xây dựng quy trình phát hiện clostridium perfringens trong thực phẩm bằng kĩ thuật pcr (polymerase chain reaction) và thử nghiệm ứng dụng

Với sự phát triển nhanh chóng của các kĩ thuật sinh học phân tử nhiều phương pháp phát hiện nhanh vi sinh vật trong thực phẩm đã được thiết lập.. Các phương pháp phân tích mới đều có xu

L ỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và chân thành, tôi xin cảm ơn:

Quý Thầy, Cô Khoa Sinh Trường Đại Học Sư Phạm Tp Hồ Chí Minh đã cung

cấp cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt khóa học

Thầy PGS.TS Trần Linh Thước và ThS Nguyễn Tiến Dũng đã luôn tận tâm hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt luận văn này

Thầy Long, các bạn Huệ, Na, Phượng, Ánh, Thanh, Loan của Trung tâm Khoa

học và Công nghệ Sinh học, Phòng Thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học Khoa học tự nhiên Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt thời gian

thực nghiệm

Nhân đây tôi cũng xin chân thành cảm ơn sở Giáo dục và Đào tạo Tp Hồ Chí Minh, Ban Giám Hiệu Trường Trung học phổ thông Trần Phú đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt khóa học này

Thành phố Hồ Chí Minh tháng - 2005

Nguyễn Thị Ngọc Yến

B ẢNG CHỮ VIẾT TẮT

AOAC : Association of Official Analytical Chemist (Hiệp Hội các nhà hóa học phân tích nhà nước)

Bp : base pair (cặp base)

CFU : Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

KDa : Kilo Dalton (1.000 da)

DNA : Deoxyribonucleic acid

dNTP : 2'- Deoxynucleoside - 5'- triphosphate (nucleotide dùng để tổng

TAE : Tris acetic acid - Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)

M Ở ĐẦU

Trong nền kinh tế xã hội phát triển như hiện nay, đời sống vật chất và tinh thần

của người dân được nâng cao Điều này kéo theo các yêu cầu về chất lượng và vệ sinh

thực phẩm cũng khắt khe hơn Người tiêu dùng không chỉ đòi hỏi cao về chất lượng dinh dưỡng, cảm quan của thực phẩm mà còn về mức độ an toàn vệ sinh của thực

phẩm đó Tuy nhiên, thực tế cho thấy tình trạng ngộ độc thực phẩm trong những năm

gần đây lại xảy ra khá nhiều, chủ yếu là các vụ ngộ độc tập thể ở các công ty, xí nghiệp, trường học, khu chế xuất., gây không ít hoang mang đối với người tiêu dùng Trong số các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm, vi sinh vật thường chiếm tỉ lệ gây

ngộ độc cao nên việc kiểm nghiệm chúng trong thực phẩm rất được quan tâm Vì vậy,

vấn đề cấp bách hiện nay là cần phải có các phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm

hữu hiệu hơn nhằm ngăn ngừa tình trạng ngộ độc hoặc có thể giảm các ca ngộ độc đến

mức thấp nhất Ngoài ra cũng cần có các phương pháp xét nghiệm tìm nguyên nhân gây ngộ độc để có biện pháp điều trị kịp thời

Để đáp ứng các nhu cầu trên, nhiều phương pháp kiểm nghiệm nhanh có thể tự động hóa đang từng bước được phát triển và phổ biến rộng như: phương pháp phân tích miễn dịch (ELISA, IMS ), phương pháp PCR, phương pháp sử dụng mẫu dò, phương pháp phát hiện dựa ữên kĩ thuật phát quang sinh học [4] Góp phần vào việc nghiên cứu các quá trình phát hiện nhanh mầm bệnh vi sinh có trong thực phẩm, Trung tâm Khoa học và Công nghệ cùng với Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh đã

tiến hành các quy trình khảo sát phát hiện E coli, Salonella, Vibrio, Staphylococcus aureuSy Shigella trong thực phẩm Hiện nay, chúng tôi tiếp tục hướng nghiên cứu này trong việc khảo sát quy trình phát hiện Clostridium perfringens gây bệnh trong thực

phẩm bằng phương pháp PCR

Ngộ độc thực phẩm do C perfringens gây ra tuy không nguy hiểm như ngộ độc

thịt nhưng lại xảy ra khá phổ biến, đặc biệt tại những nước phát triển như Mỹ, Phần Lan Tại Mỹ, C perfringens là tác nhân thường xuyên gây ngộ độc thực phẩm và được xếp vào hàng thứ ba sau Salmonella spp và Staphylococcus aureus Tại Phần

Lan, số vụ ngộ độc do C perfringens gây ra chiếm 20% trong tổng số ca ngộ độc

thống kê từ năm 1975 đến năm 1999 [12]

Các trường hợp ngộ độc do C perfringens gây ra phần lớn có liên quan đến các

loại đồ hộp, là những sản phẩm tạo điều kiện kị khí và là môi trường thuận lợi cho vi khuẩn này phát triển và sinh độc tố Vì vậy, trong các chỉ tiêu vi sinh đối với thực

phẩm đóng chai, đóng hộp đều không cho phép sự hiện diện của loại vi khuẩn này

Từ trước đến nay, ở nước ta việc phát hiện C perfringens trong thực phẩm vẫn

thường dựa trên các phương pháp nuôi cấy vi sinh, sinh hóa truyền thống Các phương pháp này tuy có độ ổn định cao nhưng hạn chế về mặt thời gian, tốn công lao động nên có thể làm tăng chi phí sản xuất, tồn đọng hàng hóa Do những hạn chế đó, việc phát hiện nhanh, nhạy và chính xác vi khuẩn này trong thực phẩm là hết sức cần thiết

