Kỹ Thuật Nuôi Cấy Tế Bào Động Vật

* Một vài loại môi trường thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô động vật: • Môi trường BM Basal Medium: tế bào Hela, tế bào L.. Giới thiệu về kỹ thuật pha môi trườngMột số điều

KỸ THUẬT NUÔI CẤY

TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

I GIỚI THIỆU CHUNG:

• * Harrison (1907),Carrel (1912): nuôi cấy tế bào động vật

• Ếch là nguồn mô đầu tiên để nuôi cấy

• * Sự thúc đẩy của y học buộc người ta quan tâm đến các loài động vật ổn nhiệt

• * Dòng Hela được Gey và cộng sự thiết lập năm 1952

• * Năm 1961 Hayflick và Moorhead nghiên cứu về những tế

bào bình thường có đời sống xác định

• * Tạo vaccin kháng virus và nghiên cứu về ung thư thúc đẩy kỹ thuật nuôi cấy TBĐV phát triiển

• * Sự phát triển chung của kỹ thuật công nghệ làm nuôi cấy mô có thể được quan tâm rộng rãi

• * Kỹ thuật nuôi cấy mô được ứng dụng nhiều vào các lĩnh vực trong y học và công nghiệp

1 Những thuận lợi của nuôi cấy mô 

a Kiểm soát môi trường

b Tính đồng nhất của mẫu

c Kinh tế 

2 Những khó khăn của nuôi cấy mô

a Sự thành thạo của người thao tác

b Số lượng 

c Sự không ổn định

3 Những khác biệt chính của tế bào trong điều kiện in vitro

•* Thay đổi không gian kết hợp

•* Không còn tính tương tác tế bào chuyên biệt, tương tác đa

chiều

• * Không thực sự đại diện cho mô mà từ đó các tế bào này được tách ra do thiếu các yếu tố điều hòa

II ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

1 Tính cơ học yếu

2 Tăng trưởng và phân chia chậm

3 Cơ chế kìm hãm ngược (negative feed-back)

4 Tính chất cần giá đỡ

5 Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

6 Có thể được bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu

7 Các đặc tính khác

III.MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

sung 20% huyết thanh)

* Một vài loại môi trường thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô động vật:

• Môi trường BM (Basal Medium): tế bào Hela, tế bào L.

• Môi trường E’MEM (Eagle Minimum Essential Medium)

• Môi trường D'MEM (Dulbecco – Modified Eagle Medium)

• Môi trường F10, F12: do R.G Ham thiết lập dùng cho nguyên

bào sợi

• Môi trường Iscove: do N.N.Iscove thiết lập trên cơ sở tiếp tục

cải biến môi trường DMEM

• Môi trường 5A: do T.A Mc.Coy thiết lập, thường được dùng

cho tế bào bệnh bạch huyết

• Môi trường RPMI-1640: được G.E Moore thiết lập, được dùng

để nuôi tế bào và mô bạch huyết

• Môi trường 199: do R.C Parker thiết lập dùng để nuôi tế bào

mô cơ phôi gà trong sản xuất vaccin phòng bệnh bại liệt

Huyết thanh:

• *Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng…

• *Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân chia

•* Kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzym gây tổn thương tế bào

• *Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng

• *Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ

• *Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh và

ức chế độc tính của oxy

2 Giới thiệu về kỹ thuật pha môi trường

Một số điều cần lưu ý trong khi pha môi trường

• Thành phần môi trường:

+ Acid amin: cung cấp nguồn N cho tế bào+ Glucose: cung cấp nguồn C cho tế bào+ Vitamine: là các yếu tố vi lượng quan trọng trong hoạt động sống của tế bào

+ Muối khoáng: tạo hệ đệm và duy trì áp suất thẩm thấu phù hợp

+ Protein: quan trọng nhất là các yếu tố tăng trưởng hiện diện trong huyết thanh có vai trò kích thích phân bào

• Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ CO2

• Sự vô trùng 

IV KỸ THUẬT TÁCH TẾ BÀO, CHỌN DÒNG TẾ BÀO VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VÂÏT

1 Kỹ thuật tách tế bào

Một số khái niệm:

• *Dòng tế bào (cell line)

• *Dòng tế bào liên tục (continued cell line; established cell line) Ví dụ: CHO (chinese hamster ovary: tế bào buồng trứng chuột Trung Quốc), Schneider-2 (tế bào phôi ruồi giấm), COS1 (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi), Hela (tế bào ung thư cổ tử cung người), Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi)

• *Dòng tế bào tạm thời (temporary cell line)

• *Tế bào sơ cấp (primary cell)

• *Tế bào thứ cấp (secondary cell)

Tách tế bào bằng trypsin

2 Kỹ thuật chọn dòng tế bào

Tách tế bào từ đĩa nuôi cấy bằng trypsinCấy tế bào vào đĩa nuôi cấy 1000 tế bào/mlNuôi ủ tế bào đến khi chúng phát triển thành những colony

Chọn một colony tế bào cần tạo dòngCô lập colony này bằng 1 ống kim loạiHút bỏ môi trường trong ống và tách các tế bào từ colony này

