Nghiên cứu một số biến đổi bệnh lý của chó mắc bệnh care và ứng dụng kỹ thuật RT PCR để chuẩn đoán bệnh

Triệu chứng lâm sàng của bệnh Care rất dễ lẫn với một số bệnh khác ở chĩ như: bệnh viêm gan truyền nhiễm, bệnh do Parvovirus, bệnh do Leptospira.... Mục đích và yêu cầu - Nhằm làm rõ cá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Mở ñầu của Luận văn cho tôi xin ñược chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ của các thầy, cô giáo trong khoa Thú y, các cán bộ Ban quản lý ñào tạo, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, cùng toàn thể các thầy giáo, cô giáo ñã giảng dạy tôi trong thời gian học Cao học tại trường ðặc biệt tôi xin chân

thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Thị Lan ñã tận tình hướng dẫn, ñóng góp

nhiều ý kiến quý báu, tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn ñồng nghiệp, bạn bè và gia ñình ñã giúp ñỡ, ñộng viên ñể tôi có thể hoàn thành chương trình học tập và hoàn thành Luận văn tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 20 tháng 09năm 2013

Tác giả

Trần Văn Nên

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này ñã ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 09 năm 2013 Tác giả luận văn

Trần Văn Nên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ðOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH, BIỀU ðỒ vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

MỞ ðẦU 1

1 ðặt vấn ñề 1

2 Mục ñích và yêu cầu 2

3 Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 ðặc ñiểm một số giống chó hiện có tại Việt nam và trên thế giới 3

1.1.1 Các giống chó nhập ngoại 3

1.1.2 Các giống chó của Việt Nam 8

1.2 Bệnh Care 9

1.2.1 Căn bệnh học 10

1.2.1.1 Phân loại virus gây bệnh Care 10

1.3.2 Hình thái của virus Care 11

1.2.1.3 Cấu trúc của virus Care 11

1.2.1.4 Sức ñề kháng của virus Care 12

1.2.1.5 Cơ chế sinh bệnh 13

1.2.2 Dịch tễ học 15

1.2.2.1 Loài vật mắc bệnh 15

1 2.2.2 Lứa tuổi mắc bệnh 16

1.2.2 3 Mùa vụ mắc bệnh 16

1.2.3 Truyền nhiễm học 16

1.2 3.1 Chất chứa virus 16

1.2.2.3 ðường xâm nhập và cách thức lây lan 16

1.2.3.3 Tỷ lệ ốm, tỷ lệ chết 17

1.2.4 Triệu chứng, bệnh tích 17

1.2.4.1 Triệu chứng lâm sàng 17

1.2.4.2 Bệnh tích 19

1.2.5 Chẩn đốn bệnh 22

1.2.5.1 Dựa vào đặc điểm dịch tễ học của bệnh 22

1.2.5.2Dựa vào triệu chứng lâm sàng 22

1.2.5.3 Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm 23

1.2.6 Phịng và điều trị bệnh 26

1.2.6.1 Phịng bệnh 26

1.2.6.2 ðiều trị 27

1.3 Phản ứng RT-PCR 27

1.3.1 Nguyên lý của phản ứng RT-PCR 27

1.3.2 Các bước tiến hành phản ứng PCR 29

Chương 2 ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM, THỜI GIAN, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 ðối tượng nghiên cứu 30

2.2 ðịa điểm nghiên cứu 30

2.3 Thời gian nghiên cứu 30

2.4 Nội dung nghiên cứu 30

2.5 Nguyên liệu 30

2.5.1 Mẫu bệnh phẩm 30

2.5.2 Dụng cụ, thiết bị, máy mĩc 31

2.5.3 Hĩa chất 31

2.6 Phương pháp nghiên cứu 31

2.6.1 Phương pháp điều tra dịch tễ học 31

2.6.2 Theo dõi triệu chứng lâm sàng của chĩ mắc bệnh Care 31

2.6.3 Mổ khám, quan sát bệnh tích ñại thể và lấy mẫu chó mắc bệnh Care 32

2.6.4 Phương pháp làm tiêu bản vi thể 33

2.7 Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR 36

2.7.1 Chuẩn bị mẫu cho phản ứng RT – PCR 36

2.7.2 Tiến hành phản ứng 36

2.7.3 ðiện di kiểm tra sản phẩm PCR 38

2.8 Phương pháp xử lý số liệu 38

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Khảo sát tỷ lệ mắc bệnh Care ở chó ở các giống, lứa tuổi và mùa vụ 40

3.1.1 Tổng hợp kết quả chó mắc bệnh ở các phòng khám bệnh chó trên ñịa bàn thành phố Hà Nội 40

3.1.2 Tỷ lệ bị bệnh Care ở các giống chó 41

3.1.3 Tỷ lệ mắc bệnh Care ở chó các lứa tuổi 44

3.1.4 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care ở các mùa vụ trong năm 46

3.2 Triệu chứng lâm sàng của chó nghi mắc bệnh Care 47

3.3 Biến ñổi bệnh tích của chó mắc bệnh Care 54

3.4 Biến ñổi bệnh tích vi thể chó mắc bệnh Care 60

3.5 Kết quả của phản ứng RT-PCR 66

KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70

1 Kết luận 70

2 ðề nghị 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Chu trình nhiệt RT-PCR 38

Bảng 3.1: Kết quả chẩn đốn bệnh của chĩ đưa tới khám tại một số phịng khám 40

Bảng 3.2: Tỷ lệ chĩ mắc bệnh Care ở các giống 42

Bảng 3.3: Tỷ lệ chĩ mắc bệnh Care các lứa tuổi 44

Bảng 3.4: Tỷ lệ chĩ mắc bệnh Care ở các mùa vụ trong năm 46

Bảng 3.5 Chĩ nghi mắc bệnh Care được lựa chọn để nghiên cứu 48

Bảng 3.6 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chĩ mắc bệnh Care 50

Bảng 3.7 Tỉ lệ biểu hiện triệu chứng lâm sàng chủ yếu của chĩ nghi mắc bệnh Care 52

Bảng 3.8 Biến đổi đại thể chủ yếu trên chĩ mắc bệnh Care 55

Bảng 3.9: Biến đổi bệnh tích vi thể chủ yếu ở chĩ mắc bệnh Care 61

Bảng 3.10: Kết quả của phản ứng RT-PCR 68

DANH MỤC HÌNH, BIỀU ðỒ

Hình 1.1 Hình thái của virus Care được chụp dưới kính hiển vi 11

Hình 1.2 Kit chẩn đốn nhanh bệnh Care 25

Hình 1 3 Tets chĩ nghi mắc bệnh care 25

Hình 1.4 Kết quả âm tính với bệnh Care (1 vạch) 26

Hình 1.5 Kết quả dương tính với bệnh Care (2 vạch) 26

Hình 3.1: Chĩ mắc bệnh Care đang khám và điều trị 53

Hình 3.2: Kiểm tra thân nhiệt chĩ mắc bệnh Care 53

Hình 3.3: Chĩ mắc bệnh Care ỉa ra máu 53

Hình 3.4: Chĩ mắc bệnh Care phân dính hậu mơn cĩ màu cà phê 53

Hình 3.5: Chĩ mắc bệnh Care nơn 53

Hình 3.6: Chĩ mắc bệnh Care gan bàn chân sừng hĩa 53

Hình 3.7: Chĩ mắc bệnh Care cĩ triệu chứng thần kinh khơng đi lại được 54

Hình 3.8: Chĩ mắc bệnh Care, chảy dịch mũi, mắt cĩ nhiều dử 54

Hình 3.9: Nổi mụn mủ ở vùng da mỏng 54

Hình 3.10: Nổi mụn mủ ở vùng da mỏng 54

Hình 3.11: Khí quản chứa đầy dịch 58

Hình 3.12: Phổi viêm 58

Hình 3.13: Hạch dưới hàm sưng chĩ mắc bệnh Care 58

Hình 3.14: Hạch màng treo ruột sưng chĩ mắc bệnh Care 58

Hình 3.15: Xuất huyết đại não và tiểu não ở chĩ mắc bệnh Care 59

Hình 3.16: Túi mật sưng 59

Hình 3.17: Mỡ vành tim và tim nhão Phổi sung và xuất huyết của chĩ mắc bệnh Care 59

Hình 3.18: Ruột non xuất huyết và bong hết niêm mạc 59

Hình 3.19: Cơ tim xuất huyết 59

Hình 3.20: Xoang ngực chứa nhiều dịch 59

Hình 3.21: Thận sưng 60

Hình 3.22: Xuất huyết ruột già 60

Hình 3.23: Khí quản bị xuất huyết chó mắc bệnh Care 60

Hình 3.24: Phổi viêm có mủ 60

Hình 3.25: Chó mắc bệnh Care bị viêm phế quản phổi (HE x 10) 64

Hình 3.26: Chó mắc bệnh Care lông nhung ruột ñứt (HE x 10) 64

Hình 3.27: Cơ tim xuất huyết ở chó mắc bệnh Care (HE x10) 65

Hình 3.28: Nang lympho teo (HE x10) 65

Hình 3.29: Thâm nhiễm tế bào viêm ở phổi của chó mắc bệnh Care (HE x10) 65

Hình 3.30: Tế bào ruột xuất huyết và thoái hóa (HE x40) 65

Hình 3.31: Tế bào gan xuất huyết, thâm nhiễm tế bào gan ở chó mắc bệnh Care (HE x 40) 65