và quan trọng

Với sự phát triển nhanh chóng của các kĩ thuật sinh học phân tử nhiều phương pháp phát hiện nhanh vi sinh vật trong thực phẩm đã được thiết lập Các phương pháp phân tích mới đều có xu hướng rút ngắn thời gian phân tích, tăng độ nhạy, độ đặc

hiệu, giảm bớt công lao động, có thể thay thế phương pháp truyền thống trong việc phát hiện và đánh giá mức độ an toàn vi sinh của thực phẩm Tuy nhiên, những phương pháp mới này vẫn còn một số nhược điểiĩí nhất định, chưa đạt được tất cả các yêu cầu trên, vì thế chúng chưa đưf c phổ biến rộng rãi Trong đó, phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được xem là phương pháp có nhiều ưu điểm nhất Có rất nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước đã và đang cố gắng thiết lập và hoàn thiệa qui trình phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng kĩ thuật PGR, nhưtig cho đến nay những phương pháp này vẫn chưa được ứng dụng lịộng rãi và chưa được xem

như phương pháp chính thức sử dụng để xét Nghiệm C perfringens trong hệ thống

phân tích đo lường Để một phương pháp mới trở thành có giá trị và được sử dụng

rộng rãi thì phương pháp nậy cần được xác nhận hiệu lực

Do đó, mục tiêu của đề tài luận văn này là thiết lập qui trình phát hiện C perfringens trong thực phẩm bằng kĩ thuật PCR nhằm khắc phục hạn chế của phương pháp tỊruyền thống đồng thời xác nhận hiệu lực sơ bộ phương pháp này tạo cơ sộ cho bước xác nhận hiệu lực thứ cấp để đưa phương pháp này trở thành phương pháp chính

thức cho việc xét nghiệm C perfringens trong thực phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.NG Ộ ĐỘC THỰC PHẨM

Ngộ độc thực phẩm là khái niệm chung để chỉ các triệu chứng gây ra do sử dụng

thực phẩm bị nhiễm khuẩn, virut, chất độc từ môi trường hoặc chất độc tự nhiên có trong bản thân thực phẩm [15]

Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra ở nhiều người, gây ra những triệu chứng

giống nhau sau khi tiêu thụ thực phẩm Tuy nhiên, mức độ tác động sẽ khác nhau tùy thuộc vào khả năng đáp ứng với độc tố và thể trạng khác nhau của từng người Các triệu chứng thường gặp của ngộ độc thực phẩm là tiêu chảy, chóng mặt, nôn mửa, đau

nhức người, sốt và đau đầu Những triệu chứng này có thể thay đổi tùy vào tác nhân gây ngộ độc là tế bào hay độc tố của vi khuẩn [4]

1.2.KHÁI QUÁT V Ề GIỐNG CLOSTRIDIUM

1.2.1.Đặc điểm chung [4], [20]

Giống Clostridium là các vi khuẩn Gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử,

phân bố khắp mọi nơi trong tự nhiên như đất, rác, thực vật, trong đường ruột của người và động vật Các vi khuẩn này là loài kị khí không bắt buộc, không có

superoxide dismutase, peroxidase và catalase Clostridium là các tác nhân gây ngộ độc

thực phẩm nguy hiểm ở người Hai loài liên quan đến ngộ độc thực phẩm là

Clostridium perfringens nhóm A, là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm thường xuyên

hơn loài C botulinum, là loài ít gây ra những vụ ngộ độc nhưng hậu quả nghiêm trọng

hơn [10]

Các chủng Clostridium đều có khả năng thủy giải saccharide và protein trong các

hoạt động thu lấy năng lượng Những chủng có khả năng thủy giải saccharide có khả năng lên men các loại đường tạo axit hữu cơ và rượu Chủng có khả năng phân giải protein sẽ chuyển hóa không hoàn toàn các axit amin tạo ra mùi khố chịu

Clostridium thường được phân loại dựa vào hình dạng tế bào, vị trí bào tử và các đặc điểm sinh lí như:

- Tế bào có dạng hình que thẳng hay hơi cong với hai đầu tròn, thon hay tù

- Bào tử hình bầu dục, hình tròn, nằm ở giữa, cuối hay gần cuối tế bào

- Chủng Clostridium thuộc nhóm ưa lạnh, ưa nhiệt vừa hoặc ưa nhiệt

tăng trưởng, vi khuẩn tạo và tiết ra độc tố gây độc cho người Ví dụ, C botulinum gây

ngộ độc thịt, C perfringens gây hoại thư sinh hơi và nhiễm độc thực phẩm

Hiện nay, Clostridium là nhóm vi khuẩn kị khí gây bệnh được nghiên cứu nhiều

nhất Trong hầu hết các trường hợp, Clostridium đều là tác nhân gây bệnh cơ hội,

chúng thường gây bệnh khi đã có các vi khuẩn khác xâm nhiễm mở đường

1.3.ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

1.3.1.L ịch sử phát hiện [2], [10]

Vào cuối những năm 1890, hai nhà khoa học F.w Andrewes và E Klein đã phát

hiện ra vi khuẩn Clostridium welchii (hiện nay được gọi là Clostridium perfringens)

trong thức ăn gây đau bụng và tiêu chảy nhẹ cho người

Năm 1892 người ta phát hiện C perfringens gây bệnh hoại thư sinh hơi, viêm

ruột và sốt hậu sản

Năm 1933 nghiên cứu của Hobbs cho rằng ăn thực phẩm nhiễm C perfringens

có thể dẫn đến ngộ độc thực phẩm

Năm 1948 có nhiều trường hợp tử vong do viêm ruột và dạ dày xảy ra ở Đức có

liên quan đến C perfringens nhóm C

Cuối những năm 1960 và 1970 đã có đầy đủ thông tin để nhận định về ngộ độc

C Perfringens

1.3.2.Đặc điểm sinh học

1.3.2.1.Hình thái sinh tí t ế bào [l1] [2]

