Nghiên cứu khả năng sử dụng kỹ thuật realtime PCR phát hiện sacbrood virus gây bệnh trên ong mật tại hà nội

3.6 Xác định độ nhạy của kỹ thuật chẩn đốn SBV trên ong mật 42 3.6.1 Khả năng chẩn đốn của hai phương pháp one step RT – PCR và 3.6.3 Khảo sát khả năng phát hiện SBV theo thời gian biểu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN THỊ THOA

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR PHÁT HIỆN SACBROOD VIRUS GÂY BỆNH TRÊN ONG MẬT TẠI HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN THỊ THOA

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR PHÁT HIỆN SACBROOD VIRUS GÂY BỆNH TRÊN ONG MẬT TẠI HÀ NỘI

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ trong việc thực hiện luận văn này

ñã ñược cám ơn và thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành bản luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực học hỏi của bản thân tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của các thầy cô giáo, gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Hồng Thái - Bộ môn Côn trùng - Khoa Nông học - Trường ðại học Nông nghiệp

Hà Nội và TS Nguyễn Văn Giang - Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Khoa Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã hết lòng ủng hộ và khích lệ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện ñề tài này, ñã dành nhiều thời gian và công sức chỉ dẫn, giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện ñề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Hà Viết Cường - Khoa Nông học - trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội và ThS Trịnh Thị Thủy - Khoa Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh vật và

bộ môn Sinh học phân tử– Khoa Công nghệ sinh học - trường ðại học Nông nghiệp

Hà Nội và tập thể cán bộ nhân viên Ban ñào tạo sau ñại học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện ñề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp

ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 10 tháng09 năm 2013

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Nguyễn Thị Thoa

MỤC LỤC

1.3.3 RT – PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction) 12

2.1.1 Thời gian 21

2.4.5 Xác ựịnh khả năng chẩn ựoán của hai kỹ thuật PCR ựể phát hiện

2.5 đánh giá về ựộ nhạy của phương pháp chẩn ựoán ựể xác ựịnh

3.1 Ảnh hưởng của kỹ thuật lấy mẫu và bảo quản mẫu bệnh lên khả

3.2 Ảnh hưởng của kỹ thuật tách chiết RNA lên khả năng phát hiện SBV 32

3.3.2 Thử nghiêm khả năng phát hiện Sacbrood virus trên ong mật tại

3.6 Xác định độ nhạy của kỹ thuật chẩn đốn SBV trên ong mật 42

3.6.1 Khả năng chẩn đốn của hai phương pháp one step RT – PCR và

3.6.3 Khảo sát khả năng phát hiện SBV theo thời gian biểu hiện bệnh

3.7 Xây dựng quy trình kỹ thuật chẩn đốn bệnh ấu trùng túi do virus

3.7.2 Tiến hành phản ứng One step Reverse Transcription – PCR (RT

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

trùng hợp ñịnh lượng theo thời gian thực)

trùng hợp phiên mã ngược)

TSBV Thai Sacbrood Virus (Virus gây bệnh ấu trùng túi Thái Lan)

phần Ong Trung ương)

DANH MỤC BẢNG

3.1 Kiểm tra RT-PCR phát hiện SBV trên các mẫu ấu trùng ong

3.4 Kết quả RT-PCR cho SBV với các cặp mồi SB 1f-2r, SB 14f-15r

và SB11f - SB12r với các mẫu ong mật thu tại 11 huyện trên địa

3.8 Kết quả chẩn đốn của hai phương pháp RT – PCRvà Realtime - PCR 43

3.11 Giá trị bước nhảy của ngưỡng chu kỳ khi pha lỗng nơng độ gốc 48

3.13 Số lượng bản sao DNA/ µl và chu kỳ khuếch đại (Yoo et al., 2012) 50

3.14 Giá trị ngưỡng chu kỳ của phản ứng Realtime- PCR đối với các

DANH MỤC HÌNH

1.1 Biểu ñồ khuếch ñại vẽ lên các ñường biểu diễn khuếch ñại của

1.2 Biểu ñồ chuẩn ñường biểu diễn chuẩn mối quan hệ giữa số

2.9 Vị trí cặp mồi SB1f – SB2r trên bộ gen của virus SBV

RNA chiết từ mẫu ấu trùng ong bệnh ñược bảo quản trong

RNA chiết ngay lập tức từ mẫu ấu trùng ong bệnh sau khi thu thập từ

3.3 RT-PCR phát hiện SBV bằng cặp mồi SB-1F/SB-2R từ các mẫu

RNA chiết từ mẫu ấu trùng ong thu thập từ ñàn bệnh và bảo quản lạnh 31

3.4 Kết quả kiểm tra tính ñặc hiệu của 5 cặp mồi với mẫu RNA tách

3.5 Kết quả RT-PCR cho SBV với cặp mồi SB1f - SBr2 với các mẫu

3.6 Mối tương quan giữa hàm lượng và độ tinh sạch của RNA tổng

3.9 Tỉ lệ chẩn đốn của hai phương pháp RT – PCR và

3.11 Mối quan hệ tuyến tính thuận giữa các mức pha lỗng nồng độ

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là quốc gia cĩ khí hậu nhiệt đới giĩ mùa, cĩ nguồn hoa và nguồn mật phong phú rất phù hợp cho phát triển nghề nuơi ong mật Do đĩ, nghề nuơi ong lấy mật từ lâu đã và đang đĩng một vai trị quan trọng bởi nĩ khơng những mang lại lợi nhuận kinh tế to lớn cho người nuơi ong mà cịn cung cấp nhiều những ích lợi trong xã hội cũng như với mơi trường

Tuy nhiên ong mật rất hay bị tấn cơng bởi một số loại bệnh do vi khuẩn và nguy hiểm hơn cả là bệnh do virus, bởi vì bệnh do virus khơng thể điều trị bằng thuốc kháng sinh được Trong các bệnh virus trên ong thì bệnh ấu trùng túi là một trong những bệnh virus nghiêm trọng nhất trên ong mật hiện nay Virus này đều

thuộc chi iflavirus, cùng cĩ mặt ở khắp các lục địa và các nơi nuơi ong và gây thiệt

hại rất lớn cho người nuơi ong và ngành nuơi ong

Sacbrood virus (SBV) gây bệnh chết ấu trùng ong và là 1 virus quan trọng

bậc nhất trên ong khắp thế giới kể cả Việt Nam SBV nhiễm cả ong Apis mellifera

và Apis cerana (Phùng Hữu Chính 2008, Thái et al., 2011) Ấu trùng túi do

sacbrood virus gây ra, bệnh làm chết ấu trùng chủ yếu ở giai đoạn sau vít nắp và

tiền nhộng Khả năng lây nhiễm của virus là rất lớn, một ấu trùng bị chết cĩ thể lây

nhiễm cho 3000 ấu trùng lành

vẫn dựa trên những phương pháp truyền thống như: sử dụng kính hiển vi, RIA, ELISA…Tuy các phương pháp chẩn đốn cổ điển trên cĩ độ nhạy khơng cao và khĩ chẩn đốn ở giai đoạn bệnh cịn tiềm ẩn Gần đây, các nhà khoa học đang phát triển một phương pháp chẩn đốn mới khơng những cĩ khả năng định tính (phát hiện sự tồn tại của virus) mà cịn cĩ khả năng định lượng (biết được chính xác nồng

độ của virus gây bệnh) đĩ chính là kỹ thuật Realtime – PCR Realtime - PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’ polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự cơng bố năm 1991 Trong phản ứng real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn

vào DNA mạch đơi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen ) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dị đặc hiệu (FAM, HEX )

Việc phát triển thêm những phương pháp chẩn đốn hiện đại, chính xác để phát hiện sớm những virus tiềm tàng ở những giai đoạn đầu là hết sức cần thiết giúp những người nuơi ong hạn chế được sự thất thốt về kinh tế cũng như tình trạng dư thừa kháng sinh trong mật Chính vì lý do đĩ mà chúng tơi quyết định nghiên cứu

đề tài: “Nghiên cứu khả năng sử dụng kỹ thuật Realtime-PCR phát hiện

Sacbrood virus gây bệnh trên ong mật tại Hà Nội” làm tiền đề cho việc chẩn đốn,

đề xuất các biện pháp phịng chống hiệu quả

2 Mục đích, yêu cầu

2.1 Mục đích

Tìm ra độ nhạy, tính đặc hiệu tối ưu và mối quan hệ giữa nồng độ virus với

sự biểu hiện bệnh tích để từ đĩ xây dựng được kĩ thuật chẩn đốn sớm

2.2 Yêu cầu

- Xác định được cặp mồi đặc hiệu

- Xác định độ nhạy của kỹ thuật chẩn đốn

- Xây dựng được quy trình kỹ thuật chẩn đốn

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Bước đầu ứng dụng kỹ thuật Realtime- PCR để phát hiện và định lượng SBV phục vụ cho chẩn đốn và theo dõi điều trị ðộ đặc hiệu của Realtime – PCR cao hơn rất nhiều so với PCR cổ điển, cho độ chính xác cao và kết quả đáng tin cậy

