạy gấp khoảng 10.000 lần so với các phương pháp cổ điển Vì vậy, có thể chứng minh được sự có mặt của vi khuẩn lao trong dịch não tuỷ, nước tiểu và các loại bệnh phẩm chứa ít vi khuẩn mà trước đây chẩn đoán rất khó khǎn Ngày nay, người ta còn dùng PCR để xác định các đột biến kháng Rifamicin (dấu

hiệu rất có giá trị để coi một M tuberculosis là đa đề kháng) ở gen rpoB Nhờ vậy,

những biện pháp điều trị phù hợp được áp dụng một cách kịp thời; điều đó mang lại lợi ích không nhỏ cho bệnh nhân và cộng đồng, vì rằng những chủng vi khuẩn lao đa đề kháng đã được hạn chế tung ra môi trường bên ngoài

- Helicobacter pylori (HP): HP hiện đang là một trong những vấn đề thời sự của Y

học thế giới vì vai trò quan trọng của nó trong các bệnh lý viêm, loét và ung thư dạ dày

Tuy vậy, nuôi cấy HP rất khó PCR đã được dùng để tìm HP trực tiếp từ mảnh sinh thiết dạ dày, hoặc tìm các gen (VacA, CagA) liên quan tới độc tính của nó Nhờ

PCR, người ta còn biết được sự phân bố của các chủng HP khác nhau trên các vùng địa lý khác nhau hoặc các chủng HP đặc biệt liên quan mật thiết đến những tình trạng bệnh lý nhất định

- Các vi khuẩn khác như Coxiella burnetti với mảnh 438-bp của gen mã hoá cho một protein 27kDa của màng ngoài; Salmonella typhi với mảnh 343-bp mã hoá cho protein lông và 599-bp mã hoá cho kháng nguyên Vi; Pseudomonas pseudomallei (nay là Burkholderia pseudomallei) với mảnh 517-bp của 16S ARNr

cũng đã được khuyếch đại thành công bằng PCR

- Amib: Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hoá cho một protein 30.000 Mdal liên quan tới độc tính của Entamoeba histolytica, người ta có thể phân biệt được amíp gây bệnh và amíp không gây bệnh (6)

- Virus: Virus viêm gan B (7,8), HIV, virus thuỷ đậu, virus Herpes simplex, Papillomavirus, Cytomegavirus và Enterovirus đã được chẩn đoán thành công bằng PCR

Đối với HIV, những tài liệu đã dẫn cho thấy PCR cho kết quả dương tính sớm hơn các dấu hiệu biến đổi về miễn dịch từ 3 - 6 tháng Đặc biệt là kỹ thuật này cho phép chẩn đoán HIV ở trẻ sơ sinh, khi mà các kháng thể kháng HIV ở trẻ lúc này,

có thể, chỉ đơn thuần là do từ mẹ truyền sang

2.2 Xác định độc tố của vi sinh vật:

Tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu nhiệt của Escherichia coli, và gần đây, các gen elta và elfB của E.coli sinh độc tố ruột (enterofoxigenic Escherichia coli,

ETEC); vt1 và vt2 của E coli gây chảy máu đường ruột (enterohemorrhagic

Escherichia coli; EHEC); eaeA và bfpA của E coli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC); ial của E.coli xâm nhập đường ruột (enteroinvasive Escherichia coli; EIEC) và Shigella đã được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn đoán phân biệt giữa các loại Escherichia coli gây tiêu chảy.

PCR khuyếch đại các gen nói trên đã thay thế hoặc bổ sung cho các thử nghiệm kinh điển có độ nhậy và độ đặc hiệu kém hơn hoặc là thay thế cho các kỹ thuật phức tạp hơn

Độc tố ruột của vi khuẩn tả (CT), (CT, cholera toxin) đóng vai trò chủ đạo trong cơ chế gây bệnh của chúng PCR đã được dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó, có thể phân biệt một cách chắc chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực sự với các Vibrio cholerae khác, thuộc các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả (trước đây gọi là các Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG)

Clostridium difficile đã được định loại thông qua xác định các loại độc tố riêng biệt

của chúng bằng PCR

2.3 Xác định vi khuẩn ngoài môi trường:

Các vi khuẩn khó nuôi cấy và/hoặc thường có mặt ngoài môi trường có thể được

tìm trực tiếp bằng PCR, ví dụ như các Legionella, Salmonella, Shigella và Vibrio cholerae.

Nói tóm lại, dùng PCR để tìm tác nhân gây bệnh đã được áp dụng rất rộng rãi PCR có lợi thế lớn là nhanh (thời gian cần thiết cho chẩn đoán tính bằng "giờ" so với các kỹ thuật kinh điển phải tính bằng "ngày"), nhạy (độ nhạy rất cao, chỉ cần từ

10 - 1000 tế bào vi khuẩn, tuỳ theo kỹ thuật, là đủ) và độ đặc hiệu cũng rất cao Nhờ vậy, bệnh được chẩn đoán nhanh hơn và chính xác hơn

Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn, tốn kém; hoặc kết quả nuôi cấy rất chậm, hoặc ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi vào viện, vì rằng PCR không nhất thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống

Tuy vậy,cho đến nay, do những điểm hạn chế của nó (như đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên vật liệu riêng, đắt tiền; cán bộ kỹ thuật phải có trình độ nhất định; kỹ thuật thực hiện còn phức tạp), PCR chỉ bổ sung chứ không thay thế hẳn được phương pháp chẩn đoán kinh điển khác

2.4 Định loại (identification) vi khuẩn

Sau khi phân lập được vi khuẩn, PCR góp phần quan trọng trong định loại chúng Đối với từng vi khuẩn cụ thể, qui trình cho PCR với bệnh phẩm từ lâm sàng thường giống với bệnh phẩm là vi khuẩn thuần Tuy vậy, việc chuẩn bị ADN mẫu (template) từ vi khuẩn thuần cho PCR rất đơn giản: chỉ cần đun sôi cách thuỷ huyền dịch vi khuẩn trong 10 phút rồi thu lấy dịch nổi sau ly tâm loại bỏ tế bào là đủ

2.5 Phân loại (classification) vi khuẩn

Nhờ khuyếch đại những đoạn gen phụ trách ARNr 16S, người ta có thể so sánh mối quan hệ gần gũi hay xa nhau giữa các vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết hơn và chính xác hơn