T ẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR POLYMERASE CHAIN REACTION ĐỂ PHÁT HIỆN NHIỄM SẮC THỂ PHILADELPHIA TRÊN BỆNH NHÂN UNG TH Ư BẠCH CẦU MÃN TÍNH DÒNG HẠT C
Trang 1T ẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
ĐỂ PHÁT HIỆN NHIỄM SẮC THỂ PHILADELPHIA TRÊN BỆNH NHÂN
UNG TH Ư BẠCH CẦU MÃN TÍNH DÒNG HẠT (CHRONIC MYELOID LEUKEMIA )
Phan Đình Điền
B ệnh Viện Chợ Rẫy TP Hồ Chí Minh
Ph ạm Hùng Vân, Nguyễn Thái Sơn Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
TÓM T ẮT
Sáu m ươi mẫu máu của bệnh nhân được chẩn đoán bệnh ung thư bạch cầu mạn tính dòng h ạt (Chronic Myeloid Leukemia-CML) được nghiên cứu để phát hiện nhiễm sắc thể Philadelphia mang gen t ổ hợp BCR-ABL bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) và real-time PCR K ết quả cho thấy có đến 59 bệnh nhân (98,33%) mang gen t ổ hợp này trong máu ngoại biên, trong đó, dạng BCR-ABLb2a2 chiếm 32,20%, dạng BCR-ABLb3a2 chi ếm 44,07% và dạng kết hợp BCR-ABLb2a2+b3a2 chiếm 23,73% Kết quả này cho th ấy có thể dùng kỹ thuật PCR để phát hiện nhiễm sắc thể Philadelphia Việc so sánh đối chiếu kết quả này với các tác giả khác trong và ngoài nước cũng được bàn luận để khẳng định giá trị của kỹ thuật
1 Đặt vấn đề
Bệnh ung thư bạch cầu mạn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia – CML)
là một bệnh ác tính của hệ tạo máu với đặc điểm chính là sự tăng sinh dòng bạch cầu hạt Trong bệnh CML có một sự biến đổi nhiễm sắc thể đặc trưng đó là nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph) (Nowel et al 1960) [4], đây là sản phẩm của sự chuyển đoạn giữa nhiễm sắc thể số 9 và nhiễm sắc thể số 22 ký hiệu t(9;22) (Rowley 1973) [5] Theo khảo sát của các nhà nghiên cứu khoa học trên thế giới, nhiễm sắc thể Philadelphia hiện diện
ở máu ngoại biên và tuỷ xương của bệnh nhân CML là lớn hơn 95% (Carol D Jone, Cecilia Yeung et al.2003 Susan Branford 2006) [1,8]
Nghiên cứu về mặt sinh học phân tử cho thấy bản chất gen của nhiễm sắc thể Philadelphia là gen tổ hợp BCR-ABL (Salesse et al 2002) [6] được tạo thành do sự chuyển đoạn của ABL proto-oncogene từ nhiễm sắc thể số 9 đến gắn vào vị trí 5’ của BCR gene trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 22 (q34;q11) Trong bệnh CML, gen tổ hợp BCR-ABL chủ yếu sẽ tạo ra một loại protein có hoạt tính Tyrosine Kinase đó là protein P210 (protein có trọng lượng phân tử 210 KD) và protein này chính là nguyên nhân chủ
Trang 2yếu gây ra bệnh CML (Sawyers, C.L.1999) [7] Tùy theo vị trí sắp xếp các điểm gãy (breakpoints) khác nhau trên BCR-gene và ABL-gene ta có các sản phẩm BCR-ABL khác nhau: BCR-ABL b2a2 nếu vị trí sắp xếp các điểm gãy nằm giữa exon 13 và 14, hay đó sẽ là BCR-ABL b3a2 nếu vị trí sắp xếp các điểm gãy nằm ở giữa exon 14 và 15 (Salesse et al 2002) [6] Phát hiện được gen tổ hợp BCR-ABL trong máu ngoại biên của