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Cĩ thể phát hiện bệnh khi cịn ở giai đoạn tiềm ẩn, khơng mất thời gian điện

di để đọc kết quả và phản ứng diễn ra trong hệ thống kín nên tránh được khả năng ngoại nhiễm Chính vì vậy mà rất cần thiết phát triển phương pháp này rộng rãi trong lĩnh vực nơng nghiệp như chẩn đốn bệnh cây, bệnh cơn trùng…

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tầm quan trọng của ngành ong

ñó mà bệnh càng có cơ hội lây lan rộng hơn (FAO, 2006)

Virus gây bệnh trên ong mật (Apis mellifera) ñược nghiên cứu mạnh mẽ

trong suốt giai ñoạn cuối thập kỷ Nhìn chung thì virus trên ong mật thường lây lan rộng và hầu hết chúng không có biểu hiện bệnh tích rõ ràng (Allen and Ball, 1996; Ball and Allen, 1991; Ball and Balley, 1997)

Bệnh Sacbrood trên ong ngoại (Apis mellifera) ñược phát hiện từ năm 1964 (Bailey et al., 1964) Tuy nhiên, ở A cerana virus này ñược báo cáo lần ñầu tiên

vào năm 1976 ở Thailand Do sự khác biệt về tính chất lý hóa và huyết thanh của

virus mà virus có tên gọi là Thai Sacbrood Virus (TSBV) ñể phân biệt với virus Sacbrood của A mellifera (Bailey et al., 1982) Sự tồn tại của TSBV trong các ñàn ong A cerana ở miền Bắc ấn ñộ ñược nghiên cứu bằng kính hiển vi ñiện tử và phương pháp huyết học trong phòng thí nghiệm (Rana et al., 1986, 1987)

Chinese Sacbrood Virus (CSBV) là tác nhân gây bệnh của bệnh sacbrood

Trung Quốc, ñặt ra một mối ñe dọa nghiêm trọng cho ong mật Apis cerana, và có

xu hướng làm sụp ñổ các ñàn ong gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi ong

(Liu et al., 2010)

Mặc dù sacbrood ñược mô tả lần ñầu tiên vào năm 1913 và ñược cho là

tác nhân gây bệnh vào năm 1917, SBV ñã không ñược mô tả cho ñến năm 1964

SBV là virus ñầu tiên trên ong mật ñược giải trình tự toàn bộ Ở Mỹ, toàn bộ

trình tự chuỗi nucleotide của SBV gần ñây mới ñược xác ñịnh Bằng cách sử dụng RT – PCR ñể phát hiện trực tiếp, nhanh chóng và chuẩn xác các loại virus

RT – PCR được chứng minh là một cơng cụ chẩn đốn nhanh chĩng, đặc hiệu và nhạy bén để phát hiện trực tiếp axit nucleic của SBV trong những mẫu ong bị lây nhiễm Sản phẩm khuếch đại được giải trình tự và phân tích phả hệ cho thấy tồn

tại ít nhất ba kiểu gen của SBV

Sử dụng phương pháp uniplex RT – PCR để kiểm tra các dịng ong cho thấy

sự cĩ mặt của một số loại virus bao gồm BQCV, DWV, KBV, SBV và mơ tả việc

nhiễm hỗn hợp các loại virus ở ong từ các dịng ong khác nhau Báo cáo năm 2004

về “Sự lây nhiễm đa virus trên ong mật và sự dị biến hệ gen của các virus trên ong mật” là báo cáo đầu tiên về sự nhiễm hỗn hợp 4 loại virus trên ong mật và cũng là báo cáo đầu tiên về việc sử dụng phương pháp multiplex RT – PCR trong việc chẩn đốn sự lây nhiễm đa virus trong các dịng ong mật Vào năm 1971, mới chỉ tìm ra

ba loại virus lây nhiễm trên ong mật (Bailey, 1971) nhưng 5 năm sau đĩ cịn số này

đã tăng lên là sáu (Bailey, 1976) Chỉ cĩ rất ít thơng tin về sự xuất hiện của virus

ong ở A mellifera ở ðan mạch là cĩ sẵn cũng như khơng cĩ cuộc điều tra tồn diện

nào được thực hiện Một cuộc điều tra dựa trên phương pháp RT – PCR được xuất

bản bởi Tentcheva et al (2004) (ABPV, BQCV, CBPV, DWV, KBV) và Grabensteiner et al (2001) (SBV) đã được thực hiện ở ðan Mạch chúng cĩ thể là

những loại virus nguy hiểm bậc nhất châu Âu Cuộc điều tra dựa trên mẫu ong của những người nuơi ong với tỉ lệ chết cao bất thường vào mùa đơng hay cĩ nghi ngờ

đã nhiễm virus

Sự xuất hiện, tỉ lệ lây nhiễm và sự phân bố của ABPV, BQCV, CBPV, DWV,

KBV, SBV đã được điều tra ở 90 dịng ong ở Áo bị mắc những triệu chứng suy giảm

các cá thể trong đàn đột ngột, bại liệt…bằng cách sử dụng RT – PCR Sự phá hoại

do ký sinh trùng cũng được ghi chép lại

1.1.2 Việt Nam

Ở Việt Nam, khơng cĩ nhiều những nghiên cứu về SBV trên A mellifera

được xuất bản Virus lây nhiễm trên ong mật chưa được xác định Một vài nhà nghiên cứu ở Việt Nam đã cĩ những điều tra sơ bộ để áp dụng chẩn đốn bệnh lây

nhiễm trên ong mật như SBV (Lê Thanh Hịa et al., 2004; Phạm Hồng Thái et al.,

2011) bẳng sử dụng chẩn đốn phân tử Báo cáo “Chẩn đốn phân tử của Sacbrood

virus và Deformed wing virus lây nhiễm trên ong mật ở miền Bắc Việt Nam” là báo

cáo đầu tiên về bệnh SBV và DWV sử dụng RT – PCR làm cơng cụ chẩn đốn dùng

mồi đặc hiệu của ong mật ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam vào năm 2010

Các kỹ thuật chẩn đốn bằng sinh học phân tử hầu như được sử dụng cịn rất khiêm tốn trong cơng tác phát hiện sớm bệnh virus hại ong mật Trong đĩ Realtime

- PCR là kỹ thuật chẩn đốn nhanh, chính xác và định lượng được nồng độ virus vẫn chưa cĩ nhiều cơng bố ở nước ta Chính vì thiếu sự chẩn đốn sớm nên khơng đưa ra được cách phịng trị tốt Người nuơi ong thường khơng phân biệt được nguyên nhân gây bệnh cho ong là gì nên đã lạm dụng kháng sinh và gây tồn dư

kháng sinh trong mật ong

1.1.3 Các lồi ong ở Việt Nam

Hai lồi ong nuơi phổ biến nhất ở nước ta là ong nội A.cerana và ong ngoại

A.mellifera Hai lồi này cĩ những đặc điểm khác nhau và bổ sung cho nhau

Ong nội A.cerana là giống ong bản địa ở Việt Nam, Trung Quốc và một số

nước khác Ở nước ta, ong nội phân bố rộng khắp cả nước ngoại trừ rừng tràm U Minh (Phạm Hồng Thái, 2003) Ong nội cĩ đặc tính chăm chỉ, chịu được điền kiện sống bất lợi, ít dịch bệnh hại, chất lượng mật cao, tuy nhiên năng suất mật thấp, hung dữ và dễ bốc bay, chia đàn Ong nội cĩ thể nuơi ở các quy mơ từ hộ gia đình tới nuơi chuyên nghiệp, nhưng nĩ thích hợp hơn với kiểu nuơi ong quy mơ nhỏ trong gia đình, và cung cấp sản phẩm phục vụ tiêu dùng trong nước ðể phát triển ong nội, cần chọn các đàn cĩ tính tụ đàn cao, chọn giống ong tốt và quan tâm tới phịng bệnh để nâng cao năng suất mật

Ong ngoại A.mellifera cĩ nguồn gốc từ châu Âu, châu Phi, được nhập vào

nước ta từ những năm 60 với hình thức thương mại và đã thích nghi với điều kiện nước

ta Lồi ong này phát triển tốt ở những nơi cĩ nguồn hoa tập trung, thích hợp với kiểu nuơi ong chuyên nghiệp với trình độ chuyên mơn hĩa cao Ong ngoại cĩ kích thước lớn hơn ong nội, khả năng tụ đàn và dự trữ mật cao hơn, mật ong ngoại chủ yếu xuất khẩu Nhưng ở những nơi cĩ nguồn hoa rải rác và điều kiện khắc nghiệt thì việc nuơi ong ngoại

là khơng thể Việc nhập ong A.mellifera cũng mang theo các lồi ký sinh và bệnh như

bệnh thối ấu trùng châu Âu, bệnh ấu trùng túi , bệnh bào tử trùng NosemaẦcho các loài ong bản ựịa