Hình 3.32: Tế bào hạch phổi xuất huyết lan tràn của chó mắc bệnh Care (HE x 10) 65

Hình 3.33 Virus Care ñược phát hiện bằng phản ứng RT-PCR (Chó C01) 66

Hình 3.34 Virus Care ñược phát hiện bằng phản ứng RT-PCR (Chó C02) 67

Hình 3.35 Virus Care ñược phát hiện bằng phản ứng RT-PCR (Chó C04) 67

Biểu ñồ 3.1: Tỉ lệ chó mắc bệnh Care ở chó các lứa tuổi 44

Biều ñồ 3.2 Tỷ lệ chó mắc bệnh Care ở chó các lứa tuổi 46

Biều ñồ 3.3 Tỉ lệ chó mặc bệnh Care ở các mùa vụ trong năm 47

4 EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

5 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

12 PPRV Peste des Petits Ruminants Virus

14 PBS Photphate buffer saline

15 PDV Phocin Distemper virus

16 CPE Cyto pathogenic Effect

17 Cdna Complementary Deoxyribonucleic Acids

18 RT-PCR Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction

19 TCID 50 50% Tissue Culture Infective Dose

MỞ ðẦU

1 ðặt vấn đề

Từ xưa đến nay lồi chĩ là một trong những lồi động vật gần gũi và trung thành nhất đối với con người Hiện nay cĩ khoảng 320 giống chĩ được phân bố rộng khắp thế giới Chĩ cĩ nhiều đặc điểm quý: trung thành, cĩ giác quan nhạy bén… Mỗi một lồi chĩ lại cĩ một đặc điểm nổi trội riêng, nên con người sử dụng chúng vào những mục đích khác nhau như giữ nhà, săn thú, làm cảnh, dị mìn, trinh thám, gĩp phần bảo vệ an ninh quốc gia, bảo vệ biên giới lãnh thổ

Vai trị của chĩ trong cuộc sống được đánh giá cao Cùng với sự phát triển văn hố, kinh tế xã hội và khoa học, nhu cầu nuơi chĩ ngày càng nhiều trên khắp thế giới Ở Việt Nam, một số năm gần đây phong trào nuơi chĩ cảnh phát triển rất mạnh, đặc biệt ở các thành phố lớn như Hà Nội, Hải Phịng, thành phố Hồ Chí Minh

Tình hình dịch bệnh ở chĩ cũng rất phức tạp gây thiệt hại kinh tế cho người nuơi Bệnh Care (Canine Distemper Virus – CDV) hiện nay khá phổ biến trên đàn chĩ nội cũng như đàn chĩ nhập ngoại Bệnh Care do virus Care gây ra, cĩ triệu chứng tồn thân như triệu chứng đường tiêu hố, hơ hấp, thần kinh Triệu chứng lâm sàng của bệnh Care rất dễ lẫn với một số bệnh khác ở chĩ như: bệnh viêm gan truyền nhiễm, bệnh do Parvovirus, bệnh do Leptospira Vì vậy, vấn đề cấp thiết là phải tìm ra những biện pháp chẩn đốn nhanh, chính xác và tiện lợi, để từ đĩ cĩ những biện pháp phịng và trị bệnh Care một cách hiệu quả, giảm thiệt hại kinh tế cho người nuơi

Phương pháp RT-PCR là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược

RT (Reverse Transcription) và phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp này cĩ thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất ít

mà khơng thể phát hiện bằng các phương pháp khác RT-PCR là phương pháp chẩn đốn nhanh, chính xác, và được ứng dụng rất rộng rãi trong y học, khoa học hình sự, khảo cổ học và các lĩnh vực khác trên thế giới Tuy nhiên, ở Việt Nam phương pháp này cũng mới bắt đầu được ứng dụng trong nghiên cứu và chẩn đốn bệnh động vật, đặc biệt là trong chẩn đốn bệnh Care ở chĩ Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết trên, dựa vào những tính năng ưu việt của phản ứng

RT-PCR chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biến đổi bệnh

lý của chĩ mắc bệnh Care và ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chẩn đốn bệnh ”

2 Mục đích và yêu cầu

- Nhằm làm rõ các triệu chứng lâm sàng, biến đổi bệnh lý đại thể, vi thể của chĩ mắc bệnh Care trong những năm gần đây và ứng dụng được kỹ thuật RT-PCR để chẩn đốn bệnh Care ở chĩ

3 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Kết quả nghiên cứu đặc điểm bệnh lý giúp cho Bác sỹ Thú y cĩ thêm kinh nghiệm để chẩn đốn lâm sàng bệnh Care, phát hiện sớm những chĩ nghi mắc bệnh Care

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ðặc điểm một số giống chĩ hiện cĩ tại Việt nam và trên thế giới

Giống là một nhĩm gia súc hay một tập đồn gia súc Chúng được xuất phát từ nguồn gốc hay một tổ tiên nào đĩ Các cá thể của giống ấy tương đối giống nhau về ngoại hình, thể vĩc, màu sắc, lơng, da, khả năng sinh sản, sức sản xuất và cĩ tính di truyền tương đối ổn định Nhĩm gia súc ấy phải đủ số lượng nhất định cả về đực và cái để đảm bảo sự tồn vong của nịi giống

Căn cứ vào các tài liệu về lịch sử học, khảo cổ học, thơng qua sự so sánh giống nhau về hình thái học và sinh vật học, các nhà sinh vật học phần lớn đều cho rằng tổ tiên của chĩ nhà là chĩ sĩi Chĩ nhà được con người nuơi dưỡng và thuần hố sớm nhất cách đây 30.000 - 40.000 năm về trước vào giữa thời kỳ đồ đá, thời kỳ chế độ mẫu hệ

Nhà bác học Darwwin cho rằng: “Chĩ nhà được sinh ra từ cuộc tạp giao tự nhiên giữa chĩ sĩi, cầy, cáo và được lồi người nuơi dưỡng, chọn giống thích hợp để trở thành chĩ nhà thuần dưỡng”

Lồi người đã cĩ tác động hữu hiệu đến sự phát triển của lồi chĩ từ hàng nghìn năm nay bằng cách thuần dưỡng, lai tạo và chọn lọc qua nhiều thế

hệ đã tạo ra khoảng 500 giống chĩ (theo Hapơ, Hauxơ, 2002) Ngày nay chúng ta đã cĩ một đội ngũ chĩ phong phú cả về số lượng và chất lượng phục

vụ cho vấn đề an ninh quốc phịng và thị hiếu của người dân

1.1.1 Các giống chĩ nhập ngoại

- Chĩ German Shepher (Berger ðức)

Cĩ nhiều giả thuyết về nguồn gốc của giống chĩ này: cĩ giả thuyết cho rằng nĩ là kết quả của sự pha tạp giữa nhiều giống chĩ chăn cừu sống ở ðức hoặc là kết quả của sự pha tạp tự phát giữa những con chĩ cái chăn cừu và chĩ sĩi Cho đến nay vẫn chưa cĩ những câu trả lời chính xác nhất về nguồn gốc giống chĩ này Tuy nhiên, giống chĩ lơng dài được những người chăn

cừu ðức phát hiện lần ñầu tiên tại Hanover năm 1982 và giống chó lông ngắn ñược phát hiện lần ñầu tiên tại Berlin năm 1889 Becgiê ðức có thân hình thon dài cường tráng, trán hơi lồi, tai to dựng ñứng hướng ra phia trước, tai của chó con dưới 6 tháng tuổi có thể hơi cụp xuống Mắt giống nhân quả hạnh ñào, tròn ñen và rất tinh nhanh ðuôi to dài nhiều lông và rủ xuống ñến mắt cá chân Hai chân trước và vai săn chắc, bắp ñùi dày và cường tráng Bàn chân tròn với gan bàn chân dày, German Shepher có màu lông ñen, ñen – vàng, xám tro, ngoài ra có màu nâu, vàng hoặc xám bạc Giống chó này rất dũng cảm, vui vẻ, biết vâng lời, rất ñiềm tĩnh, thân thiện với ñồng loại và trẻ em, biết khoan dung với con vật khác, biết ñề phòng người lạ và dễ huấn luyện

- Chó Labador Retreiver

Labador Retreiver là 1 trong 5 giống chó phổ biến nhất ở Anh và Mỹ Giống chó này lần ñầu tiên ñược mang ñến Great Britain năm 1800 trên những tàu của Anh ñến từ Labrador ðặc ñiểm nổi bật của giống chó này là thân hình ngắn, chắc, cao 55 –57cm, nặng 24-36kg, ñầu to mũi dày Mắt màu hạt dẻ hoặc nâu nhạt, mắt tinh nhanh thông minh, tai to cụp ðộ dài ñuôi vừa phải, có nhiều lông, lông ñuôi ngắn Chân to khoẻ Lông thẳng dày có màu lông ñen, vàng, bạc, ñôi khi có màu vàng pha một chút ñen