bệnh nhân CML đồng nghĩa với phát hiện được nhiễm sắc thể Philadelphia Do vậy việc
tiến hành xây dựng một kỹ thuật mới để phát hiện sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia trong máu ngoại biên của bệnh nhân CML là một điều hết sức cần thiết trong chẩn đoán và điều trị
Hình 1 S ự tạo thành gene BCR-ABL (Salesse et al 2002)
2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1 Đối tượng
60 bệnh nhân (bao gồm 32 nữ, chiếm tỉ lệ 53,33% và 28 nam, chiếm tỉ lệ 46,67%) với độ tuổi nhỏ nhất là 20 đến lớn nhất là 74 tuổi, được chẩn đoán ung thư
bạch cầu mạn tính dòng hạt (Chronic Myeloid Leukemia, CML) với tủy đồ dương tính
và đang được điều trị bằng các loại thuốc Hydrea (Không sử dụng các loại thuốc ức chế
hoạt tính tyrosine kinase như Imatinib, Dasatinib hay Nilotinib…) tại phòng khám huyết
học của Bệnh viện Chợ Rẫy từ 05 08 2009 đến 19 11 2009
2.2 Ph ương pháp
2.2.1 L ấy mẫu và bảo quản mẫu
Lấy 04 ml máu tĩnh mạch ngoại biên, cho vào ống nghiệm có chất chống đông EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic acid), lắc nhẹ để trộn đều máu với chất chống đông, bảo quản ở nhiệt độ 4 – 80
C trong vòng 08 giờ phải chuyển đến phòng thí nghiệm
để xử lý mẫu
Trang 32.2.2 K ỹ thuật xét nghiệm
Máu toàn phần sẽ được trích ly RNA với bộ thuốc thử đã được chuẩn hoá của Chomczynski [2] Khuếch đại 2 týp của gene tổ hợp BCR-ABL là b2a2 và b3a2 bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) sau đó tiến hành xét nghiệm định lượng Real-Time PCR nhờ 03 nồng độ chuẩn của gen β-glucuronidase (GUS) S1: 100.000 bản sao/ml, S2: 10.000 bản sao/ml và S3:1.000 bản sao/ml, được phát hiện real time cùng với mẫu nghiệm
Phân tích kết quả bằng phần mềm iQ5 Real-Time PCR System Software
3 K ết quả
3.1.T ương quan giữ độ tuổi và bệnh CML (Chronic Myeloid Leukemia)
Bảng 1 Mối tương quan giữ độ tuổi và bệnh CML
Những kết quả ghi nhận được cho thấy đa số bệnh nhân CML đều ở độ tuổi của
người đã trưởng thành, đặc biệt tỷ lệ này khá cao ở tuổi trung niên (41 – 60) # 58,33%
3.2.K ết quả phân tích mẫu gen BCR-ABL từ 60 bệnh nhân CML
Qua phân tích mẫu máu ngoại biên của 60 bệnh nhân CML đã được xác định
chẩn đoán với tủy đồ dương tính và đang điều trị ngoại trú tại Bệnh Viện Chợ Rẫy TP
Hồ Chí Minh, thuốc điều trị chủ yếu là Hydroxyure (Hydrea) Chưa có bệnh nhân nào được điều trị với các loại thuốc ức chế hoạt tính Tyrosine Kinase như Imatinib, Dasatinib hay Nilotinib Chúng tôi đã phát hiện được 59/60 trường hợp (98,33%) mẫu máu được đem phân tích có sự hiện diện gen BCR-ABL
3.2.1.T ần suất xuất hiện các dạng chuyển đoạn của nhiễm sắc thể Philadelphia
Bảng 2 Tần suất xuất hiện của nhiễm sắc thể Philadelphia trong bệnh nhân CML
M ẫu nghiệm dương tính với BCR-ABL
(N = 59)
V ị trí chuyển đoạn
C ủa nhiễm sắc thể Philadelphia
S ố lượng phát hiện T ỷ lệ %
Trang 4Bằng kỹ thuật RT-PCR, gen tổ hợp BCR-ABL đã xuất hiện trong máu ngoại biên