Ngoài ra còn một số loài ong hoang dã như ong khoái (A.dorsata), ong ựá (A.laboriosa), ong ruồi (A.florea) Tuy nhiên việc khai thác mật của các loài này

chiếm tỉ lệ nhỏ và chủ yếu là khai thác, săn bắt trong tự nhiên

1.1 Các dịch bệnh chắnh ựược ghi nhận trên ong mật

Có rất nhiều dịch hại ong ựã ựược ghi nhận trên thế giới cũng như tại Việt Nam Các loài gây hại cho ong khá ựa dạng từ ựộng vật, côn trùng, tới các vi sinh vật nhỏ bé như vi khuẩn hay virus

Một số loài chim ăn ong như chim xanh (Merops apiaster), chim én

(Cypselus spp), chim chèo bẻo (Dicurunus spp), nhện, thạch sùng, thằn lằn thường

bắt ong khi chúng ựi làm về Vào mùa mưa thì các loài cóc, nhái thường xuất hiện trước cửa tổ ong bắt ong Các loài vật hại này với số lượng lớn thì sẽ làm giảm số ong trong ựàn nhanh chóng

Các côn trùng hại ong như sâu ăn sáp còn gọi là sâu phá bánh tổ (Galleria

mellonenlla, Achroia griselle), trưởng thành của sâu là một loài ngài thuộc họ ngài

ựêm (Noctuidae) Các loài kiến vồng (Oecophylla smaradina), kiến lửa (Solemy spp), kiến ựen (Monomorium indicum)Ầ thường gây hại cho ong ở các vùng nhiệt ựới, khi tấn công ựàn ong chúng ăn cả ấu trùng, nhộng, ong và mật Ong bò vẽ (Vespa

orientalis) là loài phá ong cũng rất mạnh Ngoài ra còn có chuồn chuồn cũng là côn

trùng ăn thịt phá hại ong Khi bị tấn công mạnh thì ựàn ong có thể bốc bay bỏ tổ Một số trường hợp ựàn ong bị bệnh ngộ ựộc hóa học Chất hóa học có thể là thuốc bảo vệ thực vật, thuốc trừ cỏ, thuốc diệt côn trùngẦ mà ong bị dắnh phải khi

ựi làm hoặc thuốc ựược phun gần nơi ựặt ong Khi bị ngộ ựộc ong chết với số lượng lớn ngoài cửa tổ, một số bò dưới ựất, một số vừa nhảy vừa xoay đàn càng ựông thì

số lượng ong chết càng nhiều

Các loài ve khắ sinh của ong có chắ lớn (Varroa jacobsoni) thuộc họ

Varroidac chủ yếu ký sinh trên nhông ong ựực, chắ nhỏ (Tropilaelaps clareaes) chỉ

ký sinh trên ấu trùng, ve Neocypholaelaps indica Evans ăn phấn hoa Ầ

Bệnh ỉa chảy nosema do một loài nguyên sinh ñộng vật gây ra có tên là

Nosema apis, bệnh này có thể chữa ñược bằng thay chúa và cho ong ăn kháng sinh

Các bệnh gây hại trên ấu trùng do vi khuẩn có bệnh thối ấu trùng châu Âu và

thối ấu trùng châu Mỹ Thối ấu trùng châu Âu (European floubrood) ñược phát hiện

ở châu Âu, do liên cầu khuẩn Melissococus pluton gây ra, và còn ñược gọi là thối ấu

trùng tuổi nhỏ Bệnh xuất hiện cả ở A.mellifera và A.cerana Biện pháp chữa trị là thay chúa và sử dụng kháng sinh Bệnh thối ấu trùng châu Mỹ do trực khuẩn

Bacillus larvae gây ra Bệnh này gây hại nghiêm trọng nhất ñặc biệt ở vùng cận

nhiệt ñới và ôn ñới Khi gặp ñiều khiện bất thuận, vi khuẩn hình thành nha bào, các nha bào này có thể tồn tại trong ñất, bánh tổ khoảng 10 năm, khi gặp ñiều kiện thuận lợi có thể hoạt ñộng trở lại ở tất cả các thời ñiểm trong năm

Bệnh virus trên ong ñược quan tâm nghiên cứu nhiều trong vài thập kỷ gần ñây bởi sự xuất hiện ngày càng nhiều các loại virus và mức ñộ gây hại của chúng Hầu hết các bệnh virus trên ong không có triệu chứng rõ ràng 18 loài virus trên ong mật ñã ñược phát hiện và một số ñã ñược giải mã genome (Lê Quang Trung

và cs) Các virus thường truyền qua bọ ký sinh hoặc nhờ sự tiếp xúc giữa các con

ong trong ñàn Một số bệnh virus như: Acute bee paralysis virus (ABPV) hay (APV) ñược xem như là tác nhân truyền nhiễm phổ biến của ong ABPV lan truyền cùng với sự phá hoại của bọ ký sinh Varroa destructor, cùng Israel acute

paralysis virus (IAPV) gây bệnh bại liệt ở ong Nó thuộc họ Dicistroviridae ,cùng Kashmir bee virus (KBV), và Black queen cell virus (BQCV- làm ấu trùng chúa

ñen và chết) Deformed Wing Virus (DWV) làm biến dạng cánh ong, và Sacbrood

virus (SBV) gây thối ấu trùng túi thuộc họ iflaviridae, và là picornavirus

1.2 Tình hình nghiên cứu về Sacbrood virus

1.2.1 Lịch sử phát hiện và tác hại của bệnh virus ấu trùng túi

Sacbrood virus ñược ghi nhận lần ñầu tiên năm 1913, và ñược xác ñịnh là do

virus gây ra năm 1917 trên ong Apis mellifera, bệnh có mặt khắp các lục ñịa và các

vùng nuôi ong, nhưng gây thiệt hại không ñáng kể, có thể tự khỏi và không ñược coi là bệnh nguy hiểm Cho tới khi dịch lớn sảy ra ở Thụy Sĩ, tiêu diệt nhiều ñàn ong từ năm 1943- 1946 (Phùng Hữu Chính 2008)

đối với ong Apis cerana, bệnh xuất hiện thành dịch lần ựầu tiên ở Trung

Quốc năm 1972 và tiêu dệt nhiều ựàn ong ở Thái lan vào năm 1976 (Phùng Hữu Chắnh và Vũ Văn Luyên, 1999) Năm 1981, Bailey ựã phân lập ựược chủng virus

gây bệnh trên ong A.cerana ở Thái Lan có ựặc tắnh sinh lý sinh hóa khác với sacbrood trên A.mellifera và ông ựặt tên là Thai sacbrood virus (TSBV) Sau ựó,

TSBV lại gây dịch ở bang Bihar của Ấn độ vào năm 1979 và trong năm 1980 nó

ựã lan rộng từ đông sang Tây ở miền Bắc nước này Nepal từ năm 1981 tới

1984, TSBV ựã lây nhiễm ra khắp cả nước và làm thiệt hại tới 89% tổng số ựàn

ong Apis cerana của nước này Ở Ấn độ, hàng triệu ựàn ong ựã bị mất do SBV chỉ

tắnh riêng năm1990 (Lê Quang Trung et al., 2009)

Ở Việt Nam, dịch bệnh do SBV gây nên sảy ra năm 1974 khi một số ựàn ong

cao sản của Viện ong Bắc Kinh ựược nhập về Hà Nội sau ựó ựã lan tràn ra toàn miền Bắc và tiêu diệt 90% số ựàn ong Dựa trên các triệu chứng lâm sàng, các kỹ thuật viên của công ty ong, các chuyên gia bệnh trong nước và nước ngoài kết luận là bệnh ấu

trùng túi Phải tới năm 1989 mới xác ựịnh chắnh xác sự có mặt của Thai sacbrood virus ở

nước ta (Phùng Hữu Chắnh 2008, Vũ Văn Luyện 1999; Phạm Hồng Thái 2004) Những

năm gần ựây, bệnh virus ấu trùng túi ựã làm giảm 40-80% năng suất mật ở A.mellifera

(Phùng Hữu Chắnh, 2008)

Chinese sacbrood là một virus phổ biến gây thiệt hại nghiêm trọng với nghề

nuôi ong Trung Quốc đây là bệnh gây hại lớn nhất cho ấu trùng ong nhưng cũng

có thể ảnh hưởng tới sức khỏe và hành vi của ong mật trưởng thành Nó ựược quan sát ựầu tiên ở tỉnh Guangdong năm 1972 và nhanh chóng lan ra toàn Trung Quốc và các nước đông nam á, dẫn ựầu phá hoại ngành công nghiệp ong ở các vùng này Các nhà khoa học Trung Quốc ựã xác ựịnh nguyên nhân gây bệnh là virus có tên