Labrador là một giống chó cứu hộ nổi tiếng của nước Anh, nó giúp những người ñánh cá kéo lưới vào bờ, cứu người chết ñuối Ngoài ra Labrador còn có khả năng ñánh hơi kỳ diệu, nó có thể phát hiện ma tuý, chất nổ…với một lượng rất nhỏ Labrador là 1 giống chó có chỉ số thông minh cao trong các giống chó Nó là một giống chó trung thành (Hapơ, Hauxơ, 2002)

- Chó Rottweiler

Rottweiler là tên một thị trấn nằm tại miền Nam nước ðức, nơi phát hiện ra giống chó này ðây là giống chó có thể phục vụ trong những công việc ñặc biệt, có những tính cách mạnh mẽ ðặc ñiểm nổi bật của giống chó này là có tầm vóc lớn, có bộ lông hấp dẫn và có tính di truyền tốt Rottweiler

có hình dáng cân ñối, ñường bệ ngực rộng và sâu, lưng thẳng và không dài, tạo thể vóc cân ñối và vững chắc Rottweiler cao 58 – 69cm, nặng 41 – 50kg, con cái có tầm vóc nhỏ hơn ðầu Rottweiler có dạng hình cầu, khoảng cách giữa hai tai lớn, mõm to bè Mắt có màu nâu ñen rất linh hoạt Tai hình tam giác hơi cụp về phía trước Lông ngắn dày có màu ñen có ñốm ở gò má, mõm, 4 chân Từ xa xưa người ta ñã dùng giống Rottweiler ñể chăn gia súc và bảo vệ tài sản vì giống chó này biết vâng lời, dũng cảm, trầm tính , dễ huấn luyện

Ngày nay Rottweiler ñược sử dụng trong việc canh gác bảo vệ, tìm kiếm công việc cứu hộ trên núi, kéo xe…ở nhiều nước người ta xem giống chó này như người bạn, một phương tiện canh gác, giữ nhà Rottweiler có lịch

sử quân sự dài và ñáng kính phục, chúng từng nhảy dù với quân ñội Brazil (Hapơ, Hauxơ, 2002)

- Chó Irish Setter

Irish Setter là giống chó có những ñặc tính mạnh mẽ, tình cảm dễ gần,

có tính ñộc lập cao Ngoài ra chúng là con vật nuôi trong nhà rất linh hoạt và hiền lành Setter có nguồn gốc Ireland Chiều cao của con ñực từ 54 – 62cm, cân nặng 18,5 – 22kg, con cái cao 52 – 60cm, cân nặng 15 - 22kg Chiều dài mõm thường = 1/2 chiều dài toàn bộ ñầu Sống mũi thẳng, mũi ñen hoặc hơi ñen, hàm có răng gắn hình vòng cung Mắt màu hạt dẻ hoặc nâu sẫm Tai chia thành hình tam giác, mỏng mềm Ngực hẹp, ức sâu và thuôn ðuôi dài nhiều lông, lông dài và mềm trừ lông phần ñầu ngắn, thậm chí lông còn phủ kín chân, lông màu ñỏ gụ, nhuộm vàng và sáng bạc với vệt ñốm ñen

Irish Setter cực kỳ nhanh nhẹn với khứu giác tốt và dễ thích nghi với mọi ñịa hình với bất kỳ ñiều kiện khí hậu nào Vào thế kỷ 18 nó ñược dùng ñể tìm dấu vết và làm chó săn Giống chó này có tuổi thọ cao (Hapơ, Hauxơ, 2002)

- Chó Boxer

Là một giống chó có những ñặc tính tốt như thông minh, trung thành, tình cảm và rất linh hoạt

Bức tranh ñầu tiên về giống chó này xuất hiện vào thế kỷ 17 trên tấm thảm Flemish, nhưng chắc hẳn nó ra ñời nhờ trí tưởng tượng của người nghệ

sỹ và thời kỳ ñó Boxer chưa ñược ra ñời Nó ñược phát triển vào những năm

1850 ở Munich trong sự lai tạp giữa giống Bullenbeiser mastiff và Bulldog Mastiff ñược sử dụng trong việc săn bắt gấu Bulldog ñể ñánh nhau với những con bò ñực vì vậy có thể hy vọng rằng Boxer sẽ ñược thừa hưởng những ñặc tính hung dữ của tổ tiên Tuy nhiên thực tế giống chó này không dữ tợn lắm

Sự hoàn hảo về hình thể và tính cách của Boxer ñược hoàn chỉnh vào năm

1896 khi câu lạc bộ Boxer ñầu tiên ñược thành lập

Boxer là giống chó lai tạo ñẹp nhất: ðầu cân xứng với thân và hơi dốc Hàm thấp và kéo dài uốn cong lên trên Mũi to và ñen với lỗ mũi to Tai ở ñỉnh ñầu và bị cắt cụt ở phía trên Cổ rộng khoẻ săn chắc và không có yếm ðuôi ngắn và cong lên cao Chân trước có thể thẳng và song song nhau Chiều cao trung bình 57-63cm, con cái 53,2-58,4cm Nặng 30-32kg, con cái 24-25kg

Dalmatian trung thành, ñộc lập trầm tính nhưng rất linh hoạt khi cần thiết Chúng thích sống gần người và thích ñược vuốt ve, thích chơi với trẻ

em Chó có trí nhớ tốt và hay thù dai Những con chó trưởng thành ñược sử dụng như chó săn Vào thế kỷ 19 người ta dùng nó ñể chở hàng và săn bắn, sau ñó ñược dùng vào công tác bảo vệ Chó Dalmatian sạch sẽ, khéo léo thích ñược tắm rửa (Hapơ, Hauxơ, 2002)

- Chó Elish Bulldog

Có nguồn gốc từ Asitic Matiff cổ xưa nhưng nó phát triển hoàn toàn ở Great Britain Tên Bulldog là tên từ thời xa xưa Không chỉ trông như một con bò mà tính của con này rất hung hăng Trước khi có luật cấm ñấu chó vào thế kỷ 19 thì giống chó này ñược cho ñấu với những con bò ñực trên vũ ñài Ngoại hình nhỏ, nhưng ñầu to rất hung dữ Trọng lượng 24-25kg, con cái 22-23kg Cao khoảng 25-30cm ðầu to với gò má nhô ra hai bên mắt Da vùng ñầu săn chắc và có nhiều nếp gấp Mõm và mũi ngắn, mũi to ñen, lỗ mũi

to Môi trên dày, hàm dưới nhô ra phía trước Mắt tròn ñen.Tai nhỏ mỏng có nếp gấp ñằng sau như hình bông hoa hồng Cổ có yếm ðuôi ngắn và cong Lông ngắn, mềm ,màu trắng, nâu ñốm

- Chó ST Bernard

ST Bernard có nguồn gốc rất cổ xưa Giống chó này là con cháu của giống Mastiff và Great Dane, do những người thầy tu lai tạo giữa hai giống chó này mà thành Nó có nguồn gốc từ trước ñây khoảng 100 năm Vào giữa thế kỷ 17 nó ñược dùng như giống chó cứu hộ

ST Bernard là giống chó to lớn cường tráng, ñầu to Cao trung bình 70cm, con cái cao 65cm, nặng khoảng 50-55kg Xương vùng ñầu to lồi, nhưng nếp gấp ở vùng da ñầu rất khác biệt, rãnh mũi thẳng Mõm ngắn nhưng cao Số răng nhiều và chắc Mắt màu nâu ñen và thiên về phía trước hơn là sang hai bên ñầu Tai vừa phải và cụp sang hai bên Cổ to có yếm Lông dài trung bình và hơi lượn sóng Lông màu ñỏ pha trắng hoặc trắng pha ñỏ, màu

ñỏ nhạt Con ñực thường có màu ñen

Biết vâng lời và trung thành là ñặc tính tốt của loài chó này Nó thường không thích những con chó nhỏ Giống chó này có khả năng huyền bí về dự báo những trận tuyết lở

- Chó Napolian Mastiff

Napolitan Mastiff cao 65 – 75cm, con cái cao 60 – 70cm Có thể nặng tới 70kg Giống chó này trông hung dữ ðầu to với nhiều nếp nhăn lớn ñến

tận cổ Lông ngắn dày có màu ựen, xám hoặc màu vàng ựôi khi có màu trắng

ở bàn chân Mắt có màu phù hợp với màu lông

Mặc dù bên ngoài trông hung dữ nhưng nó hiền lành thân thiện và thắch chơi với trẻ em, dũng cảm và chịu ựược khó khăn

Trong lịch sử giống chó này ựược dùng trong chiến tranh ựể ựánh nhau, truy bắt tội phạm và làm bảo vệ Hiện nay chó ựược huấn luyện ựể bảo vệ người và tài sản ( Hapơ Hauxơ, 2002)

- Chó Great Dane

Có ngoại hình ựẹp, ựáng yêu và trung thành Giống chó này không hung dữ lắm nhưng tầm cỡ trung bình của nó cũng ựủ ựể ngăn cản ựối thủ Great Dane là giống chó khá phàm ăn, thắch vận ựộng, cơ thể phát triển chậm ựến 20 tháng tuổi cơ thể chúng mới phát triển hoàn thiện Nó vụng về nhưng

có thể làm người bạn tốt và bảo vệ trung thành cho con người

Great Dane có nguồn gốc 100% ở đức đầu tiên nó ựược dùng như một con chó chiến ựấu bởi các bộ lạc người Celtic và Gezmantic thậm chắ nó còn nổi tiếng như một con chó săn, chó bảo vệ (4.000 năm trước ựây người ta

mô tả Great Dane gần giống như Mastiff) Giống Great Dane hiện nay ựược dùng nhiều trong công tác bảo vệ, cao 76-81 cân nặng 45-55kg Màu lông cơ bản là màu trắng có thể có vệt ựốm đôi khi có màu ựen tuyền với những ựốm trắng ở cổ, cuối ựuôi và chân ( Hapơ Hauxơ, 2002).