C perfringens là trực khuẩn Gram (+), có vỏ, sinh bào tử, không có tiên mao, kích thước khoảng 0,8 – 1x4 - 8µm (Hình 1)

C perfringens thuộc loại vi khuẩn ôn nhiệt có nhiệt độ phát triển tối ưu là 37 - 45°c Ở nhiệt độ 45°c thời gian thế hệ (thời gian nhân đôi) là 7 - 9 phút Do đó, C perfringens được xem là vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất trong các loài vi sinh vật Tuy nhiên, chúng không thể tăng trưởng trong môi trường có nồng độ muối NaCl từ 6 - 8% hoặc nhiệt độ nuôi cấy thấp hơn 12°C

1.3.2.2.Đặc điểm nuôi cấy [1]

C perfringens là loài vi khuẩn kị khí nhưng không đòi hỏi điều kiện kị khí nghiêm ngặt như các loài Clostridium khác Vì vậy, một số chủng C perfringens vẫn

có khả năng phát triển trong môi trường có ít ôxi Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37°C,

1.3.2.3.Đặc điểm sinh hóa [8], [9]

C perfringens có khả năng lên men các loại đường như glucose, lactose, saccharose, làm đông tụ sữa, làm tan gelatin do chúng sản sinh enzym gelatinase, tinh

bột và glycogen Trong quá trình tăng trưởng trực khuẩn sinh khí H2S và các khí có

mùi hôi khác Ngoài ra, C perfringens còn có khả năng khử nitrate thành nitrite

1.3.2.4.Phân lo ại [10], [16]

C perfringens có khả năng tiết ra khoảng 20 loại độc tố, trong đó có 4 độc tố chính là alpha, beta, epsilon, iota Dựa vào các loại độc tố chính được tạo ra, người ta

xếp C perfringens thành 5 nhóm là C Perfringens nhóm A, B, c, D và E (Bảngl) Trong đó, C perfringens nhóm A hiện diện phổ biến nhất trong môi trường và là tác

nhân chính gây ra ngộ độc thực phẩm C perfringens nhóm C gây hoại tử ruột non

Ngộ độc thực phẩm do C perfringens nhóm C gây ra rất độc nhưng hiếm xảy ra Ở

một số chủng C perfringens, gen tạo độc tố nằm trên nhiễm sắc thể, một số chủng

khác gen này lại nằm trên plasmid của vi khuẩn Gen plc tạo độc tố alpha

phospholipase c ở cả 5 nhóm C perfringens đều nằm trên nhiễm sắc thể có trình tự

ATAGATACTCCATATCATCCTGCTAATGTTACTGCCGTTGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGAAACTTTTGCAGAGGAAAGAAAAGAACAGTATAAAATAAACACAGCAGGTTGCAAAACTAATGAGGATTTTTATGCTGATATGTTAAAAAACAAAGATTTTAATGCATGGTCAAAAGAATATGCAAGAGGTTTTGCTAAAACTAGGGAAATCAATATACTATAGTCATGCTAGCAT Gen này mã hóa cho một protein có 398 axit amin

Gen mã hóa độc tố đường ruột (enterotoxin) của C perfringens có thể nằm ữên

nhiễm sắc thể hay trên plasmid Ở các chủng C perfringens gây ngộ độc thực phẩm

cho người thì gen tạo độc tố đường ruột nằm trên nhiễm sắc thể, trong khi đó ở các

chủng C perfringens gây bệnh ở động vật thì gen này lại nằm trên plasmid Độc tố

đường ruột là một protein có 391 axit amin và được hình thành trong quá trình tạo bào

tử của vi khuẩn

1.4.NG Ộ ĐỘC THỰC PHẨM DO C PERERINGENS

C perfringens còn có biệt danh là "vi khuẩn quán ăn" vì hầu hết các vụ ngộ độc

do vi khuẩn này gây ra thường liên quan đến thức ăn hàng quán, căn tin đã được chế

biến trước đó hàng giờ và không được bảo quản đúng cách Vi khuẩn C perfringens

có thể tồn tại dưới dạng tế bào sinh dưỡng hay bào tử Khi thức ăn được đun chín, các

tế bào sinh dưỡng có thể chết đi nhưng bào tử của chúng vẫn còn sống sót Khi nhiệt

độ trở nên thuận lợi, bào tử nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng tăng trưởng và tạo ra độc tố gây ngộ độc

Các trường hợp ngộ độc thực phẩm xảy ra đều do c perýringens nhóm A, một

vài trường hợp đo C perfringens nhóm c gây ra Ngộ độc thực phẩm do C perfringens nhóm A được gây ra bởi độc tố đường ruột mà vi khuẩn này tiết ra trong quá dinh hình thành bào tử ở màng ruột

Bào tử của c perfringens có thể nhiễm vào thịt tươi, rau sống Việc đun nấu thức

ăn bình thường không diệt được bào tử của vi khuẩn Khi thức ăn này được để nguội

một thời gian đủ dài trong điều kiện không được bảo quản lạnh, bào tử của vi khuẩn

bắt đầu tăng trưởng Nếu thức ăn không được đun nóng lại trước khi ăn thì các tế bào

sinh dưỡng của C perfringens sẽ theo thực phẩm vào ruột non, tạo độc tố và gây ngộ

độc

Các triệu chứng do C perfringens nhóm A gây ra thường là tiêu chảy, đau thắt

vùng bụng trong vòng 8-24 giờ sau khi ăn phải thực phẩm bị nhiễm khuẩn ít có trường hợp bị sốt, buồn nôn hay ói mửa Bệnh thường chấm dứt sau 2-3 ngày và không gây tử vong