China sacbroodvirus, thuộc họ virus RNA nhỏ, picornaviridea (Zhang et al.2001)

1.2.2 Triệu chứng bệnh ấu trùng túi

Triệu chứng ựầu tiên là sự xuất hiện của các ấu trùng yếu hoặc chết Ấu trùng chết sớm sau khi ựạy nắp nhưng trước khi hóa nhộng Ấu trùng chết có thể ựược tìm thấy ở lỗ tổ ựã vắt nắp và chưa vắt nắp khi bệnh nặng Bánh tổ bị bệnh, nắp vắt lỗ tổ lõm xuống, bị ong thợ cắn thủng, có ấu trùng nhọn ựầu nhô lên miệng lỗ tổ

Màu sắc của ấu trùng bệnh từ trắng ngà chuyển sang trắng bệch, vạch phân ựốt không rõ Triệu chứng ựiển hình nhất của bệnh là khi gắp ấu trùng túi lên phắa ựuôi ấu trùng hình thành túi nhỏ có dịch trong suốt hoặc vàng nhạt Thân ấu trùng chuyển sang vàng nhạt rồi nâu nhạt hay nâu xám, chóp ựầu nghiêng về phắa bụng

Ấu trùng mới chết không có mùi, khi khô thành vảy cứng nhẵn dạng thuyền đàn ong bị bệnh ấu trùng túi nhẹ thì giảm số quân trong ựàn, nên lụi ựàn, năng suất mật thấp Khi bị bệnh nặng có thể 90% số ấu trùng tuổi lớn chết và ựàn ong sẽ bỏ tổ bốc bay (Phùng Hữu Chắnh, Vũ Văn Luyện 1999)

1.2.3 Cách thức lan truyền của SBV

Khả năng lây nhiễm của virus gây bệnh thối ấu trùng túi là rất lớn, một ấu trùng chết có thể lây nhiễm cho 3000 ấu trùng lành, hay chất lỏng trong ấu trùng chết có chứa 1mg virus ựủ ựể gây nhiễm cho toàn bộ ấu trùng ong thợ của 1000 ựàn khỏe Nhưng sức chống chịu của virus không cao, nó mất khả năng gây bệnh khi ựun ở 59o C trong 10 phút Ở nhiệt ựộ phòng virus có thể tồn tại 3 tuần Ở các ấu trùng chết ựã khô không còn khả năng gây bệnh

Theo Ball thì trong cơ thể ong trưởng thành, virus nhân lên và tắch lũy chủ yếu ở phần ựầu của ong bị nhiễm nhiều hơn các phần khác của cơ thể Phần lớn chúng tồn tại ở phần não và tuyến dưới hầu, một phần chiết của ựầu chứa khoảng

109 phân tử virus Còn trong một ấu trùng túi chết có 1012 phân tử virus, tương ựương với 1% khối lượng cơ thể ấu trùng Và trong phòng thắ nghiệm chỉ cần 100 phân tử virus ựể lây nhiễm ong thành công trong giai ựoạn nhộng mắt trắng, ựây là thời ựiểm lây nhiễm thuận lợi nhât

Trong ựàn ong, bệnh lan truyền là nhờ ong thợ khi chúng làm vệ sinh tổ, chúng ăn hoặc gắp bỏ các ấu trùng bệnh, hàm, chân và lông dắnh virus, khi cho các

ấu trùng khoe ăn thì bệnh sẽ lan truyền Bệnh lây nhiễm giữa các ựàn là do ong ăn cướp mật, lấy chung nguồn thức ăn, ựặc biệt là nguồn phấn hoa, do người nuôi ong nhập cầu ong từ ựàn bệnh vào ựàn khỏeẦ

1.2.4 Tác nhân gây bệnh

1.2.4.1 đặc ựiểm của Sacbrood virus

Bộ gen của SBV ựược Ghosh và các cộng sự giải mã và công bố năm 1999 đây

là bộ gen được giải trình tự hồn thành đầu tiên trong số các virus cơn trùng

Bộ gen của SBV gồm 8832 nucleotid là tập hợp của 8 over lapping đã được gửi ở Ngân hàng gen với mã AF092024 Bộ gen của SBV dài hơn bộ gen của

picornavirus của động vật cĩ vú điển hình (khoảng 7500 nucleotid) Thành phần bazơ

là A (29.79%), C (16,35%), G (24,36%) và U (29,48%), như vậy SBV giống với các picornavirus khác Bộ gen bao gồm 1 sợi đơn, cựu dương, cấu trúc dọc mở lớn (ORF)

mã hĩa 1 polyprotein cĩ 2858 amino axit, khối lượng phân tử 320698 Da Vị trí bắt đầu dịch mã là mã AUG mã hĩa ở nucleotid 179, và kết thúc ORF với 1 codon dừng UAG ở nucleotide 8775 Sự phân tích này dự đốn một vùng khơng dịch mã (UTR)-5’- SBV của 178 nucleotide, ngắn hơn nhiều đoạn được tìm thấy picornavirus động vật cĩ vú điển hình (600-1250N) Trong khi đĩ, UTR- 3- SBV (80N) là vị trí tương đồng với nhiều picornavirus của động vật cĩ vú điển hình (40- 126 N)

So sánh trình tự với các polyprotein virus khác cho thấy các vùng tương đồng với helicase, protease và RNA-dependent RNA polymerase(RdRp= RNA – phụ thuộc RNA polymerase) đặc trưng SBV cũng giống với các picornavirus điển

hình về cấu trúc mã hĩa ở đầu 5 và cấu trúc khơng mã hĩa ở đầu 3 Trong số nhiều

tác nhân picornavirus- like cơn trùng, SBV giống với Infectious flacherie virus (IFV), cả về chiều dài bộ gen và trật tự gen và cho thấy đồng nhất 23.2% tồn bộ,

tương đồng 45.4% trong chuỗi amino axit với virus này và tương đồng ở vỏ protein

Từ so sánh trình tự cấu trúc của IFV đã phát hiện vị trí phân tách của chúng từ tiền

protein và suy luận ra vị trí mã hĩa protein capsid của SBV: 5 -VP3- VP4- VP1- VP2- 3 (Ghosh et al.1999)

Về cấu trúc phân tử, hạt SBV cĩ đường kính 28nm, khơng cĩ vỏ bao ngồi

và bề ngồi khơng đặc trưng với hệ số lắng đọng 160S Ba dải protein capsid lớn của SBV cĩ khối lượng phân tử là 32.5, 30.5 và 29.5 kDa Nĩ giống với 3 protein capsid của picornavirus về kích thước, nhưng Ghos et al (1999) chưa xác định được protein nhỏ VP4

Sự tổng hợp polyprotien picornavirus đi theo sau sự gắn bên trong ribosom

để trình tự bên trong 5’ UTR giới hạn một vị trí bên trong ribosom gọi là IRES Vùng này thường cĩ khoảng 450N bên trong 5’ UTR và chứa một lượng lớn cấu

trúc bậc hai- được cho là cần thiết cho một chức năng như IRES.Vùng 5’ UTR của

SBV (178N) được coi như là một IRES

1.2.4.2 ðặc điểm China Sacbrood virus

Cấu trúc ba chiều của CSBV qua kính hiển vi điện tử là 25nm, vỏ capsid 20

mặt với bề ngồi bằng phẳng, 12 pentons ở các đỉnh khối 20 mặt đĩ và 132 lỗ

xuyên qua vỏ Cấu trúc ba chiều cũng cho thấy độ dày tương ứng với bộ gen CSBV,

từ đĩ các nhà khoa đưa ra giả thuyết 20 mặt- bậc cấu trúc RNA, một đặc điểm mới khơng giống với bất kỳ picornavirus nào trước đây đã cơng bố

Bộ gen của virus là RNA sợi đơn, cực dương và cĩ 4 protein cấu trúc ở vỏ

capsid CSBV tương đồng với SBV ở đặc điểm sinh lý và sinh hĩa, trong khi kháng

nguyên của chúng khác nhau và khơng lây nhiễm chéo Phân tích trình tự cho thấy

CSBV và SBV khác nhau nhưng cĩ mức tương đồng cao Trình tự nucleotid của chúng

tương đồng 87.6% và trình tự axitamin suy luận tương đồng 94.6%(Zhang et al.2001)