1.1.2 Các giống chó của Việt Nam

- Chó vàng: Chó có tầm vóc trung bình, cao 50 - 55 cm, nặng 12 - 15

kg, có bộ lông vàng tuyền là nòi chó săn, khá tinh khôn và quấn chủ, ựược nuôi nhiều ở khắp các ựồng quê Chó ựực phối giống ựược lứa tuổi 15 - 18 tháng Chó cái sinh sản ở lứa tuổi 12 - 14 tháng Mỗi lứa chó cái ựẻ 4 - 7 con, trung bình 5 con

- Chó Mèo: Là giống chó của người HỖ Mông: Có tầm vóc lớn, cao 55

- 60 cm, nặng 18 - 20 kg Chân to khoẻ, tai nhỏ nhưng vểnh, ựược nuôi nhiều

ở các vùng núi cao: Tây Bắc, Cao BằngẦ

- Chó Phú Quốc: Là giống chó tinh khôn, dũng cảm, chó Phú Quốc

thường có bộ lông ñen, ñốm trắng hay vàng, bụng thon, trên lưng lông mọc có hình xoáy, hay lật theo kiểu rẽ ngôi, lông vàng xám có các ñường kẻ nhạt chạy dọc theo thân Chó cao 50 - 60 cm, nặng 20 - 25 kg

1.2 Bệnh Care

Bệnh Care hay bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm thường xảy ra ở chó non, lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao ðây là một căn bệnh nguy hiểm nhất ở chó trong nửa ñầu thế kỷ XIX Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở chó con 3 - 6 tháng tuổi, khi miễn dịch chủ ñộng từ mẹ truyền sang ñã giảm thì tỷ lệ mắc bệnh từ 25% tới trên 30% và tỷ lệ chết ñối với chó mắc bệnh thường cao từ 50% - 90% (Ron Hines, 2006) Chó mắc bệnh này thấy tổn thương lớn ở hệ tiêu hoá, ñặc biệt ở dạ dày và ruột, hệ thần kinh trung ương và hệ hô hấp (Vương ðức Chất và cs, 2004)

Bệnh Care ñược báo cáo lần ñầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel và Gillespie,1972a) Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh ñã ñược mô

tả từ năm 1809 bởi EdwardJenner (Appel và Gillespie, 1972b; Shell, 1990) Năm 1905, bác sĩ thú y người Pháp Henri Care ñã phân lập ñược mầm bệnh

từ nước mũi của chó bị bệnh (Care, 1905) Ông ñã ñem lọc mẫu bệnh phẩm qua màng lọc vi khuẩn và ñem gây bệnh thực nghiệm cho chó khỏe mạnh khác thì thấy vẫn gây ñược bệnh Vì thế, ông kết luận nguyên nhân của bệnh

là do virus Sau này, người ta lấy tên ông ñể ñặt tên cho mầm bệnh và tên bệnh (David và Martin, 1979)

Sau ñó, năm 1923 Putoni lần ñầu tiên chế vacxin nhược ñộc, tuy nhiên vacxin này ñộc lực vẫn còn cao Từ năm 1948 về sau, với sự phát triển mạnh mẽ của virus học, nhiều vacxin phòng bệnh Care có hiệu quả ra ñời (Ron Hines, 2006) Các công trình nghiên cứu về sự liên quan kháng nguyên giữa virus Care và virus sởi, giữa virus Care và virus dịch tả trâu bò, của J.M Dams Pgoret ñã mở rộng ra ñược nhiều triển vọng cho việc phòng bệnh Care bằng cách dùng virus dịch tả trâu bò và virus sởi theo nghiên cứu của Merchant trong giai ñoạn 1961 – 1969

Hiện nay bệnh có ở khắp nơi trên thế giới, không những xảy ra ở chó nuôi mà còn ở nhiều quần thể ñộng vật hoang dã Qua thống kê các nghiên cứu cho thấy, bệnh Care góp phần quan trọng vào sự tuyệt chủng của chồn chân ñen, hổ Tasmania và là nguyên nhân gây tử vong ñịnh kỳ của chó hoang dã châu Phi (Assessment, 2005) Năm 1991, bệnh xảy ra trên quần thể sư tử Serengeti ở Tanzania làm giảm 20% số lượng toàn ñàn (Timothy và cs, 2009) ðặc biệt virus Care ñã biến ñổi và có khả năng gây bệnh cho một số ñộng vật biển (Kennedy et al, 1989)

Ở Việt Nam, bệnh ñược phát hiện từ năm 1920 Cho ñến nay, bệnh xảy

ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006) Nguyễn Thị Lan và cs ñã nghiên cứu thành công ñặc tính sinh trưởng cụ thể của một số chủng CDV trên dòng tế bào Vero có gắn receptor tương ứng với virus Care (Vero-DogSLAMtag hay Vero-DST) Qua ñó tác giả cũng chỉ ra tế bào Vero-DST là dòng tế bào thích hợp có thể sử dụng ñể phân lập

và xác ñịnh hiệu giá virus (Lan và cs, 2005)

1.2.1 Căn bệnh học

1.2.1.1 Phân loại virus gây bệnh Care

CDV là một thành viên của giống Morbillivirus, thuộc họ Paramixoviridae Các thành viên khác của giống Morbillivirus gồm virus gây bệnh sởi ở người (MV), virus dịch tả trâu bò (RPV), virus gây bệnh ở ñộng vật nhai lại nhỏ (PPRV), virus gây bệnh trên ñộng vật có vú dưới nước (cá heo, hải cẩu) (Griffin, 2001; Murphy, 1999) Virus Care cũng gây bệnh trên ñộng vật hoang dã ăn thịt và hổ (Appel và cs, 1994; Frolich và cs, 2000; Martella và cs, 2002)

Morbillivirus là một virus tương ñối lớn (ñường kính 150 – 250nm), cấu trúc xoắn ốc, chúng có một lớp vỏ lipoprotein (Kennedy et al, 1989)

Mặc dù có những sự khác biệt nhỏ về kháng nguyên giữa các chủng CDV khác nhau nhưng nó thường ñược chấp nhận là chỉ có một serotype Tuy nhiên, có sự khác biệt ñáng kể về khả năng gây bệnh của các chủng virus

phân lập và các type ở các khu vực ñịa lý khác nhau ñã ñược nói tới Các type của CDV bao gồm: Asia 1 (Nhật Bản, Trung Quốc), Asia 2 (chỉ có ở Nhật Bản), Bắc Cực, ñộng vật hoang dã châu Âu, USA 1 và 2, CDV cổ ñiển (Onderstepoort, Convac, Rockborne và Snyder Hill) (Haas và cs, 1997; 1999; Harder và Osterhaus, 1997; Martella và cs, 2006; 2007; Yoshida và cs, 1998) Bên cạnh ñó, dựa trên trình tự nucleotide của ñoạn gen mã hóa cho protein H, Lan NT và cs, (2008) ñã chia ra thành 5 type virus lớn ñược phân lập từ những vùng ñịa lý khác nhau: type Châu Âu, cổ ñiển (Classic type), Asia 1, Asia 2 và USA

1.3.2 Hình thái của virus Care

Hình 1.1 Hình thái của virus Care ñược chụp dưới kính hiển vi

(http://www.nature.com/nrmicro/journal/v4/n12/box/nrmicro1550_BX1.html

Hình thái virus quan sát ñược thấy dưới kính hiển vi ñiện tử có hình vòng tròn, hình bán nguyệt do các sợi cuộn quanh tròn mà thành Dạng tròn này có ñường kính ño ñược 115nm ñến 230nm Màng cuộn kép có ñộ dày 75 ñến 85Ao với bề mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy và cs, 1989; Ron Hines, 2006)

1.2.1.3 Cấu trúc của virus Care

Nucleocapside chứa một sợi ñơn RNA không phân ñoạn gồm khoảng 15.690 nucleotide mã hóa thành 1 protein không cấu trúc (C) và 6

protein cấu trúc gồm: large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P), nucleocapsid protein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M) (Diallo, 1990)

Protein không cấu trúc (C) ñược mã hóa từ một khung ñọc mở khác ở gen P (Lamb và Kolakofsky, 2001) Chức năng của protein C chưa ñược xác ñịnh rõ ràng

N: Nucleocapsid, khối lượng phân tử 58 kDa bao quanh và bảo vệ cho

hệ gen của virus, nhạy cảm với những chất phân giải protein

P: Phosphoprotein, khối lượng phân tử 54,9 - 66 kDa, nhạy cảm với những yếu tố phân giải protein, ñóng vai trò quan trọng trong sự sao chép của RNA (Sidhu và cs, 1993)