của 59/60 bệnh nhân: 19 người mang ABL b2a2 (32,20%); 26 người mang BCR-ABL b3a2 (44,07%) và 14 người mang dạng kết hợp b2a2 + b3a2 (23,73%)
3.2.2 Hình ảnh mẫu gen bình thường khi khảo sát bằng RT-PCR
Hình 2 M ẫu gen của người bình thường (không có nhiễm sắc thể Philadelphia)
Ở hình này chúng ta thấy sự hiện diện của 3 đường chuẩn: S1, S2, và S3 Sự
xuất hiện của GUS (gen bạch cầu của chính bệnh nhân) nói lên quá trình phiên mã
ngược và khuếch đại các bản sao từ phản ứng RT-PCR đã được thực hiện thành công Không phát hiện sự hiện diện các bản sao của gen BCR-ABL
3.2.3 Hình ảnh mẫu gen có chuyển đoạn dạng b2a2
BN.số 58 b2a2 = 291.000 copies /ml
Hình 3 M ẫu có phát hiện nhiễm sắc thể Philadelphia với sự chuyển đoạn ở vị trí b2a2
Ở hình 3 ngoài sự hiện diện của 03 đường chuẩn S1, S2, S3 và GUS còn phát
hiện đuợc sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia với sự chuyển đoạn ở vị trí b2a2
chứng tỏ đây là mẫu máu của bệnh nhân đang mang bệnh Ung thư bạch cầu mạn tính dòng hạt (CML)
b2a2
STANDARD 1,2,3
GUS
GUS STANDARD 1,2,3
Trang 53.2.4.Hình ảnh mẫu gen có chuyển đoạn dạng b3a2
BN.số:51 b3a2 = 367 copies /ml
Hình 4 M ẫu có phát hiện nhiễm sắc thể Philadelphia với sự chuyển đoạn ở vị trí b3a2
Tương tự như trên, chúng tôi phát hiện sự hiện diện của nhiễm sắc thể Philadelphia có sự chuyển đoạn ở vị trí b3a2 ở hình 4
3.2.5 Hình ảnh mẫu gen có chuyển đoạn dạng kết hợp b2a2+b3a2
BN số: 60 b2a2 = 552 copies /ml
b3a2 = 195.600 copies /ml
Hình 5 M ẫu có phát hiện sự chuyển đoạn ở cả hai vị trí b2a2 và b3a2
Trong một số bệnh nhân, qua phân tích kết quả bằng phần mềm iQ5 Real-Time PCR System Software, chúng tôi thấy có sự hiện diện sự chuyển đoạn ở cả 02 vị trí b2a2 và b3a2 trên nhiễm sắc thể Philadelphia
STANDARD 1,2,3 GUS b3a2
STANDARD 1,2,3
GUS
b2a2 b3a2
Trang 64 Bàn lu ận
60 bệnh nhân CML đã được xác định chẩn đoán với tủy đồ dương tính từ phòng thí nghiệm huyết học bệnh viện Chợ Rẫy và đang được điều trị ngoại trú tại phòng khám huyết học của bệnh viện Thuốc sử dụng điều trị chủ yếu là Hydroxyure (Hydrea), đây là một loại thuốc chống chuyển hoá, tác dụng nhanh, ít độc, ít gây suy tủy (Joanna Gora-Tyborr, 2008) [3] Tuy nhiên, loại thuốc này không có khả năng loại bỏ hoàn toàn tác nhân chính gây bệnh là các bản sao của gen tổ hợp BCR-ABL (Joanna Gora-Tybor 2008) [3], điều này giải thích vì sao khi chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT-PCR có thể phát
hiện sự hiện diện gen tổ hợp BCR-ABL ở 59/60 bệnh nhân CML (98,33%) Carol D Jone và CS (2003) [1] cũng như Susan Branford 2006 [8] cho rằng tỷ lệ này là lớn hơn 95% và như vậy là hoàn toàn tương đồng với kết quả của chúng tôi Cũng từ những kết
quả trên chúng ta thấy rằng bệnh Ung thư bạch cầu mạn dòng hạt xuất hiện chủ yếu ở