C perfringens nhóm c gây ra triệu chứng của bênh ở một non như! nôn mửa, đau bụng và tiêu chảy ra máu Khi mật độ vi khuẩn lên đến l0P

6

P

tế bào/g thực phẩm,

bệnh thường dẫn đến tử vong do hậu quả của triệu chứng viêm ruột và nhiễm trùng

máu Độc tố đường ruột của C perfringens được hoạt hóa nhanh trong ruột gây ra

hiện tượng hoại thư sinh hơi gây mất nước trong ruột non Độc tố tác động lên tế bào

biểu mô gây đau bụng cấp tính và nôn mửa trong 8-16 giờ

Độc tố đường ruột của C perfringens (CPE - C perfringens enterotoxin) rít

nhạy với nhiệt độ và pH nên dễ bị phân hủy ở nhiệt độ 60°C trong vòng 5 phút hay bị

mất hoạt tính do pH thấp ở dạ dày Tuy nhiên, độc tố này lại được tạo ra nhanh chóng

ồ ruột non nhờ môi trường pH thuận lợi Độc tố đường ruột được vi khuẩn C perfringens tiết ra sau khi bào tử được hình thành 10-12 giờ

Về mặt cấu trúc phân tử, CPE là một polypeptid mạch đơn có trọng lượng phân

tử gần bằng 3,5kDa, bao gồm 319 axit amin có điểm đẳng điện là 4,3 Độc tố được chia làm 3 vùng (Hình 2):

- Đầu C: có nhiệm vụ gắn kết vào các thụ thể trên màng tế bào

- Vùng giữa: mang độc tính

- Đầu N: vẫn chưa rõ hoạt tính

Sau khi được tạo ra ở ruột non, đầu C của độc tố sẽ gắn vào các thụ thể protein trên màng tế bào ruột và tạo thành một phức hợp giữ chặt CPE trên bề mặt màng tế bào Phức hợp này sẽ thay đổi cấu hình liên kết với một protein màng khác có trọng lượng 70 kDa tạo thành phức hợp lớn kị nước Phức hợp lớn hình thành các cấu trúc

lỗ màng làm gia tăng tính thấm của màng Điều này dẫn đến hậu quả là các phân tử

nhỏ trong tế bào chất bị thoát ra ngoài gây gián đoạn nhanh chóng quá trình trao đổi

chất bên trong tế bào Mặt khác, do sự mất cân bằng trong tính thấm của tế bào, nước vào trong tế bào nhiều hơn gây ra hiện tượng vỡ tế bào (Hình 3)

Giới hạn cho phép của C perfringens trong thực phẩm được qui định bởi Bộ Y

tế (Bảng 2) Bảng này cho thấy, việc cho phép sự hiện diện của vi khuẩn C

perfringens trong một số mặt hàng thực phẩm là rất thấp và thậm chí không cho phép

sự hiện diện của vi khuẩn này

1.5.CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN C.PERFRINGENS TRONG

TH ỰC PHẨM

1.5.1.Phương pháp nuôi cấy [4], [8]

Các phương pháp nuôi cấy truyền thống để xét nghiệm C perfringens được xây

dựng dựa trên những đặc điểm về vi sinh, sinh hóa của vi khuẩn và gồm một số bước như sau:

- Nuôi cấy và phân lập

Mẫu thực phẩm được đồng nhất và dịch đồng nhất được pha loãng đến nồng độ thích hợp cấy 0,1 ml dịch pha loãng vào môi trường thạch sâu Iron Sulfite Agar (ISA) (hay trải, ria trên đĩa petri) Đổ thêm lên bề mặt một lớp môi trường ISA Ủ kị khí ở 37°C trong 24 giờ Trên môi trường ISA, khuẩn lạc đặc trưng của C perfringens s sẽ

có màu đen, hình tròn Tuy nhiên, một số chủng Clostrdium khác cũng tạo khuẩn lạc

có đặc điểm tương tự nên cần phải qua bước khẳng định sinh hóa

- Kiểm tra khẳng định sơ bộ

Cấy một khuẩn lạc đặc trưng của C perfringens trên môi trường ISA sang môi

trường thioglycolate broth Ủ ở 37°C trong 24 giờ, sau đó tiến hành nhuộm gram và quan sát hình thái tế bào dưới lánh hiển vi

Chuyển 1ml dịch nuôi cấy từ môi trường thioglycolate broth sang môi trường iron-milk ở 46°C Sau 2 giờ cấy, cứ cách mỗi giờ kiểm tra sự lên men ữong môi trường

- Kiểm tra khẳng định: thử phản ứng sinh hóa trên các môi trường nitrate và lactose-gelatin, thử hoạt tính catalase và khả năng di động để có kết luận

motility-cuối cùng là C perfringens Đây là trực khuẩn Gram dương, không di động, tạo khuẩn

lạc màu đen trên môi trường ISA, khử nitrate thành nitrite, cho thử nghiệm catalase

âm tính, lên men lactose sinh axit và hơi, làm tan gelatin

Có thể sử dụng cơ chất MÚP (Methylumbelliferylphosphate) để bổ sung thêm

vào môi trường ISA trong bước nuôi cấy phân lập để khẳng định C perfringens mà

không cần qua bước khẳng định sinh hóa MUP là cơ chất của phosphatase là chất chỉ

thị đác trưng đối với C perfringens Phosphatase sẽ phân cắt MUP tạo thành 4

methylumbelliferone và chất này sẽ phát huỳnh quang dưới đèn UV

1.5.2 Phương pháp ELISA (Enzyme - Linkeđ Immunosorbent Assay) [18,19]

Phương pháp ELISA cho phép phát hiện được 5 độc tố quan trọng của C perfringens là alpha, beta, epsilon, iota và độc tố đường ruột Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng một kháng thể đơn dòng liên kết đặc trưng Với độc tố của tế bào vi khuẩn