M: Matrix, khối lượng phân tử 34 - 39 kDa, ñóng vai trò quan trọng trong sự trưởng thành của virus và nối nucleocapsid với những protein vỏ bọc

F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử 59 – 62 kDa, ñóng vai trò trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn ñến kết hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (hợp bào)

H: Protein ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là glycoprotein thứ hai của vỏ bọc, khối lượng phân tử 76 – 80 kDa, ñóng vai trò gắn virus vào tế bào ñích Ở virus Care, protein này không hấp phụ hồng cầu cũng không ngưng kết hồng cầu

L: Large protein có khối lượng phân tử lớn 180 - 200 kDa, do có kích thước lớn, nó sẽ thể hiện phần lớn các hoạt ñộng của RNA polymerase

(Diallo, 1990)

1.2.1.4 Sức ñề kháng của virus Care

Virus Care là một virus không ổn ñịnh và nhạy cảm với nhiệt ñộ, tia

UV, dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và chất ôxy hóa (Grone và cs, 1998) mặc dù nó có vỏ bọc protein chống lại sự vô hoạt của các tác nhân bên ngoài

Năm 1954, Celiker và Gillespie ñã dùng virus sài sốt chó thích nghi trên môi trường phôi trứng ñể nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến tính cảm nhiễm của virus và tác giả ñã nhận thấy: Virus Care cực kỳ mẫn cảm với sức nóng Virus bị phá hủy ở 50 - 600C trong 30 phút Trong mô cô lập nó tồn tại ñược ít nhất một giờ ở 370C và 3 giờ ở 200C (nhiệt ñộ phòng) Thời tiết ấm áp virus không thể tồn tại lâu trong chuồng nuôi chó sau khi chó bị bệnh ñược chuyển ñi nơi khác

Thời gian sống và duy trì ñộc lực của virus sẽ lớn hơn trong ñiều kiện nhiệt ñộ lạnh Ở nhiệt ñộ dưới 00C, nó có thể tồn tại trong môi trường vài ngày nếu ñược bảo vệ bởi các vật liệu hữu cơ (Greene và Appel, 2006) Ở nhiệt ñộ ñóng băng virus ñược ổn ñịnh Virus tồn tại ñược ở nhiệt ñộ -650C

ít nhất là 7 năm Việc bảo quản virus ở dạng ñông khô có ý nghĩa rất lớn trong việc bảo quản giống virus, sản xuất vacxin và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

ðộ pH: virus ổn ñịnh ở pH = 4,5 – 9

Vỏ bọc của virus rất mẫn cảm với ete, cloroform, formalin loãng (<0.5%), phenol (5%), dung dịch amoni Do vậy, khi dùng những chất này ñể tiêu ñộc chuồng và bệnh viện mang lại hiệu quả cao (Greene and Appel, 1987)

1.2.1.5 Cơ chế sinh bệnh

Virus gây bệnh Care là virus gây nhiễm hướng mô lympho, niêm mạc

và mô thần kinh ðầu tiên, virus nhân lên ở mô lympho của hệ hô hấp Sau ñó virus nhiễm vào các dịch bạch huyết rồi vào máu gây bại huyết Virus tác ñộng ñến nội mạc mạch máu và gây sốt, sốt kéo dài từ 1 - 2 ngày Virus theo máu vào hệ hô hấp, hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống thần kinh trung ương cũng như dây thần kinh thị giác Do sự suy yếu của hệ bạch huyết, hệ thống phòng vệ quan trọng của cơ thể ñã làm suy giảm miễn dịch và tạo ñiều kiện

cho các vi khuẩn như: Staphylococcus, Bronchisepticum, Salmonella, gây

bệnh Ít ngày sau, cơn sốt thứ 2 xuất hiện, biểu hiện trầm trọng hơn do các nhiễm trùng nặng trong phủ tạng

Theo (Carter và cs, 1992) trong quá trình phơi nhiễm tự nhiên, CDV lây lan qua ñường khí dung vào biểu mô ñường hô hấp trên Trong vòng 24 giờ

nó sẽ nhân lên trong ñại thực bào và lan rộng ra nhờ hệ lympho cục bộ ñến hạch amidal và các hạch lympho phế quản 2 - 4 ngày sau nhiễm, số lượng virus tăng ở hạch amidal và hạch sau hầu, hạch lympho khí quản Nhưng chỉ

có một số ít tế bào ñơn nhân bị nhiễm CDV Sau 4 - 6 ngày virus nhân lên trong tế bào lympho ở lách, biểu mô dạ dày và ruột non, màng treo ruột và trong tế bào Kuffer ở gan Sự lây lan của virus trong các hệ lympho là nguyên nhân gây pha sốt ñầu tiên và virus ñã phá huỷ các tế bào lympho (lympho B, lympho T) dẫn tới chứng giảm bạch cầu

Ngày thứ 8 và 9 sau khi nhiễm, virus theo máu tới thần kinh trung ương

và phụ thuộc vào miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào Quá trình bài thải ra ngoài bắt ñầu khi virus có mặt ở biểu mô và thông qua chất bài tiết của cơ thể thậm chí ngay cả khi chó chỉ mắc bệnh nhẹ

Ngày thứ 14 sau nhiễm, với chó có hàm lượng kháng thể cao và tế bào T ñộc sẽ giúp loại bỏ virus khỏi các mô và con vật sẽ không có triệu chứng lâm sàng Kháng thể IgG-CDV sẽ trung hoà hết CDV và ức chế lây lan của CDV giữa các tế bào

Với chó có ñáp ứng miễn dịch trung bình thì hàm lượng kháng thể sẽ giảm sau 9 - 14 ngày sau nhiễm, virus sẽ lây lan tới các biểu mô Triệu chứng lâm sàng có thể sẽ bị loại bỏ khi hàm lượng kháng thể tăng nhưng không thể tồn tại lâu dài khi virus xâm nhập vào mô mạch, thần kinh và da như da bàn chân Sự hồi phục sau nhiễm sẽ tạo ra miễn dịch lâu dài và ngăn ngừa sự bài thải virus Khi chó phơi nhiễm lại với virus ñộc lực cao, số

lượng lớn hoặc trong tình trạng stress, có sự dung nạp miễn dịch thì chó có thể bị nhiễm lại

Với chó có sức ựề kháng kém, từ ngày 9 - 14 sau nhiễm, virus sẽ lan tràn trong các mô kể cả da, tuyến nội, ngoại tiết, trong mô dạ dày, ruột, ựường

hô hấp, niệu quản Triệu chứng lâm sàng của bệnh thường nặng và virus tồn tại lâu dài trong các mô tới khi con bệnh chết Trình tự lây lan của virus phụ thuộc vào chủng virus và có thể ngừng lại sau 1 - 2 tuần Nghiên cứu về huyết thanh học cho thấy hàm lượng kháng thể khác nhau gây ra mức ựộ bệnh khác nhau Chỉ có những con chó tạo ra ựược kháng thể kháng vỏ của virus mới có khả năng tránh ựược virus tồn tại ở thần kinh trung ương Hậu quả của nhiễm trùng thần kinh trung ương phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể IgG trong tuần hoàn do kháng nguyên H-glyco tạo nên Nhiễm kế phát vi khuẩn gây các biểu hiện khác nhau ở thần kinh trung ương và gây nên các biến chứng khác ở ựường hô hấp, tiêu hoá

1.2.2 Dịch tễ học

1.2.2.1 Loài vật mắc bệnh

Trong tự nhiên tất cả các giống chó ựều cảm thụ với virus Care, nhưng chó ngoại mẫn cảm hơn chó nội (Trần Thanh Phong, 1996) Virus Care cũng gây bệnh ở ựộng vật hoang dã ăn thịt (Appel và cs, 1994; Frolich và cs, 2000; Martella và cs, 2002) Năm 1987, người ta phát hiện bệnh do virus Care ở hải cẩu (Phocasibirica) ở hồ Baikal Sibero những chủng này lần lượt ựược ựặt tên PDV1 và PDV2 (Phocin Distemper virus) Năm 2006, người ta thấy khỉ nâu Châu Âu bị bệnh Care trong trại ở Quảng đông Trung Quốc Qua phân tắch trình tự axit amin của virus tại thực ựịa cho thấy ựây là chủng virus cường ựộc (Wei Qiu và cs, 2011)

Trong phòng thắ nghiệm, có thể gây bệnh cho chó con và chồn Ngoài

ra, có thể dùng chuột lang, thỏ, chuột nhắt trắng, khỉ ựể gây nhiễm

1 2.2.2 Lứa tuổi mắc bệnh

Trong tự nhiên bệnh hầu hết xảy ra ở chó từ 2 ựến 12 tháng tuổi, tập trung chủ yếu ở chó từ 3 ựến 6 tháng tuổi Việc gây bệnh thử nghiệm ở chó 6 tháng tuổi dễ hơn chó 3 tuần tuổi do chó 3 tuần tuổi có miễn dịch thụ ựộng thu nhận ựược từ mẹ (Hồ đình Chúc và cs, 1993; Simpson và cs, 1994) Người ta cũng ựã ghi nhận virus Care gây viêm não trên chó lớn (Merchant và

cs 1961 Ờ 1969)