1.3 Các kỹ thuật chẩn đốn cổ điển

1.3.1 Kỹ thuật RIA (Radio Immuno Assay)

RIA (Radio Immuno Assay) hay cịn gọi là “ðịnh lượng miễn dịch phĩng xạ”

là một trong những kỹ thuật chẩn đốn y học hạt nhân in vitro Phương pháp định

lượng miễn dịch phĩng xạ RIA dựa trên tính đặc hiệu cao của phản ứng miễn dịch, trong đĩ chất cần định lượng đĩng vai trị là kháng nguyên (KN) cùng với kháng nguyên đồng nhất về miễn dịch nhưng được đánh dấu bằng đồng vị phĩng xạ (KN*) liên kết với một kháng thể (KT) đặc hiệu để tạo thành các phức hợp (KN*-KT) và (KN-KT) Phương pháp định lượng miễn dịch phĩng xạ là kỹ thuật cĩ độ nhạy và độ chính xác cao, cĩ thể định lượng được các phân tử sinh học ở miền nồng độ rất thấp cỡ 10-9nanogram, thậm chí tới 10-12picogram) Kỹ thuật đánh dấu phĩng xạ tương đối đơn giản Máy đo tia gamma khơng quá đắt Nhưng phương pháp này sử dụng hố chất phĩng xạ nên phịng thí nghiệm cần phải được thiết kế phù hợp để đảm bảo các qui định về an tồn phĩng xạ Bên cạnh đĩ đồng vị phĩng

xạ bị phân rã nên thời gian sử dụng thường bị hạn chế

1.3.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) hay cịn gọi là “Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme” Dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đĩ kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm

cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy

phân cơ chất thành một chất cĩ màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thơng qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone,… Kỹ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kỹ thuật miễn dịch phĩng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an tồn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh

1.3.3 RT – PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction) hay “Phản ứng chuỗi trùng hợp” là một “cuộc cách mạng” trong chẩn đốn virus lây nhiễm và được coi là phương pháp chuẩn để áp dụng Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction ) được Kary mullis và cộng sự phát minh ra vào năm

1985 Kỹ thuật này tiếp tục được hồn thiện, phát triển thơng qua sự phân lập và

sản xuất thành cơng enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus

aquaticus và sự thiết kế thành cơng các máy chu kỳ nhiệt cho phép thay đổi nhanh

chĩng và chính xác nhiệt độ cho từng giai đoạn phản ứng Trong PCR thơng thường sau 20-30 vịng cĩ tới hàng triệu phân tử được copy từ một phân tử DNA (1 đoạn gen) Kỹ thuật RT-PCR trước khi tiến hành PCR thơng thường ARN cần

được chuyển thành cDNA nhờ enzyme Reverse Transcriptase (enzyme sao mã

ngược) Phương pháp PCR như vậy được gọi là RT-PCR Phương pháp này được

áp dụng rộng rãi trong chẩn đốn nhanh và định loại virus cĩ nhân là RNA Ưu điểm của phương pháp này là thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là cĩ thể khuếch đại được một trình tự đáng quan tâm Thực hiện đơn giản và ít tốn kém

Yêu cầu về ñộ tinh sạch của mẫu không cao Cần phải có RNA mồi ñặc trưng cho RNA cần khuếch ñại ðể có ñoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch ñại Kích thước RNA cần khuếch ñại không vượt quá 3kb Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần) Sai sót còn do sử dụng enzyme Taq-polymerase khoảng 104 (sai sót cho một lần sao chép)

1.4 Kỹ thuật Realtime- PCR

Realtime – PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch ñại DNA ñích hiển thị ñược ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, chính vì vậy nên gọi là “real-time” Nên do ñặc ñiểm này mà người làm thí nghiệm không cần phải làm tiếp các thí nghiệm ñể ñọc và phân tích kết quả ñể xác ñịnh có sản phẩm khuếch ñại ñích hay không vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch ñại ñược hiển thị ngay sau khi hoàn tất phản ứng khuếch ñại ðây cũng chính là ưu ñiểm vượt trội hơn của Realtime – PCR so với kỹ thuật PCR cổ ñiển, người làm thí nghiệm bỏ qua ñược bước ñiện di ñọc kết quả, tiết kiệm ñược thời gian và tránh ñộc hại Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch ñôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch ñôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa ñược tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng ñược cho mọi trình tự ñích nên chi phí sẽ thấp nhưng ñộ ñặc hiệu của sản phẩm phải ñược kiểm tra chặt chẽ thông qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân tích ñường cong nóng chảy (Melting curve analysis)

Trong Realtime – PCR, hiển thị cơ bản ñể người làm thí nghiệm có thể quan sát ñược trong quá trình nhân bản DNA của các ống phản ứng là một biểu ñồ khuếch ñại (Amlification…) Trên biểu ñồ khuếch ñại này người làm thí nghiệm sẽ thấy từng ống phản ứng cường ñộ huỳnh quang mà máy ghi nhận ñược trong những chu kỳ ñầu sẽ rất thấp và hầu như không thay ñổi Nhưng khi số lượng bản sao của DNA ñích ñạt ñến một ngưỡng nhất ñịnh thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ ñủ cường ñộ ñể ñược máy ghi nhận và lúc này ñường biểu diễn khuếch ñại bắt ñầu ngóc lên Cường ñộ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở ñi sẽ tăng gấp ñôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA ñích tăng gấp ñôi sau mỗi

chu kỳ Cường ñộ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ tăng trưởng ñến một mức ñộ nào ñó rồi ñạt ñến mức “bình nguyên”

Một thông số hết sức quan trọng khi phân tích một ñường biểu diễn khuếch ñại ñó là chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold – Ct) Chu kỳ ngưỡng (Ct) là chu kỳ nhiệt

mà ở tại thời ñiểm này thiết bị real-time ghi nhận ñược tín hiệu huỳnh quang phát ra

từ ống phản ứng bắt ñầu vượt qua cường ñộ huỳnh quang nền Trong thí nghiệm sẽ

có những ống phản ứng có Ct sớm hơn và có ống phản ứng sẽ có Ct muộn hơn Dựa vào chu kỳ ngưỡng ta có thể ñánh giá tương ñối về nồng ñộ virus của các mẫu bệnh Muốn ñịnh lượng tuyệt ñối nồng ñộ của virus gây bệnh (số lượng bản copy) ta cần phải xây dựng ñường chuẩn (Standard curve) Một ñường chuẩn ñược xây dựng với các nồng ñộ (pha loãng 5 ñến 10 lần) của một trình tự RNA chứng ñã biết và các giá trị Ct tương ứng ðể ñịnh lượng trình tự mục tiêu ban ñầu có trong mẫu, người ta ño giá trị Ct của mẫu, giá trị này lắp vào ñường chuẩn sẽ cho ñược nồng ñộ trình tự mục tiêu có trong mẫu ban ñầu ðây là phương pháp thường ñược sử dụng ñể ñịnh lượng

hàm lượng vật liệu di truyền của tác nhân gây bệnh hiện diện trong bệnh phẩm

*Các vấn ñề kỹ thuật của real-time PCR:

- Biểu ñồ khuếch ñại của real-time PCR

Trong real-time PCR, hiển thị cơ bản ñể người làm thí nghiệm có thể quan sát ñược trong quá trình nhân bản DNA của các ống phản ứng là một biểu ñồ khuếch ñại(amplification graph) Biểu ñồ này có trục tung (Y) là cường ñộ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X)

là các chu kỳ nhiệt Trên biểu ñồ khuếch ñại này người làm thí nghiệm sẽ thấy ñối với từng ống phản ứng, cường ñộ huỳnh quang mà máy ghi nhận ñược trong những chu kỳ ñầu sẽ rất thấp và hầu như không thay ñổi, hiển thị bằng một ñường thẳng nằm ngang, chúng ta có thể gọi ñây là “giai ñoạn ủ” hay “giai ñoạn tiềm phục”, vì trong giai ñoạn này dù DNA ñích ñã có thể ñược nhân bản thành các bản sao nhưng

do số lượng chưa ñủ ñể giúp cho chất phát huỳnh quang nhận ñược ánh sáng kích thích phát ra ánh sáng huỳnh quang ñủ cường ñộ ñể máy ghi nhận Nhưng một khi

số lượng bản sao của DNA ñích ñạt ñến một ngưỡng nhất ñịnh thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ ñủ cường ñộ ñể ñược máy ghi nhận và lúc này chúng ta sẽ thấy

ñường biểu diễn khuếch ñại bắt ñầu ngóc lên Cường ñộ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở ñi sẽ tăng gấp ñôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA ñích tăng gấp ñôi sau mỗi chu kỳ Chúng ta gọi giai ñoạn này là “giai ñoạn lũy thừa” về cường ñộ huỳnh quang, không phải là giai ñoạn tăng trưởng lũy thừa về số lượng bản sao của DNA ñích Cường ñộ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ tăng trưởng ñến một mức nào ñó thì ñộ tăng trưởng sẽ chậm dần và ñạt ñến bình nguyên vì các bản sao của DNA ñích, do phản ứng ñã cạn dần dNTP và

enzyme Taq polymerase không hoạt ñộng hiệu quả nữa, nên sẽ không còn gia tăng

số lượng theo cấp số 2 nữa Chúng ta gọi giai ñoạn này là “giai ñoạn bình nguyên”