Việc phát hiện C perfringens trong thực phẩm thường tập trung vào phát hiện

gen tạo độc tố đường ruột vì đây là tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực phẩm Năm 1997, Patrick Fach và Michel R Popoff đã thành công trong việc phát hiện

vi khuẩn C perfringens tạo độc tố đường ruột trong thực phẩm bằng kĩ thuật PCR

'Trong phần nghiên cứu này, tác giả đã sử dụng đồng thời hai cặp mồi (PL3, PL7) và (P145, P146) để phát hiện sự hiện diện của hai gen pỉc mã hóa cho độc tố alpha

phospholipase C và gen cpe mã hóa cho độc tố đường ruột Cả hai gen này đều nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn C Perfringens

1.5.4.So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp

Phương pháp truyền thống phát hiện C perfringens trong thực phẩm gặp nhiều

giới hạn về thời gian, cần 3-5 ngày

Phương pháp ELISA thường cho kết quả nhanh và độ nhạy cao trong các trường

hợp xét nghiệm độc tố đã có sấn trong mẫu thực phẩm Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là đòi hỏi độ tinh sạch của mẫu cao nhằm tránh sự ức chế bởi các protein ữong thực phẩm Mặt khác, mẫu cần nguyên vẹn, không bị biến tính để tránh trường hợp cho kết quả âm tính giả Trong phương pháp này, mẫu cần được tăng sinh

trong môi trường và điều kiện đặc biệt để chủng hình thành bào tử và tạo độc tố Điều này làm giảm hiệu quả sử dụng của phương pháp

Trong khi đó, các phương pháp phát hiện C perfringens dựa trên kĩ thuật sinh

học phân tử thường có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Mặc dù các phương pháp này vẫn đòi hỏi bước tăng sinh để tăng mật độ tế bào của vi khuẩn nhưhg phương pháp này

không cần đến giai đoạn tạo độc tố Do đó, thời gian thực hiện của phương pháp này

ngắn hơn các phương pháp khác Ngoài ra, phương pháp này không đòi hỏi độ tinh

sạch của mẫu cao Vì thế, hiện nay các kĩ thuật sinh học phân tử đặc biệt là kĩ thuật

PCR đang được khuyến khích sử đụng rộng rãi trong việc phát hiện C perfringens

trong thực phẩm

1.6.KĨ THUÂT PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM

PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp in vitro để tổng hợp

DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích ĐNA ban đầu Phương pháp này cho phép nhân số lượng bản sao của khuôn thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của DNA polymerase và một cặp mồi đặc hiệu Hiện nay, kĩ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm

Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một

mạch DNA mới từ mạch khuôn Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn Nhờ hoạt động

của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới có trình tự

bổ sung ngược chiều với mạch khuôn Nếu có hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung ở hai đầu của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR, số lượng bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được nhân lên (khuếch đại) đến mức có thể thấy được vạch DNA sau khi nhuộm bằng ethidium bromide Vậy để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin

tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo

cặp mồi chuyên biệt Cặp mồi này gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gen

Phản ứng PCR nhân bản sao DNA là một chuỗi gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau,

mỗi chu kì gồm 3 bước (Hình 4)

- Bước 1: (biến tính, denaturation): được thực hiện ở nhiệt độ cao để hai mạch

của DNA bị biến tính và tách thành mạch đơn Trong một dung dịch phản ứng bao

gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn TR m R của phân tử, thông thường là ở 94 - 95°C trong vòng 30 - 60 giây

- Bước 2: (lai, anealation): các cặp mồi bắt cặp vào khuôn Trong bước này, nhiệt

độ được hạ thấp hơn TR m R của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70°C tùy thuộc vào TR m R

của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây

- Bước 3: (tổng hợp, elongation): ĐNA polymerase xúc tác việc tổng hợp DNA

bằng cách hình thành mạch mới bổ sung với mạch khuôn Ở bước này, nhiệt độ được tăng đến 72°c giúp cho DNA polymerase tổng hợp tốt nhất Thời gian của bước này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Trong phản ứng PCR, một chu kì gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều

lần Mỗi chu kỳ làm táng gấp đôi số lượng bản sao Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân Sau 30 - 40 chu kì, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng l0P

- DNA bản mẫu

Phản ứng PCR không đòi hỏi độ tinh sạch của mẫu, có thể thực hiện trên DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần Mặc dù vậy, để đạt được kết quả

tối ưu, cần sử dụng DNA bản mẫu có độ tinh sạch cao Ngoài ra, nồng độ DNA sử

dụng ương mỗi phản ứng thường rất thấp để tránh tình trạng nhân bản sao không chuyên biệt (khuếch đại kí sinh)

- DNA polymerase

Đây là enzym có vai trò trong việc kéo dài mạch mới bổ sung với mạch khuôn từ

mồi ban đầu Do phải hoạt động trong giai đoạn biến tính ở nhiệt độ cao nên yêu cầu trước tiên đối với enzym là phải chịu được nhiệt độ Hiện nay, có rất nhiều loại DNA polymerase được sử dụng rộng rãi trên thị trường nhưng việc sử dụng loại enzym nào,

với nồng độ bao nhiêu sẽ tùy thuộc vào yêu cầu của từng phản ứng và hoạt tính của enzym đó DNA polymerase thường được dùng nhất là Taq DNA polymerase Enzym này được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus và có khả năng chịu được nhiệt độ cao

- Mồi và nhiệt độ bắt cặp của mồi

Đối với phương pháp PCR, mồi là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của phản ứng