1.2.2 3 Mùa vụ mắc bệnh

Tô Du và Xuân Giao (2006), khi nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Care cho rằng tất cả các loài chó ựều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm hơn là loài chó lai, chó cảnh, chó nội ắt mẫn cảm hơn Bệnh xảy ra quanh năm nhưng xuất hiện nhiều khi có sự thay ựổi thời tiết, ựặc biệt là những ngày mưa, ựộ ẩm cao Ở Việt Nam, bệnh thường xảy ra vào thời ựiểm giao mùa, từ xuân sang hè

1.2.3 Truyền nhiễm học

1.2 3.1 Chất chứa virus

Trong cơ thể chó mắc bệnh Care, virus thường có trong máu, phủ tạng, các chất bài tiết, ựặc biệt nước tiểu thường xuyên có virus Các cơ quan tập trung nhiều virus ở chó mắc Care như: não, lách, phổi, hạch, tuỷ xương (Nguyễn Thị Lan và cs 2005)

1.2.2.3 đường xâm nhập và cách thức lây lan

Chó mắc bệnh bài xuất virus qua các chất bài tiết của cơ thể như phân, nước tiểu, nước mũi, các dịch tiếtẦ và khuếch tán vào không khắ trong các giọt nước nhỏ, Virus có thể tồn tại từ 6 - 22 ngày ngoài môi trường Từ ựó, virus dễ dàng xâm nhập vào thức ăn, nước uống Bệnh Care có tắnh chất lây lan rất mạnh, nếu chó khỏe tiếp xúc trực tiếp với chó mắc bệnh, với chất bài tiết chứa virus hay thông qua thức ăn, nước uống có nhiễm mầm bệnh thì dễ mắc bệnh đặc biệt, virus còn có thể xâm nhập vào cơ thể qua da (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1978)

Mặc dù virus ựược bài tiết ra ngoài môi trường qua hầu hết những dịch tiết của cơ thể nhưng bệnh ắt lây lan qua nước tiểu Theo Hồ đình Chúc (1993) dịch tiết ở ựường hô hấp do chó mắc bệnh ho bắn ra có thể gây bệnh cho các con chó khác

Trong phòng thắ nghiệm, có thể ựưa virus vào cơ thể của ựộng vật thử nghiệm theo con ựường tiêm, uống, bôi vào niêm mạc mũi ựều gây ựược bệnh

1.2.3.3 Tỷ lệ ốm, tỷ lệ chết

Thời kỳ ủ bệnh của bệnh Care thường là 3 - 6 ngày và có thể kéo dài khoảng trên dưới 1 tháng Chó phát bệnh thường chết với tỷ lệ chết 50 - 80%, thậm chắ lên ựến 100% nếu không ựiều trị kịp thời (Hồ đình Chúc, 1993) Khi chó mắc các bệnh kế phát như parvovirus, viêm gan truyền nhiễm làm cho tỷ lệ chết càng cao (Vương đức Chất và Lê Thị Tài, 2004; Tô Du và Xuân Giao, 2006)

1.2.4 Triệu chứng, bệnh tắch

1.2.4.1 Triệu chứng lâm sàng

Theo Greene và Appel (1987), biểu hiện của bệnh thường rất ựa dạng phụ thuộc vào tuổi chó mắc bệnh, giống chó, tình trạng sức khoẻ, chế ựộ chăm sóc nuôi dưỡng và ựộc lực của mầm bệnh

Quan sát trên lâm sàng thấy sốt thường xảy ra từ 3 ựến 6 ngày sau khi nhiễm virus Care: xuất hiện các triệu chứng lâm sàng của bệnh Care cấp tắnh thường từ 14 ựến 18 ngày Sau khi chó bị mắc bệnh, một cơn sốt ngắn xảy ra

từ ngày thứ 4 tới ngày thứ 7 nhưng không có triệu chứng rõ rệt của bệnh Care Thân nhiệt của chó trở lại bình thường sau ựó ở ngày 7 ựến ngày 14, sau ựó thân nhiệt lại tăng cao kèm theo viêm kết mạc và viêm mũi Tiếp theo

là các triệu chứng ho, ỉa chảy, nôn mửa, biếng ăn, mất nước và giảm cân với

sự suy nhược thường quan sát thấy ở chó mắc bệnh Care thể cấp tắnh Dịch

mũi và mắt chảy ra có nhử, mủ nhày Viêm phổi thường do bội nhiễm vi khuẩn Da bị phát ban, có thể viêm mủ ở da vùng bụng Triệu chứng viêm não cấp tắnh có thể phát triển với những biểu hiện khác nhau: sự co thắt cơ vân theo nhịp (Myolonus), cơ vân bị vặn không theo ý muốn, thể hiện như dạng nhai kẹo cao su, vận ựộng không ựiều hòa và không phối hợp với nhau Phản ứng sợ hãi và mù là những triệu chứng thường thấy trong bệnh Care thể cấp tắnh Khi xuất hiện triệu chứng thần kinh thời gian ngắn sau thì chết (Summers và cs, 1978)

Theo Nguyễn Văn Thanh (2007), chó mắc bệnh Care ựầu tiên xuất hiện các triệu chứng như: mệt mỏi, ủ rũ, ăn ắt, không thắch vận ựộng, chảy nước mắt, nước mũi, nôn mửa; sau ựó sốt, nhịp thở tăng, thân nhiệt lên ựến

40 Ờ 41,50C kéo dài từ 24 Ờ 26 giờ rồi thân nhiệt giảm xuống 38,5 - 39,50C Lúc này chó ăn ắt, mệt mỏi 3 - 4 ngày sau xuất hiện cơn sốt thứ hai đó là

do sự bội nhiễm của các vi khuẩn kế phát Cơn sốt kéo dài 3 - 4 ngày Lúc này chó bắt ựầu thể hiện các triệu chứng ở ựường hô hấp, tiêu hoá, da và thần kinh

- Triệu chứng ở ựường tiêu hoá:

Do viêm cata ở niêm mạc dạ dày và ruột nên con vật khát sau khi, nôn mửa rồi ỉa chảy, lúc ựầu phân loãng, có bọt sau ựó có lẫn máu, phân có màu

cà phê nhạt Trường hợp nặng phân có thể lẫn máu tươi, niêm mạc ruột bong

ra làm phân có mùi tanh khắm rất khó chịu Chó thường bị viêm niêm mạc miệng và hạch hạnh nhân

Nôn là triệu chứng thường gặp ở chó bị bệnh Care Nôn thường xuất hiện sớm, lúc ựầu nôn ra thức ăn sau ựó nôn khan hoặc nôn ra bọt có màu vàng

- Triệu chứng ựường hô hấp:

Chó bị viêm mũi, thanh quản, phế quản rồi viêm phổi nên chó khó thở, nhịp thở tăng rõ, phổi nghe có âm ran ướt Con vật chảy nhiều nước mũi lúc

ñầu loãng sau ñặc dần, ñôi khi có mủ xanh hoặc máu ñen Chó bị ho, lúc ñầu

ho khan, sau ho ướt, chó thở gấp, thè lưỡi ra ñể thở

Ngoài ra, chó bệnh thường xuyên có viêm mắt, chảy nước mắt Lúc ñầu nước mắt trong, sau ñặc dần như mủ, bị loét, ñục giác mạc

- Triệu chứng trên da:

ðặc trưng là sự xuất hiện các nốt sài ở da bụng, bẹn, ngực, mặt trong ñùi Ở các vị trí da trên nổi những nốt chấm ñỏ, những chấm ñỏ ñó biến thành những nốt sài to bằng hạt gạo, hạt ñỗ xanh, lúc ñầu ñỏ sau bội nhiễm vi khuẩn nên mềm ra, có mủ, khi vỡ làm lông bết lại, hôi hám Các nốt sài có thể vỡ ra hoặc không vỡ ra rồi hình thành vảy Vảy bong ñi, ñể lại một vết thương nông nhanh chóng lành và không hình thành sẹo

Sau khi bị bệnh 10 - 15 ngày, ở 80 - 90% số con bị bệnh, da ở gan bàn chân tăng sinh dày lên, có khi bị nứt ra làm chó ñi khập khiễng

- Triệu chứng thần kinh:

Quá trình tiến triển, con vật có thể thể hiện các triệu chứng thần kinh như ủ rủ, buồn rầu hoặc hung dữ sau ñó là các cơn co giật ñều ñặn ở bắp thịt, mũi, tai, chân hoặc toàn thân, cuối cùng là liệt Con vật loạng choạng, ñứng lên, ngã xuống, ñâm sầm vào tường, sùi bọt mép Cuối cùng chó nằm bệt, loạn nhịp tim, thân nhiệt hạ và chết Tỷ lệ chết có thể tới 60%, bệnh kéo dài 2- 5 tuần Những con lành bệnh thường gầy còm, ñi xiêu vẹo có di chứng

mù và ñiếc…

1.2.4.2 Bệnh tích

Theo Appel và Summer (1995), bệnh tích ñại thể có thể gặp bao gồm sừng hoá ở mõm và gan bàn chân Tuỳ theo mức ñộ kế phát các vi khuẩn có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột, mụn mủ ở da,