Phân tích một ñường biểu diễn khuếch ñại (amplification curve) của một ống phản ứng sau khi hoàn tất ñược các chu kỳ nhiệt, chúng ta sẽ thấy một thông số hết sức quan trọng luôn ñi kèm với nó, ñó là chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) Chu

kỳ ngưỡng hay Ct là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời ñiểm này thiết bị real-time ghi nhận ñược tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt ñầu vượt qua cường ñộ huỳnh quang nền ðể có thể xác ñịnh ñược cường ñộ huỳnh quang nền, thiết bị real-time thường ghi nhận cường ñộ tín hiệu huỳnh quang xuất hiện trong ống phản ứng trong một số chu kỳ ñầu, chúng ta gọi là các chu kỳ nền (basal cycle), và lấy trung bình cộng của các cường ñộ huỳnh quang này làm cường ñộ huỳnh quang nền ðường cắt ngang ñi qua cường ñộ huỳnh quang nền này ñược gọi là ñường nền (base line) Chu kỳ ngưỡng là trị số ñược xác ñịnh bằng số chu kỳ mà ở ñó ñường nền cắt ñược ñường biển diễn khuếch ñại Do ñược tính toán như vậy nên chu kỳ ngưỡng thường là một số lẻ (ví dụ: Ct = 28.35) chứ ít khi là một số chẵn

Có những ống phản ứng có Ct sớm và cũng có những ống phản ứng có Ct xuất hiện muộn hơn, và câu hỏi ñược ñặt ra là lý do nào ñã làm ñược như vậy? Câu trả lời chính xác là do số lượng bản DNA ñích ban ñầu (starting quantity, Sq) có trong ống phản ứng nhiều hay ít Nếu trong ống phản ứng số lượng DNA ñích nhiều thì sẽ cần ít chu kỳ nhiệt hơn ñể ñạt ñến số lượng bản sao ñủ ñể ống phản ứng cho ñược tín hiệu huỳnh quang mà máy sẽ ghi nhận ñược, còn nếu số lượng DNA ñích

ít hơn thì cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn

Hình 1.1: Biểu ñồ khuếch ñại vẽ lên các ñường biểu diễn khuếch ñại của các

mẫu thử và mẫu chuẩn

-Biểu ñồ chuẩn của real-time PCR

Như ñã nói Ct của một ống phản ứng real-time PCR sớm hay muộn (Ct thấp hay Ct cao) là tùy thuộc vào số lượng bản DNA ñích ban ñầu có trong ống phản ứng ðây chính là một ñặc ñiểm vượt trội của real-time PCR so với PCR cổ ñiển, vì nhờ dựa vào ñặc ñiểm này mà người làm thí nghiệm xác ñịnh ñược số copies của tác nhân ñích có trong mẫu thử, một thông số mà PCR cổ ñiển không thể nào làm ñể

có ñược kết quả chính xác Người làm thí nghiệm chỉ ñọc kết quả PCR cổ ñiển sau khi hoàn tất phản ứng khuếch ñại, và kết quả này nếu ñịnh lượng ñược thì cũng chỉ

là kết quả ñịnh lượng số bản sao của DNA ñích sau khi hoàn tất khuếch ñại Mà trong PCR, số lượng bản sao cuối cùng không phản ảnh ñược một cách chính xác số lượng bản DNA ñích ban ñầu có trong mẫu thử vì trong ña số các trường hợp số lượng bản sao có trong ống phản ứng PCR là số lượng cực ñại sau khi PCR ñạt ñược giai ñoạn bình nguyên

Tuy nhiên ñể real-time PCR xác ñịnh ñược chính xác số lượng bản ñích ban ñầu có trong mẫu thử, người làm thí nghiệm phải thực hiện real-time PCR các mẫu thử chứa các số lượng bản DNA ñích ban ñầu cần xác ñịnh số lượng cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA ñích ban ñầu ñã biết rõ số lượng, và thường thì các mẫu chuẩn là các mẫu pha loãng theo hệ số pha loãng 10 chứa số lượng DNA

ñích ban ñầu Sau khi hoàn tất các chu kỳ nhiệt của real-time PCR, trên biểu ñồ

khuếch ñại (2 ) các mẫu chuẩn và các mẫu thử sẽ có các ñường biểu diễn khuếch ñại

của nó và tương ứng với các ñường biểu diễn khuếch ñại này, các mẫu chuẩn và mẫu thử ñều có một chu kỳ ngưỡng(Ct)

ðường biểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản DNA ñích ban ñầu có trong các mẫu chuẩn ñược gọi là ñường biểu diễn chuẩn (standard curve) ðây là một ñường thẳng tuyến tính ñi qua các ñiểm tọa ñộ xác ñịnh bởi số lượng bản DNA ñích ban ñầu của từng mẫu chuẩn(trên trục tung) và chu

kỳ ngưỡng của ống phản ứng chứa số lượng bản DNA ñích

Hình 1.2: Biểu ñồ chuẩn ñường biểu diễn chuẩn mối quan hệ giữa số lượng

bản DNA ñích và chu kỳ ngưỡng tương ứng

Trên biểu ñồ chuẩn này, trục tung (Y) là Ct còn trục hoành (X) là số lượng bản DNA ñích ban ñầu có trong các mẫu chuẩn Do các mẫu chuẩn thường ñược pha cách nhau theo hệ số pha loãng 10, nên số lượng bản DNA ñích trong các mẫu chuẩn ñược biểu thị bằng logarith cơ số 10 (log10) của số lượng này Do vậy trị 1.5,

2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 trên trục X là tương ứng với các số lượng bản ñích là 101.5,

102, 102.5, 103, 103.5, 104, 104.5 tức là 32, 100, 316, 1000, 3162, 10000, 31623 copies trong ống phản ứng

Có hai thông số ñược máy tính toán và hiển thị trên một ñường biểu diễn

chuẩn Hai thông số này rất có giá trị ñể người làm thử nghiệm có thể ñánh giá ñược thao tác pipetting của mình trong quá trình làm thử nghiệm

Thông số ñầu tiên là hệ số tương quan R2, ñánh giá ñộ chính xác của thao tác

pipetting lấy có ñúng thể tích mong muốn hay không Trị số R2 phải ñạt là trên hay bằng (≥) 0.99 có nghĩa là ñường biểu diễn chuẩn phải ñạt tuyến tính cao Khi người làm thử nghiệm không lấy ñược các thể tích chính xác thì chắc chắn các thể tích mẫu chuẩn cho vào real-time PCR mix sẽ không thể nào chính xác ñược, nên R2 chắc chắn sẽ không thể nào ñạt ≥ 0.99

Một trị số nữa rất có giá trị mà người làm thử nghiệm phải biết rõ ñó là hiệu

quả PCR, ñược gọi là E% (PCR efficiency) Một khi PCR ñạt hiệu quả lý tưởng, thì

cứ sau mỗi chu kỳ nhiệt cường ñộ huỳnh quang trong một ống phản ứng phải tăng gấp ñôi, còn nếu ở hai ống phản ứng có số lượng bản DNA ñích ban ñầu cách nhau một hệ số pha loãng A, thì hai ñường biểu diễn khuếch ñại sẽ cách nhau n chu kỳ với cường ñộ huỳnh quang của hai ống phản ứng cũng sẽ cách nhau một hệ số pha loãng A = 2n Như vậy, nếu ñộ pha loãng là 10 lần thì Ct của các ñộ pha loãng DNA ñích của mẫu chuẩn liên tiếp nhau sẽ cách nhau là 3.32 chu kỳ (tính toán từ công thức trên với A = 10, sẽ tính ñược n = 3.32 chu kỳ) Trong biểu ñồ chuẩn với các mẫu chuẩn cách nhau qua ñộ pha loãng hệ số 10 thì hiệu quả khuếch ñại E ñược tính là bằng công thức 10-1/slope với slope chính là ñộ ñốc của ñường biểu diễn chuẩn Một cách lý tưởng, hiệu quả khuếch ñại E của PCR phải ñạt ñược là 2 nghĩa

là số lượng bản sao nhân bản từ bản DNA ñích phải tăng gấp ñôi sau mỗi chu kỳ nhiệt trong giai ñoạn tăng trưởng lũy thừa, tức là 2 =10-1/slope Từ công thức này, chúng ta sẽ tính ra ñược ñường biểu diễn chuẩn lý tưởng phải có ñộ ñốc (slope) là -3.32 Như vậy, chúng ta thấy ñộ dốc chính là sự cách biệt nhau về chu kỳ ngưỡng giữa các ống chuẩn có số lượng giảm dần theo hệ số pha loãng10 Hiệu quả khuếch ñại cũng có thể tính bằng phần trăm (%) với công thức tính từ E là: E% = (E-1) x 100% Với E ñạt lý tưởng là 2 thì E% = 100 % ðối với bất cứ một ñường biểu diển chuẩn nào, ñều có thể tính ñược hiệu quả khuếch ñại E % = (10-1/slope– 1) x 100