Do đó, cặp mồi được thiết kế phải đặc trưng cho đoạn DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen Trình tự nucleotide của mồi được lựa chọn sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược cũng như không có sự tự bắt cặp bên trong bản thân mồi, hình thành các cấu trúc kẹp tóc Thành phần các nucleotide trong mồi phải cân bằng nhau Nhiệt độ bắt cặp (TR m R) giữa 2 mồi không quá chênh

lệch Ngoài ra, kích thước của các mồi không quá lớn, thường vào khoảng 20 - 30 base

- Các thành ph ần khác

+ dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate): là một hỗn hợp gồm 4 loại nucleotide dATP, dGTP, đCTP và dTTP dNTP cung cấp năng lượng cho phản ứng PCR nhờ các nối phosphate giàu năng lượng và được gắn vào đầu 3'- OH của nucleotide trong mồi bằng liên kết phosphodiester Nồng độ dNTP sử dụng tùy thuộc vào điều kiện phản ứng chung nhưng nếu sử dụng ở nồng độ cao dễ dẫn đến hiện

tượng khuếch đại kí sinh

chế

+ Số lượng chu kì phản ứng: sau một số chu kì nhất định, các thành phần ương

phản ứng bị phân hủy hay bị cạn kiệt, các sản phẩm phụ hình thành gây ức chế phản ứng và các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà tự bắt cặp với nhau,

dẫn đến tình trạng hiệu quả khuếch đại giảm Vì vậy, để thu được kết quả cao cần thực

hiện phản ứng không quá 40 chu kì

+ Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng: để đảm bảo tính ổn định về nhiệt độ giữa các lần khảo sát nên sử dụng cùng một loại thiết bị và dụng cụ Đồng thời, để tránh các trường hợp ngoại nhiễm, cần sử dụng tất cả các dụng cụ mới cho phản ứng PCR

So với các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm khác, phương pháp PCR có một số ưu điểm như:

- Thời gian cho kết quả nhanh

- Có thể phát hiện được các vi sinh vật khó nuôi cấy

- Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn trường hợp huyết thanh học, không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp

- Ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát

hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm

- Cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào đã chết của vi sinh vật

gây bệnh hoặc gây ngộ độc

Mặc dù vậy, phương pháp PCR vẫn còn một số nhược điểm như:

- Hoạt tính của Taq DNA polymerase có thể bị ức chế bởi thành phần phức tạp

của mẫu thực phẩm

- Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên

đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy tăng sinh làm giàu để có được mật độ vi sinh

vật đủ để phát hiện bằng phương pháp PCR

- Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, do vậy có

thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết

1.7.XÁC NH ẬN HIỆU LỰC CỦA PHƯƠNG PHÁP THAY THẾ

1.7.1.Các khái ni ệm [13], [14]

- Xác nh ận hiệu lực (validation )

Xác nhận hiệu lực của một phương pháp thay thế là quá trình thực nghiệm, tiến hành so sánh, thống kê, tính toán các thông số dựa trên dữ liệu kết quả thu được từ phương pháp thay thế và kết quả thu được từ phương pháp tham chiếu cho cùng một

mục đích sử dụng Từ đó chứng minh kết quả phân tích nhận được từ một phương pháp thay thế tương đương hay vượt trội so với kết quả nhận được từ phương pháp tham chiếu

- Phương pháp thay thế (alternative method)

Phương pháp thay thế là phương pháp mới hay phương pháp cải tiến từ phương pháp tham chiếu Đây cổ thể là phương pháp phát hiện, phân tích hay đo lường các đối tượng phân tích

- Phương pháp tham chiếu (reference method)

Phương pháp tham chiếu là phương pháp phân tích hay đo lường được các tổ

chức có thẩm quyền của quốc gia hay quốc tế công nhận Do đó, phương pháp tham chiếu có giá trị về mặt pháp lí và được sử dụng rộng rãi bởi nhiều phòng thí nghiệm khác nhau trên phạm vi quốc tế

Để một phương pháp thay thế trở thành một phương pháp tiêu chuẩn, kết quả

cửa quá trình xác nhận hiệu lực được trình lên các tổ chức cố chức năng ban hành phương pháp để được xem xét, đánh giá Nếu được chấp nhận, phương pháp thay thế

sẽ trở thành phương pháp chính thức, có giá trị pháp lí và được ban hành rộng rãi

Hiện nay, nhiều tổ chức có chức năng ban hành phương pháp trên phạm vi quốc tế như CEN, AFNOR, ISO, AOAC, NordVal Ở Việt Nam, Bộ Khoa học và Gông nghệ

là cơ quan có chức năng thẩm định và phê duyệt phương pháp có giá trị trên toàn lãnh

thổ Việt Nam (Tiêu chuẩn Việt Nam) Các Vụ Khoa học công nghệ cửa các Bộ chuyên ngành cố chức năng ban hành các tiêu chuẩn có giá trị trong nội bộ của ngành (Tiêu chuẩn ngành)+

Quá tình xác nhận hiệu lực của một phương pháp thay thế gồm 2 bước là xác

nhận hiệu lực sơ cấp (primary validation) và xác nhận hiệu lực thứ cấp (secondary validation)

- Xác nh ận kiệu lực sơ cấp

Bước xác nhận hiệu lực sơ cấp do phòng thí nghiệm đề xuất phương pháp mới

tiến hành, nhằm đưa ra các thông số kĩ thuật để chứng minh rằng phương pháp mới cố đầy đủ độ tín cậy và tính năng tương đương hay là có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp tham chiếu Thiết lập cắc giới hạn và các đặc điểm của từng hoạt động trong quá trình thực hiện

- Xác nh ận hiệu lực thứ cấp

Bước này được thực hiện ở một số phòng thí nghiệm khác nhau dưới sự chù trì

của cơ quan có chức năng Bước xác nhận hiệu lực thứ cấp chứng minh rằng phương pháp thay thế phù hợp với các yêu cầu kĩ thuật của nhiều phồng thí nghiệm Kết quả xác nhận hiệu lực thứ cấp sẽ được trình lên hội đồng quốc gia hay các tổ chức quốc tế

có thẩm quyền ban hành phương pháp nhằm được xem xét, đánh giá và ban hành để

trở thành một phương pháp chính thức

1.7.3.Các thông s ố kĩ thuật trong qui trình xác nhận hiệu lực phương pháp định tính vi sinh v ật

