BÀI GIẢNG VỀ PCR(POLYMERASE CHAIN REACTION)-NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG

BÀI GIẢNG VỀ PCR,POLYMERASE CHAIN REACTION,NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG

Trao đổi trực tuyến tại:

http://www.mientayvn.com/Y_online.html

TS BS Đỗ Thị Thanh Thủy

PCR

(POLYMERASE CHAIN REACTION) NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG

MỤC TIÊU BÀI GIẢNG

1 Trình bày được nguyên tắc PCR

2 Trình bày được cách chống ngoại nhiễm

trong PCR

3 Trình bày được ứng dụng của PCR

 Kary Mullis mô tả 1983 (Cetus Corporation)

 1985: Xuất hiện trên tạp chí “Science”

 Đạt Nobel Prize hóa học 1993

 Polymerase Chain Reaction (PCR) là phản ứng

khuếch đại một đoạn ADN bằng enzym polymerase, thực hiện trong ống nghiệm, có độ nhạy rất cao

PCR

POLYMERASE CHAIN REACTION

PCR

POLYMERASE CHAIN REACTION

Biến tính 92-96 o C

Bắt cặp 45-55 o C

PCR

POLYMERASE CHAIN REACTION

ĐỘNG HỌC CỦA PCR

NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR

1 DNA đích (đoạn DNA quan tâm)

Từ máu, chất tiết (đàm, dịch màng phổi, dịch khớp…,

tóc, phết niêm mạc má, phết cổ tử cung…), [C]  1 µg

(0,1-1 µg)

Đoạn DNA 1kb đến 10kb (thường <1 kb)

2 Mồi (primers)

đoạn đơn DNA thường có 18-22 nucleotide, bổ xung

với đoạn DNA đích 5’-ACT TTC ACC AGC GTT TCT GG-3’

Mồi xuôi, mồi ngược (F, R)

5’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC - TCCTGTGCA TTTCGCCACTAGAG-3’

3 DNA polymerase:

thuật đơn giản, đặc hiệu [C]: 1-2.5 units

Nhiều loại men chịu nhiệt, tùy mục đích

- Ly trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt:

Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus

thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent)…

- T ổng hợp bằng công nghệ tái tổ hợp như Ampli Taq, Vent (exo)

- Tổng hợp men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai

(proofreading) khi tổng hợp chuỗi

nucleic acid bổ sung (3-5 exonuclease)

như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu

NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR

4 dNTP (deoxy ribonucleotid):

dATP, dGTP, dCTP, dTTP [C]: 20-200µM

5 Ion Mg ++ - cofactor c ủa enzyme

(II) Dựa theo hiệu ứng

Peltier ngược.

H ai thanh kim loại nối với

hai cực của nguồn điện và

được điều chỉnh tự động

để chiều dòng điện đi qua

có thể thay đổi: bên này

nóng, bên kia lạnh Khi

thay đổi chiều dòng điện thì

nhiệt độ của hai thanh

cũng thay đổi ngược lại:

bên này lạnh, bên kia nóng

THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR

MÁY LUÂN NHIỆT

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH PCR

1 Khuếch đại DNA đích

2 Phát hiện sản phẩm PCR (amplicon)

PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PCR

Điện di trên gel agarose

( submarine agarose gel electrophoresis)

phân loại DNA dựa vào kích thước

1 Trong điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực

dương, đoạn DNA có kích thước ngắn di chuyển nhanh hơn so với đoạn có kích thước lớn

2 Trong khi điện di, ethidium bromide sẽ đan xen vào cấu

trúc sợi đôi DNA và làm sợi đôi DNA phát sáng khi quan sát dưới đèn UV

Chuẩn bị gel agarose

Chuẩn bị mẫu điện di :

– Ống DNA cần điện di (chứa 1 hoặc nhiều đoạn DNA

có kích thước khác nhau)

– Ống chứa thước đo (ladder, marker)

– Ống chứa dd đệm có màu (loading buffer)

– Chất phát quang (EtBr, SYBR G,…)

PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PCR

Chụp hình gel (đèn UV)

PCR

 Nhiễm chéo từ mẫu sang mẫu

UDG

(Uracyl DNAse Glycosylase)

dUTP

PCR MIX

PCR mix chứa hệ thống chống ngoại nhiễm

PCR luôn khởi đầu 40 o C x 10min

DNA đích

chứa T

U bị UDG cắt bỏ DNA đích

Avian myeloblastosis virus (AMV)

Moloney murine leukemia virus (M-MLV)

RT SỬ DỤNG MỒI ĐẶC HIỆU

RNA

RT (37 o C - 40 o C/1h)

Reverse transcriptase

dNTP

PCR (30 - 40 thermal cycles)

cDNA

RNA

RT (37 o C - 40 o C/1h)

Reverse transcriptase

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG PCR

1 Nhiệt độ biến tính và thời gian

2 Nhiệt độ bắt cặp và thiết kế đoạn mồi

3 Độ dài của đoạn mồi

4 Nhiệt độ giai đoạn kéo dài và thời gian

5 Số chu kỳ thực hiện

CHÚ Ý TRONG PCR

Khi thực hiện PCR

1 Chứng âm (Negative control)

Không cho DNA (thay bằng nước cất)

Mục đích : Phân biệt có ngoại nhiễm hay không

2 Chứng dương (Positive control)

Có một lượng DNA đã biết trong phản ứng

Mục đích: Đảm bảo phản ứng tốt

ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC

1 Phát hiện và nghiên cứu các tác nhân gây bệnh

2 Chẩn đoán và nghiên cứu các bệnh lí di truyền

3 Chẩn đoán và nghiên cứu một số bệnh ung thư

4 Pháp y, quan hệ huyết thống…

ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC HỌC

1 Sản xuất thuốc

2 Sản xuất vaccin …

PCR PHÁT HIỆN TÁC NHÂN VSV GÂY BỆNH

Bệnh phẩm Chuẩn bị mẫu

Ly trích acid nucleic acid

PCR Phát hiện sản phẩm PCR

- Tác nhân không thể nuôi

cấy thường qui

- Tác nhân VK nuôi cấy thất

bại (số lượng ít, hay đã bị điều trị KS trước đó)

ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC HỌC

Sản xuất Insulin

Yếu tố di truyền ngoài chromosomal

One cell with the

recombinant plasmid

A fermentor used to grow recombinant bacteria

ỨNG DỤNG PCR TRONG PHÁP Y,

QUAN HỆ HUYẾT THỐNG

Short Tandem Repeats (STR)

Các trình tự lập lại ngắn từ 2-5 bp,

dùng để phân biệt DNA profile của

từng người Sự đa hình trong STR thể

hiện số copy của các đoạn lặp lại khác

nhau trong quần thể

Ex: locus TH01 có 6 trình tự lập lại “TCAT”

CCC TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT AAA

- Có hơn 20 alleles chứa TH01 được biết

- Mỗi người được hưởng 1 allele từ cha hay mẹ

7 repeats

8 repeats

TCAT