% Do vậy nếu ñộ dốc của một ñường biểu diễn chuẩn là -3.436 thì E sẽ 3.436) = 1.954, vậy thì hiệu quả % của khuếch ñại (hiệu quả PCR) sẽ là: E %

là10-(1/-=(1.954 – 1) x 100% = 95.4 %, cĩ nghĩa là trong giai đoạn tăng trưởng lũy thừa số lượng bản sao sau mỗi chu kỳ nhiệt sẽ được nhân lên 1.954 lần hay hiệu quả PCR là 95.4 % Dĩ nhiên hiệu quả PCR lý tưởng là 100 %, nhưng trong thực tế thì hiệu quả PCR chấp nhận được phải trong khoảng 90 % - 105 % Người làm thí nghiệm phải biết dùng hiệu quả PCR hiển thị trong biểu đồ chuẩn để đánh giá thao tác pipetting

để pha lỗng mẫu của mình Sai lầm đầu tiên cĩ thể gặp trong thao tác pha lỗng mẫu là mang lượng DNA đích từ mẫu nồng độ cao xuống mẫu cĩ nồng độ thấp hơn,

mà thường là do khơng thay đầu pipette sau khi mang thể tích từ nồng độ cao xuống nồng độ thấp, vì vậy mà số lượng bản DNA đích cĩ trong các mẫu chuẩn được pha lỗng sẽ nhiều hơn tính tốn Ví dụ nếu thao tác pha lỗng chính xác, thì từ 10.000 copies xuống 1.000 copies rồi 100 copies sẽ chính xác như vậy; nhưng nếu khơng thay đầu pipette sau mỗi lần hút mẫu và lượng bản đích mang theo ở đầu pipette là 40% thì chúng ta sẽ cĩ các số lượng sẽ là 10.000 copies xuống 4.000 copies rồi 1.600 copies Vì vậy nên hiệu quả PCR được tính tốn bằng giá trị E sẽ khơng đạt được lý tưởng 90 % đến 105 % mà sẽ cao hơn 105 % Lý do là chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn sẽ bị gần nhau hơn làm cho độ dốc của đường biểu diễn chuẩn thấp

đi Ngược lại nếu thao tác pha lỗng mà khơng cho đủ thể tích mẫu chuẩn hút từ mẫu cĩ số lượng DNA chuẩn cao để pha mẫu chuẩn lượng thấp hơn (sai lầm này cĩ thể gặp khi dùng các đầu pipette bị dính dung dịch trên thành nên khơng đẩy được hết lượng mẫu từ đầu pipette xuống mẫu kế), và chính như vậy nên chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn liên tiếp nhau sẽ cách xa nhau làm cho độ dốc của đường biểu diễn chuẩn thấp đi, và hiệu quả PCR sẽ dưới 95 % Hiệu quả PCR cũng là một thơng số rất cĩ giá trị để nhà nghiên cứu tối ưu được kỹ thuật real-time PCR mà mình Nếu hiệu quả PCR thấp thì nguyên do cĩ thể là thiết kế mồi chưa đạt độ nhạy,

do tách chiết DNA đích cịn các ức chế ngăn cản phản ứng khuếch đại Nếu hiệu quả PCR cao thì nguyên do lại cĩ thể là do sự bắt cặp khơng đặc hiệu của mồi hay của đoạn dị

Như vậy, việc thiết lập biểu đồ chuẩn là rất cần thiết khi làm real-time PCR chẩn đốn, đặc biệt khi để xác định chính xác số lượng tác nhân đích ban đầu cĩ trong mẫu thử Biểu đồ chuẩn cĩ cơng dụng trước tiên là đánh giá được thao tác

pipetting của người làm thử nghiệm có ñạt không ðây là một việc là hết sức quan trọng vì nếu thao tác pipetting mà không chính xác thì sẽ không thể nào có ñược kết

quả ñịnh lượng chính xác ñược Do vậy sẽ thật là sai lầm và thiếu hiểu biết nếu nhà sản xuất bộ thuốc thử real-time PCR dành ñể ñịnh lượng tác nhân ñích lại cung cấp

sẵn các PCR mix có cho trước các lượng chuẩn của DNA ñích, gọi là các bộ chuẩn,

mà không ñể cho người làm thí nghiệm tự pha loãng các mẫu chuẩn ñể cho vào real-time PCR mix

Sau khi ñã ñánh giá ñược thao tác pipetting của người làm thử nghiệm là ñạt, người làm thử nghiệm sẽ sử dụng công dụng thứ hai của biểu ñồ chuẩn, ñó

là xác ñịnh ñược số lượng tác nhân ñích ban ñầu có trong mẫu thử Giá trị này ñược tính toán nhờ vào hàm số biểu thị mối tương quan giữa chu kỳ ngưỡng (Y

= Ct) với log10 của số lượng bản DNA ñích ban ñầu có trong ống phản ứng (X

= log10 Sq) Hàm số ñó là: Y =[slope (X)] + intercept, và các thông số slope và intercept ñều hiển thị trên biểu ñồ chuẩn Từ hàm số này, người làm thí nghiệm

sẽ hiểu ñược tại sao máy tính hiển thị ñược Sq, ñó là nhờ tính toán từ Sq = 10[(Ct – intercept)/slope] Từ Sq này, người làm thí nghiệm sẽ tính ñược số lượng tác nhân ñích ban ñầu có trong mẫu thử dựa vào hiệu quả tách chiết nucleic acid ñích từ mẫu thử và các pha loãng nếu có trong quá trình tách chiết củng như thực hiện Real-time PCR

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Thời gian

Nghiên cứu thực hiện từ tháng 4/2012 đến tháng 4/2013

2.1.2 ðịa điểm

- Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử - Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội

- Viện Cơng nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam

- Trung tâm nghiên cứu và nuơi Ong nhiệt đới - Trường ðH Nơng nghiệp Hà Nội

2.2 ðối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.2.1 ðối tượng

- Virus ấu trùng túi ( Sacbrood virus )

- Ong mật Apis cerana và Apis mellifera

2.2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu ong cĩ sẵn trong phịng thí nghiệm và được thu thập trên địa bàn Hà Nội

- Các dụng cụ thu mẫu: pank, ống nghiệm, găng tay, mũ lưới, sổ ghi chép, bút…

- Các hĩa chất và thiết bị máy mĩc cần thiết cho chẩn đốn phân tử (RT-PCR

và Realtime PCR)

- Cặp mồi dùng cho chẩn đốn

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu độ đặc hiệu của cặp mồi:

 Nghiên cứu độ đặc hiệu của các cặp mồi bằng kỹ thuật RT- PCR

 Nghiên cứu khả năng phát hiện SBV bằng kỹ thuật Realtime- PCR ( q-PCR)

 Nghiên cứu độ đặc hiệu của cặp mồi trong kỹ thuật Realtime- PCR

- Xác định độ nhạy của kỹ thuật chẩn đốn SBV trên ong mật:

 So sánh khả năng phát hiện của hai kỹ thuật RT- PCR và Realtime- PCR

 Khảo sát độ nhạy phát hiện ở mức pha lỗng khác nhau

 Khảo sát khả năng phát hiện SBV theo thời gian biểu hiện bệnh tích trên đàn ong

- Xây dựng quy trình kỹ thuật chẩn đốn

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thu thập mẫu ong

Hình 2.1 Bánh tổ ong nội có biểu

hiện bệnh ATT

Hình 2.2 Bánh tổ ong ngoại có biểu

hiện của bệnh ATT

Hình 2.3 ðuôi ấu trùng hình

túi nước

Hình 2.4 Ấu trùng có biểu

hiện nhọn ñầu

Thu thập các mẫu ong (cả ấu trùng và ong thợ) từ các ñàn ong có triệu chứng

bị bệnh virus Sacbrood và không bị bệnh tại các hộ nuôi ong, các trại ong di chuyển ñến khai thác mật hoa Kỹ thuật lấy mẫu ñược thực hiện theo phương pháp của Somerville (2009) và ghi chép thông tin mẫu như sau:

o Triệu trứng bất thường (hình dạng, màu sắc, …)

o Người thu mẫu: tên, thông tin liên hệ

2.4.2 Thí nghiệm bảo quản mẫu ong

- Các mẫu ong thu thập về bảo quản theo các thí nghiệm sau:

+ Thí nghiệm 1: mẫu sau khi thu thập được đưa tới phịng thí nghiệm tiến hành tách chiết trong thời gian nhanh nhất cĩ thể (mẫu càng tươi càng tốt)