Bệnh tích ñường tiêu hóa: viêm cata ruột, loét niêm mạc ruột, hạch ruột sưng, gan thoái hóa mỡ

Ở ñường hô hấp: viêm mũi, thanh quản, khí quản, viêm phổi, có mụn

mủ trong phổi, có khi vỡ ra gây viêm phế mạc

Ở hệ thần kinh: viêm não, não tụ máu, các tế bào thần kinh bị hoại tử Trong nguyên sinh chất tế bào thượng bì ñường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến nước bọt có thể tìm thấy tiểu thể lenst trong nguyên sinh chất

Theo Carter và cs, (1992), trong bào thai hoặc sơ sinh bị nhiễm CDV thường bị teo tuyến ức, viêm phổi hoặc viêm ruột thể cata Ở những con chó sau khi sinh xuất hiện triệu chứng toàn thân Tổn thương ñường hô hấp trên , viêm mũi, viêm nhánh khí phế quản, sừng hoá mũi, bàn chân, viêm kết mạc mắt và có triệu chứng thần kinh Tổn thương nhẹ trung khu thần kinh, hiếm gặp xung huyết màng não, trong buồng não và tăng áp lực hệ thần kinh trung ương do phù não

Suy giảm lympho là bệnh tích ñiển hình ở chó có triệu chứng toàn thân Viêm kẽ phổi lan toả ñặc trưng là sự dày lên của vách phế nang và sự tăng sinh của biểu mô vách phế nang Biểu mô ñường tiết niệu sưng phồng lên Chó con mắc bệnh sẽ bị hỏng men răng, hoại tử và thoái hoá tế bào tạo men răng

Viêm tinh hoàn thường thấy ở chó mắc bệnh Care ðiều này có thể giải thích ñược sự giảm sinh tinh trùng, giảm chất tiết của tiền liệt tuyến sau khi hồi phục ở chó ñực

Chó sơ sinh mắc bệnh có bệnh tích viêm não cấp tính, thoái hoá tế bào thần kinh và phá huỷ myelin Những con sống sót, các vùng ñốm hoại tử thay vào bởi các tế bào sao phì ñại, nơi tạo thành mạch lưới do ñại thực bào hấp thu myelin Biến ñổi trầm trọng nhất là chất trắng ở thần kinh trung ương,

biến ñổi có thể tìm thấy trên cuống tiểu não sau, từ sừng lưng của tủy sống ñến buồng não IV Tổn thương cũng thấy ở não giữa và thuỳ thái dương của ñại não Các vùng trên bề mặt như bó thị giác, gấp nếp vỏ não, các nhánh thần kinh bề mặt não, cũng bị ảnh hưởng

Ở một số chó, chủ yếu gây ảnh hưởng ở ñại não và ñồi thị Trường hợp nặng có thể làm huỷ myelin tạo các không bào xốp ở chất trắng, viêm phản ứng tế bào thần kinh ñệm Thể vùi trong bào tương và trong nhân chủ yếu tìm thấy ở tế bào sao và tế bào thần kinh

Chó ñược miễn dịch sẽ phát triển thành viêm não và giảm bạch cầu Những tổn thương này thường kết hợp với các triệu chứng mất thăng bằng và rối loạn tiền ñình Tổn thương này ñược ñặc trưng bởi sự lan rộng của những ñám cặn lympho bào xung quanh vùng myelin bị hủy và thần kinh bị thoái hoá Chúng có thể lan rộng và trầm trọng hơn ở trường hợp viêm não cấp tính Trường hợp mạn tính, tổn thương có thể phát triển thành xơ cứng trong não ñặc trưng bởi sự lắng cặn và thay thế của các mô thần kinh bởi các mạng lưới các tế bào sao dày ñặc

Ngược lại, tổn thương do tiêm vacxin ñược ñặc trưng bởi sự viêm não dẫn tới hoại tử não với vùng ưu tiên là sừng bụng Thể vùi có thể tìm thấy trong nhân hoặc bào tương tế bào sao và tế bào thần kinh

Kiểm tra tổ chức học, thể vùi CDV thường thấy nhất trong bào tương

và nhuộm màu axit, có ñường kính 1 - 5µm, và tìm thấy ở tế bào biểu mô trong lớp chính thức màng nhầy, tế bào mắt, bạch cầu, tế bào thần kinh ñệm

và tế bào thần kinh chính thức Thể vùi tìm thấy sau khi mắc bệnh 5 - 6 tuần trong hệ lympho và ñường tiết niệu Thể vùi trong nhân phân bố nhiều nhất ở biểu mô tuyến

Hình thái thể vùi vẫn chưa ñược biết rõ Hoá tổ chức cho thấy thể vùi ñược tạo ra từ sự kết hợp giữa vỏ nucleocapsid của virus và cặn của các tế

bào là kết quả sự nhiễm virus Ta không thể khẳng ựịnh hoàn toàn là có bệnh Care khi chỉ có sự xuất hiện của thể vùi Thể vùi ựặc trưng trong bào tương khi nhiễm CDV cũng xác ựịnh ựược ở bàng quang chó bình thường đáng tiếc thể vùi không chỉ không ựặc trưng mà còn có thể xuất hiện muộn trong bệnh

Sự hình thành tế bào khổng lồ ựầu tiên trong chất trắng của thần kinh trung ương và tiếp ựó là hạch lympho, phổi, lớp màng não mỏng là ựiểm riêng biệt của virus Care Những phát hiện bệnh lý này có thể sử dụng ựể chẩn ựoán chắnh xác sự nhiễm CDV (Greene và Appel, 1987)

1.2.5 Chẩn ựoán bệnh

1.2.5.1 Dựa vào ựặc ựiểm dịch tễ học của bệnh

Bệnh chủ yếu xảy ra ở chó 2 ựến 12 tháng tuổi, ở thời ựiểm giao mùa, thời tiết thay ựổi ựột ngột, ựộ ẩm cao hoặc lạnh

1.2.5.2Dựa vào triệu chứng lâm sàng

Chẩn ựoán bệnh Care thể cấp tắnh và á cấp tắnh có thể dựa vào bệnh sử

và triệu chứng lâm sàng Khi có những triệu chứng lâm sàng ựặc trưng của bệnh thì có thể nghi ngờ chó mắc bệnh Care Ở những chó chưa tiêm phòng hoặc chó trưởng thành không ựược tiêm phòng ựầy ựủ có biểu hiện sốt, hô hấp như chảy nước mũi, ho, có dử mắt , triệu chứng tiêu hóa hoặc triệu chứng thần kinh khả năng chó mắc phải bệnh Care là rất cao (Hồ đình Chúc, 1993)

Chẩn ựoán bệnh dựa vào triệu chứng lâm sàng cần phân biệt với những bệnh sau:

Bệnh viêm gan truyền nhiễm: Bụng chướng to, sờ nắn vùng gan thấy con vật rất ựau ựớn Giác mạc ựục hơn, có thể như Ộcùi nhãnỢ

Bệnh do Parvovirus: Gây viêm dạ dày, ruột xuất huyết do hoại tử tế bào thượng bì nhung mao ruột, thường ỉa chảy phân loãng như nước và có máu tươi, con vật chết rất nhanh, không có triệu chứng thần kinh

Bệnh do Leptospira: Viêm dạ dày, ruột chảy máu, viêm loét niêm mạc miệng và thường xuất hiện ở chó lớn, vàng da, niêm mạc, số lượng bạch cầu tăng

1.2.5.3 Chẩn đốn trong phịng thí nghiệm

Tiêm truyền bệnh phẩm cho động vật thí nghiệm:

Mẫu bệnh phẩm là máu, lách, gan, phổi, các chất bài tiết và dịch nước mũi, nước mắt của chĩ nghi mắc bệnh đem nghiền, chế thành huyễn dịch và tiêm cho động vật thí nghiệm Tốt nhất sử dụng chồn hoặc chĩ non, ngồi ra

cĩ thể tiêm cho chuột lang, chuột nhắt trắng, thỏ

Quan sát tiến triển của bệnh gây ra trên động vật thí nghiệm, mổ khám bệnh tích đại thể và kết luận

Từ bệnh phẩm cĩ thể phân lập được một số vi khuẩn kế phát như

Pasteurella, Bacillus Bronchisepticus, Staphylococcus, E coli và Salmonella

Nuơi cấy, phân lập virus trên mơi trường tế bào:

Mẫu bệnh phẩm đem nghiền thành huyễn dịch, xử lý kháng sinh, ly tâm lấy nước trong và lọc qua màng lọc vi khuẩn rồi đem gây nhiễm lên mơi trường

tế bào một lớp thích hợp Virus Care chỉ cĩ thể nhân lên và gây bệnh tích tế bào

(Cyto pathogenic Effect - CPE) khi gây nhiễm lên tế bào phù hợp Bệnh tích tế

bào do CDV gây ra cĩ thể quan sát được là những thể hợp bào, tế bào bị phá hủy màng và xuất hiện nhiều thể vùi ở trung tâm vùng tế bào xuất hiện CPE