Các thông số kĩ thuật đánh giá tính khả thi của phương pháp thay thế, đồng thời

nối lên độ tin cậy của kết quả khỉ phân tích bằng phương pháp này

- Độ chuyên biệt tương đối (relative selectivity): là khả năng phát hiện các dòng

khác nhau cửa vi sinh vật mục tiêu và không phát hiện các dòng vi sinh vật không

phải mục tiêu

- Độ chính xác tương đối (relative accuracy): là thông số đánh giá khả năng cho

kết quả chính xác của phương pháp thay thế so với phương pháp tham chiếu, là mức

độ phù hợp giữa kết quả nhận được từ phương pháp thay thế và phương pháp tham chiếu

Để tìm được giá trị gần đúng nhất, các kiểm ứa phân tích được tiến hành bởi nhiều phòng thí nghiệm khác nhau và kết quả cuối cùng là trung vị f (median) của dãy

kết quả thu được

- Độ lệch dương (positive deviation, PD): phương pháp thay thế có độ lệch

dương khỉ phương pháp này cho kết quả dương tính mà phương pháp tham chiếu cho

kết quả âm tính Độ lệch dương được xem là dương tính giả (false positive, FP) khi

mẫu phân tích được chứng minh thực sự là âm tính

Độ lệch dương được gọi là thực sự dương (true positive, TP) khi mẫu phân tích

được chứng minh là thực sự dương tính Tỉ lệ dương tính giả bằng tỉ số của kết quả dương tính giả thu được từ phương pháp thay thế và số kết quả được chứng minh là

âm tính

- Độ lệch âm (negative deviation, NĐ): phương pháp thay thế có độ lệch âm nếu

phương pháp này cho kết quả âm tính mà phương pháp tham chiếu cho kết quả dương tính Độ lệch âm được xem là âm tính giả (false negative, FN) khi mẫu phân tích được

chứng minh là thực sự dương tính Độ lệch âm được gọi là thực sự âm (true negative,

TN) khi mẫu phân tích được chứng minh là thực sự âm tính Tỉ lệ âm tính giả bằng tỉ

số của số kết quả âm tính giả thu được từ phương pháp thay thế và số kết quả được

chứng minh là dương tính

- Gi ới hạn phát hiện tương đối (relative limitation): là mật độ tế bào vi sinh vật

thấp nhất mà một phương pháp phân tích có thể phát hiện được Tại giới hạn phát

hiện, số lần phân tích cho kết quả dương tính phải lớn hớn 50% đối với cả phương pháp tham chiếu và phương pháp thay thế Xác nhận hiệu lực phương pháp phải

chứng minh được rằng phương pháp thay thế có giới hạn phát hiện thấp hơn hay bằng

giới hạn phát hiện của phương pháp tham chiếu

- Độ nhạy tương đối (relative sensitivity): là thông số thể hiện khả năng phát

hiện vi sinh vật mục tiêu có trong mẫu của phương pháp thay thế, Độ nhạy tương đối được tính bằng tỉ số của số kết quả dương tính thu được từ phương pháp thay thế và số

kết quả dương tính thu được từ phương pháp tham chiếu

- Độ đặc hiệu tương đối (relative specificity): là thông số thể hiện khả năng cho

kết quả âm tính của phương pháp thay thế đối với các mẫu được xác định là âm tính

bằng phương pháp tham chiếu Độ đặc hiệu tương đối được tính bằng tì số cửa số kết

quả âm tính thu được từ phương pháp thay thế và số kết quả âm tính thu được từ phương pháp tham chiếu

- Độ lặp lại (repeatability): độ lặp lại của một phương pháp là mức độ thống nhất

cửa các kết quả từ những lần khảo sát độc lập trên một mẫu xác định, trong cùng một điều kiện thực hiện như: qui trình, thiết bị, thời điểm, người thực hiện,

- Độ ổn định (robustness): là mức độ ổn định của kết quả phân tích khi các điều

kiện thực hiện có sự thay đổi nhỏ như sai số do đụng cụ hay sai số trong quá tành thực

hiện Khảo sát độ ổn định nhằm xác định các khoảng giới hạn cho phép của các thành

phần tham gia vào qui trình phân tích của phương pháp mà vẫn đảm bảo được tính ổn định của kết quả

- Độ khác biệt XP

2

P (significant difference): là thông số cho biết tính tương đương

của phương pháp thay thế và phương pháp truyền thống về mặt thống kê Nếu xP

2

P

<3,84 thì không có sự khác biệt giữa phương pháp truyền thống và phương pháp thay thế

1.7.4 Ý nghĩa của việc xác nhận hiệu lực

Quá trình xác nhận hiệu lực một phương pháp mới hay phương pháp thay thế sẽ giúp các phòng thí nghiệm cũng như các tổ chức có thẩm quyền cố những đánh giá khách quan về hiệu quả, tính khả thỉ, độ tín cậy cửa phương pháp thay thế Bên cạnh

đó, việc xác nhận hiệu lực cũng là bước hoàn thiện phương pháp, giúp phương pháp

có giá tộ về mặt pháp lí, được sử dụng rộng rãi trên phạm vi quốc gia hay quốc tế

Hiện nay, vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm rất được quan tâm Quá trình xác

nhận hiệu lực của phương pháp phân tích vi sinh còn mang lại sự thống nhất -trên bình diện quốc tế, giúp việc mua bán, trao* đổi các mặt hàng thực phẩm dễ dàng và đáng tin cậy hơn