những người đã trưởng thành, đặc biệt ở độ tuổi trung niên (41 – 60) Từ những số liệu nêu trên, chúng tôi cho rằng, chúng ta có thể hoàn thiện quy trình xét nghiệm để sau đó đem ra áp dụng ở những cơ sở khám và chữa bệnh Điều này sẽ giúp cho thầy thuốc lâm sàng có một phương tiện đáng tin cậy để nhanh chóng xác định chẩn đoán bệnh Ung thư
bạch cầu mãn tính dòng hạt, đồng thời có kế hoạch điều trị cũng như theo dõi đáp ứng điều trị bệnh CML một cách hiệu quả
5 K ết luận
Từ những kết quả thu được như đã trình bày ở trên chúng tôi nghĩ rằng chúng ta
cần phải nhanh chóng phát triển và ứng dụng các kỹ thuật PCR trong mọi lĩnh vực của đời sống, đặc biệt là trong ngành y để nó thực sự trở thành một công cụ hữu ích giúp cho các thầy thuốc nhanh chóng xác định chẩn đoán, có kế hoạch điều trị kịp thời để
phục vụ cộng đồng được hiệu quả hơn
TÀI LI ỆU THAM KHẢO
1. Carol D Jones, Cecilia Yeung Comprehensive Validation of a Real-Time Quantitative bcr-abl Assay for Clinical Laboratory Use Am J Clin Pathol 120, (2003), 42-48
2. Chomczynski P, Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction Anal Biochem.Apr; 162(1), (1987), 156-9
3. Joanna Gora-Tybor Targeted drugs in Chronic Myeloid Leukemia Current medicinal
Chemistry, 15, (2008), 3036-3051
4. Nowel, PC and D.A Hungerford Chromosome studies on normal and Leukemic human leucocytes J Natl Cancer Inst 25, (1960), 85-108
5. Rowley JD A new consisten chromosomal abnormality in chronic myelogenous
Trang 7leukemia ideltified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining Nature 243,
(1973), 290-3
6. Salesse, S and C., M Verfaillie BCR/ABL : from molecular Mechanisms of Leukemia induction to treatment of chronic myelogenous Leukemia.Oncogene 21 (56), (2002), 8547- 59
7. Sawyers, C.L Chronic myeloid leukemia The New England Journal of Medicine
340(17), (1999), 1330-59
8. Susan Branford and Timothy Hughes Diagnosis and Monitoring of Chronic Myeloid Leukemia by Qualitative and Quantitative RT-PCR Methods in Molecular Medicine
Vol 125, (2006), 69-92
APPLYING PCR TECHNIQUE IN THE DETECTION OF CHRONIC
MYELOID LEUKEMIA
Phan Dinh Dien Cho Ray Hospital, HCM City Pham Hung Van, Nguyen Thai Son University of Medicine and Pharmaceutics HCM City
SUMMARY
Peripheral blood samples from 60 Chronic Myeloid Leukemia patients were tested by RT-PCR (Reverse Trancription-Polymerase Chain Reaction) and Real-Time PCR to detect Philadelphia chromosome containing BCR-ABL fusion gene Results show that the BCR-ABL fusion gene was found in 59 (98,33%) of these 60 blood samples In these 59 positive cases, the b3a2 type has the highest rate of 44,07%, followed by the b2a2 type with 32,2%, and the b2a2 + b3a2 combinative type with 23,73% These results indicate that PCR technique can be used to detect Philadelphia chromosome We also compared our results with those in other local and foreign researches to confirm the accuracy of this technique