Sự xuất hiện nhiều hay ít, nhanh hay chậm của CPE phụ thuộc vào số lượng, độc lực của virus và “tuổi” tế bào Tế bào mới nuơi cấy thì virus gây nhiễm dễ dàng hơn, CPE xuất hiện nhanh và nhiều hơn ở những tế bào đã nuơi cấy nhiều ngày (Lan và cs, 2005)

- Chẩn đốn bằng phản ứng miễn dịch đánh dấu enzym (ELISA)

ELISA(Enzim linked Immuno Sorbent Assay) là một phương pháp xét

nghiệm miễn dịch dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, cĩ sử dụng kháng thể cĩ gắn enzyme và chất phát quang nhằm phát hiện

ra sự kết hợp đĩ (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2009)

- Chẩn đốn bằng phương pháp nhuộm hĩa mơ miễn dịch

Nhuộm hĩa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) là phương pháp cĩ độ chính xác cao cho phép phát hiện kháng nguyên tồn tại trong tổ chức Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu và được phát hiện bằng chất chỉ thị màu (Nguyễn Hữu Nam, 2011)

- Chẩn đốn bệnh bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang IF (Immuno fluorescent test) cĩ độ chính xác cao, dùng chất đánh dấu là chất phát huỳnh quang (khi hấp thụ 1 ánh sáng cĩ bước sĩng nhất định sẽ phát ra 1 ánh sáng cĩ bước sĩng dài hơn) Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên lý: khi dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể đã được nhuộm bằng chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp với kháng nguyên – kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang

sẽ phát sáng (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010)

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp:

Trong phản ứng này thường dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên chưa biết

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp:

Dùng kháng kháng thể được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên chưa biết

- Chẩn đốn phát hiện bệnh Care bằng kit chẩn đốn nhanh

Hiện nay, nhiều phịng khám thú y sử dụng phương pháp xét nghiệm nhanh bằng thiết bị thiết kế sẵn, đơn giản, tiện dụng và cĩ độ chính xác cao

Về bản chất, đây là phương pháp xét nghiệm ELISA để phát hiện

kháng nguyên của virus Care trong máu, dịch kết mạc mắt và nước mũi của chĩ Hai kháng thể đơn dịng trong thiết bị sẽ kết hợp đặc hiệu với các nhĩm quyết định kháng nguyên khác nhau của virus Care Sau khi cho bệnh phẩm vào vị trí đệm Cellulose của thiết bị, virus Care sẽ kết hợp với kháng thể đơn dịng thứ nhất Rồi phức hợp này kết hợp với kháng thể đơn dịng khác trong màng nitơ - cellulose của thiết bị để tạo thành hợp chất kép hồn chỉnh Kết quả xét nghiệm được biểu hiện qua các vạch do thiết bị sử dụng theo phép

MỘT SỐ HÌNH ẢNH KIT CHẨN ðỐN BỆNH CARE

Hình 1.2 Kit chẩn đốn nhanh bệnh Care Hình 1 3 Tets chĩ nghi mắc bệnh care

Hình 1.4 Kết quả âm tính với bệnh Care (1

Những chó ốm phải nuôi cách ly, chuồng chó ốm phải tiêu ñộc bằng thuốc sát trùng, xử lý chất bài tiết và thức ăn nước uống thừa của chó bệnh Chó mới mua về phải kiểm tra kỹ hồ sơ, nuôi cách ly, theo dõi ít nhất

10 ngày, nếu không thấy có biểu hiện của bệnh mới cho nhập ñàn

- Phòng bệnh bằng tiêm phòng vacxin

Tiêm vacxin là biện pháp phòng bệnh dễ dàng và có hiệu quả nhất ñối với các bệnh do virus gây ra nói chung, trong ñó có bệnh Care Vacxin phòng bệnh Care ñược tiêm lần ñầu cho chó lúc 2 tháng tuổi, trong những trường hợp chó có nguy cơ lây nhiễm cao thì có thể tiêm phòng sớm hơn Tiêm nhắc lại sau mũi ñầu tiên 2 ñến 3 tuần Sau ñó, tiêm nhắc lại mỗi năm một lần ñể ñảm bảo khả năng bảo hộ

1.2.6.2 ðiều trị

Dùng kháng huyết thanh: liều 15-30 ml/con, tiêm sớm Khi con vật ñã

có triệu chứng viêm phổi hay triệu chứng thần kinh thì kháng huyết thanh không có hiệu lực

Ở các cơ sở ñiều trị theo các bước sau ñây:

1 Cắt nôn bằng cách tiêm atropin hay primeran 2ml, tiêm dưới da

2 Bổ sung nước và chất ñiện giải bằng cách cho uống Ozesol 5%, tiếp nước muối sinh lý 0,9% hay nước ñường Glucoza 5% vào tĩnh mạch của chó

3 Cầm ỉa chảy bằng cách cho uống thuốc ñặc trị tiêu chảy chó mèo (ADP), Imodium hay Bisepton, Hampiseptol ngày uống 1 lần

4 Chống bội nhiễm bằng cách tiêm các loại kháng sinh như: Gentamycin, Streptomycin + Penicillin G 5000

5 An thần cho chó: dùng các loại thuốc Seduxen, Meprobamat, Novocain, Analgin

6 Trợ sức, trợ lực cho chó: Sử dụng các thuốc trợ tim mạch, trợ sức, trợ lực, cầm máu cho chó như: Caphein, Spartein; Vitamin B1; Vitamin B12, Vitamin K; Vitamin C

1.3 Phản ứng RT-PCR

1.3.1 Nguyên lý của phản ứng RT-PCR

ðây là phương pháp In vitro sử dụng cặp mồi ñể tổng hợp một số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA ñặc biệt dựa trên hoạt ñộng của enzym polymerase

Phương pháp PCR dựa trên hoạt ñộng của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA từ khuôn mẫu Tất cả các DNA polymerase ñều cần những mồi là những ñoạn ngắn có khả năng bắt cặp với một ñầu của mạch khuôn ðoạn mồi này sau ñó ñược kéo dài ra là nhờ hoạt ñộng của enzym DNA polymerase ñể hoàn thành một mạch mới hoàn chỉnh

Phương pháp RT-PCR là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược

và phương pháp PCR Phương pháp này có thể phát hiện các RNA tồn tại với lượng rất thấp mà không thể phát hiện bằng phương pháp khác

Do Taq polymerase sử dụng trong bước PCR không hoạt ñộng trên RNA nên trước hết cần chuyển RNA thành cDNA, nhờ enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase (RT), sau ñó cDNA này sẽ ñược khuếch ñại nhờ Taq polymerase Dấu hiệu xác ñịnh bệnh là sản phẩm nhân bản một ñoạn gene ñặc hiệu của virus Sự hiện diện của sản phẩm ñược nhận biết qua ñiện

di trên gel agarose

Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ ñược lặp ñi lặp lại mỗi chu

kỳ gồm 3 bước:

Bước 1: Phân tử DNA ñược biến tính (Denaturation) ở 94 - 95◦C trong khoảng thời gian từ 30 giây ñến 1 phút (thời gian cho bước này dài hay ngắn phụ thuộc vào cấu trúc và chiều dài ñoạn DNA khuôn, máy chu kỳ nhiệt ống tube sử dụng và thể tích cuối cùng của phản ứng, trong quá trình biến tính DNA sợi kép ñược tháo xoắn thành 2 ñoạn DNA mạch ñơn

Bước 2: Giai ñoạn này là giai ñoạn cho phép mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn hay còn gọi là giai ñoạn lai Nhiệt ñộ ñể mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn thường từ 40 – 70◦C (nhiệt ñộ này tuỳ thuộc vào từng mồi

khác nhau) và giai ñoạn này kéo dài từ 30 giây ñến 1 phút tuỳ thuộc vào những mồi và DNA sợi khuôn tương ứng

Bước 3: Giai ñoạn tổng hợp nên ñoạn DNA mới Ở giai ñoạn này nhiệt

ñộ ñược nâng lên 72◦C ñây là nhiệt ñộ thích hợp nhất cho DNA polymerase hoạt ñộng ñể tổng hợp nên sợi DNA mới trên cơ sở mồi ñã ñược bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn Thời gian cho bước này có thể kéo dài từ 30 giây cho tới nhiều phút tuỳ thuộc vào ñộ dài của trình tự DNA cần khuyếch ñại

1.3.2 Các bước tiến hành phản ứng PCR

PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm tương ñối dễ làm Vật liệu ñầu tiên cho phản ứng PCR là DNA có chứa ñoạn gene cần nhân lên (lượng DNA sợi khuôn cho phản ứng PCR không nhiều, khoảng 50 – 100 ng DNA); cần có các ñoạn mồi gắn (mồi xuôi và mồi ngược) ñặc hiệu cho ñoạn gene cần nhân lên; cần có DNA polymerase; nguyên liệu tổng hợp cho sợi mới là các dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP); ion Mg2+, một dung dịch ñệm thích hợp cho phản ứng PCR các thành phần trên ñược hỗn hợp với nhau theo những tỷ lệ nhất ñịnh về nồng ñộ và thường thể tích cuối cùng cho 1 phản ứng PCR là 25µl hoặc 50 µl