+ Thí nghiệm 2: Tiến hành lấy mẫu và bảo quản ở các dung dịch và điều kiện nhiệt độ khác nhau:

* Mẫu được giữ trong dung dịch cồn, bảo quản điều kiện thường

* Mẫu được giữ trong dung dịch cồn, bảo quản điều điều kiện phích đá lạnh

* Mẫu khơng giữ trong dung dịch cồn, bảo quản điều kiện phích đá lạnh

- Ghi nhãn chi tiết cho từng mẫu:

o Triệu trứng (hình dạng, màu sắc, …)

o Người thu mẫu: tên, thơng tin liên hệ

2.4.3 Chẩn đốn bệnh lâm sàng

Các virus gây bệnh trên ong mật thường khơng cĩ triệu chứng lâm sàng rõ ràng nên rất khĩ chẩn đốn và phát hiện Tuy nhiên, SBV gây chết ấu trùng với các triệu chứng đặc trưng cĩ thể nhận thấy về màu sắc và hình dạng ở ấu trùng, nhất là

ở giai đoạn tiền nhộng - ấu trùng tuổi lớn (Ball, 1999)

Bình thường ấu trùng ong mật chuyển thành con nhộng sau 4 ngày kể từ khi

đã được vít nắp bởi các ong thợ Khi bị bệnh, ấu trùng khơng chuyển thành con nhộng sau 4 ngày vít nắp, chúng vẫn kéo dài cơ thể dọc theo chiều lưng trong các tổ (khác biệt với bệnh thối ấu trùng Châu Âu là phần lớn cơ thể xoắn lại tại một vị trí xác định trên cơ thể) Ấu trùng bệnh hình thành chất lỏng tích lũy giữa cơ thể và dưới da của nĩ, sau đĩ tạo thành túi, vì vậy đặt tên là bệnh ấu trùng túi

Các ấu trùng bình thường cĩ màu trắng ngà nhưng khi bị bệnh thì phần trước của ấu trùng, bao gồm đầu và ngực, là phần đầu tiên thay đổi màu Màu ấu trùng thay đổi từ màu trắng sáng đến vàng nhạt Ở giai đoạn này, đĩ là những dấu hiệu đặc biệt nhất Sau khi chết một vài ngày, ấu trùng sẽ trở thành màu nâu sẫm và cuối cùng là màu đen Khi chuyển sang màu nâu ấu trùng bắt đầu khơ dần khơ trong 10-

15 ngày nếu khơng được loại bỏ, lớp vỏ hình thành các nếp nhăn Sau khi chết vài ngày thì khơ dẹt cĩ dạng vảy hình chiếc thuyền mắc kẹt ở đáy tổ, cĩ liên kết lỏng lẻo với lỗ tổ nên cĩ thể dễ dàng gắp bỏ và chúng và trở nên giịn theo thời gian Nếu gắp bỏ ấu trùng bệnh từ tổ của chúng cĩ thể dễ dàng nhận thấy rằng lớp vỏ của chúng là khá dai tạo thành túi và bên trong của túi cĩ chất màu trắng đục hoặc màu vàng, cĩ khi cả ấu trùng giống như túi nước, cĩ thể chảy nước (Ball, 1999; FAO, 2006; Trend, 2007)

Một triệu chứng nữa cĩ thể dễ dàng nhận thấy là khi bị bệnh thì đàn ong thưa quân, bánh tổ cĩ một số vít nắp trũng xuống, cĩ một hoặc vài lỗ thủng như kim châm do ong thợ cắn nắp tổ để lộ ra ấu trùng chết, ấu trùng bị bệnh nhơ đầu nhọn lên khỏi lỗ tổ và nghiêng về một bên thành tổ tạo thành một “mĩc ấu trùng” (nên bệnh này con được gọi là bệnh nhọn đầu) Ấu trùng bệnh chết khơng cĩ mùi, khác với bệnh thối ấu trùng Châu Âu là cĩ mùi chua (Trend, 2007)

Tĩm lại cĩ hai yếu tố để chẩn đốn là:

- Yếu tố dịch tễ: Căn cứ vào tuổi, mùa, vùng lưu hành bệnh, số ấu trùng mắc bệnh trong cùng một thời gian

- Lâm sàng: ấu trùng bị bệnh nhơ đầu nhọn lên khỏi lỗ tổ và nghiêng về một bên thành tổ tạo thành một “mĩc ấu trùng” (nên bệnh này con được gọi là bệnh nhọn đầu)

2.4.4 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu đã thu thập

Hình 2.5: Mẫu ong Hình 2.6: Mẫu ấu trùng được chuẩn

bị để tách chiết RNA

Hình 2.7: Dụng cụ chuẩn bị cho tách

chiết RNA

Hình 2.8: Tách chiết RNA

Mẫu ñược tách triết theo phương pháp cá thể, mỗi mẫu là một ấu trùng tuổi lớn

Do mẫu ñược bảo quản bằng cồn nên phải làm sạch cồn bằng nước cất trước khi tách triết RNA tổng số Bằng cách ngâm mỗi mẫu trong khoảng 15ml nước cất trong khoảng 15-20 phút một lần (từ 2-3 lần) Sau ñó ñặt mẫu ấu trùng lên giấy thấm ñể loại hết phần nước bên ngoài Bỏ mẫu vào các tube 1,5ml ñã ñược ñánh số thứ tự theo mẫu

- Nghiền mẫu ấu trùng trong 750 µL dung dịch TRIzol-LS (Nghiền cho tới khi mẫu và dung dịch ñồng nhất)

- ðể mẫu ñã nghiền ñồng nhất ở nhiệt ñộ phòng trong khoảng 15 phút

- Ly tâm mẫu trong 10 phút (12000g và 4ºC) sau ñó thu lấy dịch trong phía trên sang tube mới

- Thêm 200 µL Chloroform:Isoamyl (24:1) ñảo ñều bằng tay hoặc vortex vài lần rồi ñể ở nhiệt ñộ phòng trong khoảng 10-15 phút

- Ly tâm mẫu trong 15 phút (12000g và 4ºC) sau ñó thu dịch trong phía trên sang tube mới (Chú ý: bước này phải cẩn thận không ñược hút lẫn lớp dịch phía dưới và lớp tủa ở giữa vì chỉ dính một chút cũng làm cho RNA tổng số bị nhiễm bẩn, ảnh hưởng ñến phản ứng sau này)

- Thêm 500 µL Iso-propanol ñảo ñều tube bằng tay và giữ mẫu trong tủ lạnh trong 15-20 phút

- Ly tâm 10 phút (12000g và 4ºC) thu lấy cặn RNA tổng số

- Rửa cặn hai lần bằng ethanol 75%

- ðể cặn RNA khô tự nhiên ở nhiệt ñộ phòng trong khoảng thời gian 30

phút (ðể ở nơi thống mát và sạch sẽ)

- Hịa tan cặn RNA bằng 25 µL nước RNase-free và bảo quản ở -80 ºC Tuy nhiên RNA chiết được cĩ thể bảo quản tạm thời ở -20 ºC trong thời gian ngắn

* Các mẫu sau khi tách chiết được điện di RNA tổng số và đo OD (1,8 < OD

< 2,0 ) Hàm lượng RNA tối thiểu để tiến hành phản ứng RT- PCR là 50 µg / 20 µl

2.4.5 Xác định khả năng chẩn đốn của hai kỹ thuật PCR để phát hiện virus gây bệnh trên ong mật

2.4.5.1 One step Reverse Transcription – PCR (RT – PCR)

ðộ dài sản phẩm khuếch đại

b Chu trình nhiệt

• Phản ứng RT – PCR tuân theo chu trình nhiệt sau:

Số vòng Nhiệt ñộ và thời gian

ðọc kết quả

Giếng Vạch 487 bp Kết quả

Mẫu ñối chứng âm

Mẫu kiểm tra

* Mẫu ấu trùng bị bệnh ñược sử dụng làm mẫu ñối chứng dương do Trung tâm nghiên cứu và phát triển Ong nhiệt ñới cung cấp

* Kỹ thuật RT-PCR có thể phát hiện bệnh SBV trên ong trưởng thành không biểu hiện triệu chứng lâm sàng vì thế có thể cảnh báo cho người nuôi ong có biện pháp phòng ngừa trước khi dịch bệnh bùng phát

* Phản ứng RT-PCR phát hiện SBV trên mẫu ấu trùng nhạy hơn trên mẫu trưởng thành

Số vòng Nhiệt ñộ và thời gian

ở 50ºC

hóa ở bước khởi ñầu biến tính ở 95ºC trong 5 phút Biến tính ở 95ºC trong10s

Gắn mồi ở 54ºC trong 30s 40x

Kéo dài ở 72ºC trong 1phút Biến tính sản phẩm khuếch ñại ở 95ºC Sản phẩm khuếch ñại bắt cặp hoàn toàn thành sợi ñôi ở 65ºC trong 30giây