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1.V ẬT LIỆU

2.1.1.D ụng cụ và thiết bị

Bao gồm dụng cụ và thiết bị cửa một phòng thí nghiệm vi sinh cơ bản như nồi

hấp tiệt trùng, tủ sấy, tủ ấm, đĩa petri, ống nghiệm và một số thiết bị đặc biệt phục

vụ cho phần khảo sát này như:

- Bình nhựa kín dùng để ủ kị khí

- Máy li tâm lạnh Mikro 22R (Hettich Zentrifugen-Mikro22R)

- Bộ điện di ngang Horizon 58 (Life technology-Horizon 58)

- Hộp đèn soi tử ngoai Hoefer (UVTM-19-230V)

- Máy chụp hình gel IMAGEMASTER VDS (Amersham Pharmacia FTI-500)

Biotech Máy luân nhiệt theo chu kỳ Eppendorí Mastercycle Personal (Tube 0,5ml)

- Máy dập mẫu STOMACHER 400 CIRCULATOR (Seward)

+ Mồi (primer): cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu này là PL3, Phi có tích thước

24 basẹ và khuếch đại được độ dài đoạn ĐNA 283 cặp base Trình tự các mồi PL3, PL7 (từ 5' - 3') như sau:

PL3 AAG TTA CCT TTG CTG CÁT AAT CCC

PL7 ATA GAT ACT CCA TÁT CÁT CCT GCT

+ Taq DNA polymerase: nồng độ 5U/µl (Fementas) trong dung dịch đệm 50mM Tris - HC1 (pH 7,5), 0,lmMEDTA, 5mM ĐTT, 50% glycerol, được bảo quản ở-20°C

- Hóa ch ất dùng cho điện di

+ Đệm tải mẫu điện đi: 30% glycerol, 0,15% bromophẹnol blue, 200mM Tris; 20mM EDTA

+ Đệm TAE IX: 4,48g Tris, 2ml Na2 EDTA, 0,5M pH 8; l,14ml glacial acetic acid trongiooo mi nước

+ Agarose

+ Thang ĐNA đo Fementas cung cấp: dùng để ước lượng kích thước của sản

phẩm DNA khỉ điện di trên gel agarose Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng thang ĐNA 100bp do hãng Pementas - Đức cung cấp có số vạch và kích thước được minh hoa ở Hình 5

2.1.2.2.Môi trường

+ Môi trường ISA (Iron Sulphite Agar): đùng để định lượng mật độ vi khuẩn kị khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, có thành phần như sau: Casein enzymic hydrolase 10,0g, sodium sulfite 0,5g, iron cittrate 0,5g, agar 15,0g, nước cất vừa đủ 1000ml Môi trường này do hãng Mecrk (Đức) cung cấp và được hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút

+ Ganh thịt dùng để giữ giống vi khuẩn, có thành phần như sau: tim bồ tươi 450g, pepton 20g, glucose 2g, NaCl 5g, nước cất vừa đủ 1000ml, pH sau khi pha chế

là 7,0±0,2

+ Choped Liver Broth dùng để giữ giống vi khuẩn, cố thành phần như sau: gan

bò tươi 500g, pepton l0g, KHR 2 RPOR 4 R lg, tinh bột tan lg, nước cất vừa đủ 1000 ml, chỉnh

pH đến 7,0

Cách chuẩn bị hai môi trường trên như sau: xay gan (tim) bồ hòa vào nước, đun sôi nhẹ trong 1 giờ Lọc qua vải mừng, ép thu lấy phần dịch tim (gan) Gác thành phần còn lại được hòa tan vào nước cất cho đủ l000ml, chỉnh pH đến 7,0 Hút 1,2 - 2,5 dịch tìm (gan) bò vào ống nghiệm bổ sung 10 - 20ml môi trường Hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút

+ Fluid Thioglycolate dùng để tăng sinh Clostridium perfringens, cố thành phần

như sau: casein enzymic hydrolysate 15g, cao nấm men 5g, glucose 5,5g, sodium chloride 2,5g, N-cystine 0,5g, sodium thioglycolate 0,5g, resazurin sodium 0,001 g, agar 0,75g, nước cất vừa đủ l000ml Hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút, pH sau khi

khử trùng là 7,0 ± 0,2

+ Dung dịch pha loãng SPW (Salin Pepton Water) có thành phần: pepton l,0g, NaCl 8,5g, nước cất vừa đủ l000ml, pH 7,0±0,2 Hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút

+ Môi trường Iron-milk Medium dùng để thử nghiệm khả năng lên men sữa có thành phần: sữa tươi l000ml, FeS04.7H20 lg, nước cất 50ml Môi trường được hấp Pasteur ở 80°c trong vòng 15 phút

+ Môi trường Buffered Motility-nidrate medium gồm: cao thịt 3g, pepton 5g, KN03 2,5g, Na2HP04 2,5g, agar 3g, galactose 5g, glycerin 5ml, nước cất vừa đủ l000ml Hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút

+ Môi trường TSB (Tryptic Soya Broth) ứiạch mềm dùng để thử nghiệm khả năng di động của vi sinh vật gồm: TSB 30g/l, bổ sung 4,5g agar/1 Phân ra ống nghiệm khoảng 3cm/ống, hấp khử trùng ở 121P

+ Hai mươi chủng Clostridium perfringens được phân lập và khẳng định sinh

hóa từ các nguồn thực phẩm như mắm ruốc, mấm chua, nước mắm, mắm nêm, tôm khô, khô các loại được thu từ các chợ Tân Phú (Thủ Đức), chợ Tam Bình (Thủ Đức),

chợ Bình Hưng Hòa (Bình Chánh) Tp HCM và từ nguồn nước sông Sài Gòn

- M ẫu thực phẩm