Cấy sang một đĩa môi trường mới

3 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật trong phòng thí nghiệm

a Cấy chuyền tế bào

Đổ bỏ môi trường cũ trong bình roux có tế bào

Rửa tế bào bằng PBS(-)Tách tế bào bằng trypsinHuyền phù tế bào bằng môi trường

Cấy tế bào sang bình roux mới

Thay môi trường

b Bảo quản tế bào

Tách tế bào trong bình roux bằng trypsin

Huyền phù tế bào bằng môi trường

Ly tâm thu sinh khối tế bàoHuyền phù tế bào bằng môi trường mớiHút dịch huyền phù cho vào tube bảo quản tế bào 2mlĐể tube bảo quản vào hộp xốp bên trong có lót bông gòn

Cho vào tủ lạnh -70oC qua đêmBảo quản tube tế bào trong Nitơ lỏng

c Hoạt hóa tế bào

Tube tế bào lấy từ nitơ lỏngCho vào becher nước ấm 37– 38oC để giải đông.Hút dịch huyền phù tế bào cho vào bình roux

Thêm môi trường từng giọt vào bình

Ủ ở 37,5oC trong tủ nuôi

Sau 24 giờ, thay môi trường cũ bằng môi trường mới

4 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật ở quy mô pilot và công nghiệp

a Nuôi cấy trong bình khuấy:

- Thể tích: vài lit đến 20 lit, tốt nhất là dưới 10 lit

- Hấp vô trùng bằng autoclave

* Yêu cầu với cánh khuấy:

+ Phải được giữ tốc độ quay ổn định từ 10-300rpm

+ Có một máy đo tốc độ gốc chính xác

+ Khởi động lại sau khi mất điện và vẫn giữ nguyên tốc độ đã cài đặt

+ Không tỏa nhiệt nhiều

+ Hoạt động ổn định trong trong môi trường ở 37oC

Môi trường được giảm nồng độ huyết thanh (0.5-5%), bổ

sung:

+ Pluronic F-68 (polyglycol) : nồng độ 0.1% để bảo vệ tế bào chống lại sự phá vở do cơ học, đặc biệt ở hàm lượng

huyết thanh thấp

+ Carboxymethyl cellulose (CMC) : nồng độ 0.1% cũng

dùng để bảo vệ tế bào khỏi sự phá vỡ cơ học

+ Phá bọt (6ppm) : dùng khi nồng độ huyết thanh trên 2%.

Bình nuoâi caáy khuaáy

Hệ thống không đồng nhất

Hollow-fibre (sợi rỗng)

Ceramic matrix modules (các đơn vị chất nền ceramic)

Hệ thống đồng nhất

Bioreactor khuấyAirlift Bioreactor

b Nuôi cấy tế bào ở quy mô pilot và sản xuất:

Các hệ thống nuôi cấy

* Hollow-fibre và ceramic matrix module :

Hệ thống hollow-fiber

Ceramic matrix

Vài đặc điểm của 2 hệ thống này là:

• *Mật độ tế bào cao > 108/ml

• *Nồng độ sản phẩm cao: trong hollow fibre là 400mg/l IgM, 1100mg/l IgG; trong ceremic matrix module: 300mg/l

• *Chất dinh dưỡng, oxy và chất thải tạo thành gradient trong buồng nuôi

• *Khoảng cách khuếch tán dài của oxy và chất dinh dưỡng trong hollow-fibre

• *Sản phẩm thu được không lẫn hay rất ít tế bào

• *Đánh giá mật độ tế bào trong phòng nuôi chỉ bằng lượng oxy tiêu thụ

•* Không có chổ để lấy mẫu tế bào để kiểm tra mức độ sống và hình thái của tế bào trong quá trình nuôi cấy

•* Không có lực thủy động lực học gây biến dạng trong

hollow-fibre

•* Màng của hệ thống hollow-fibre có thể bị bít lại

•* Sự tăng quy mô bị giới hạn vì chiều dài của ống không thể vượt quá một độ dài nhất định chỉ có thể gia tăng về đường kính và số lượng module đưa vào

•* Khó chuyển tế bào phát triển trong hệ thống nhỏ vào hệ thống lớn

* Bioreactor khuaáy

•*Tế bào huyền phù đồng nhất

• *Kiểm soát môi trường (pH, oxy, dinh dưỡng)

• *Dễ lấy mẫu tế bào để kiểm tra

• *Dễ chuyển tế bào sang bước tăng quy mô tiếp theo

• *Cung cấp oxy là chỉ số quan trọng nhất trong các bioreactor lớn hay mật độ nuôi cấy cao Các ống silicone/polypropylene thấm oxy tạo nên các bọt khí tự do, chiều dài các ống này tùy theo lượng oxy yêu cầu

• *Tế bào bị tác động bởi các lực thủy động học

* Airlift bioreactor

• *Không cần các ống silicone dài để cấp không khí.

• *Tế bào bị phá hỏng bởi lực gây biến dạng khi các bóng khí vở ra

• *Cần bổ sung các chất chống tạïo bọt nhất là trong môi trường có nhiều protein

• *Sự lưu thông của tế bào có thể được gia tăng bởi thiết bị khuấy cơ học nhằm hạn chế tỷ lệ phun khí ở mật độ tế bào thấp nhưng vẫn đủ duy trì lượng oxy hòa tan

Các hình thức nuôi cấy

• Các hình thức nuôi cấy để sản xuất MAbs trong những hệ thống nuôi cấy in vitro lớn:

+ Batch (theo mẻ) + Chemostat (nuôi cấy liên tục)

• Batch được dùng phổ biến

• Hình thức chemostat cho phép tạo MAbs liên tục

* Hình thức batch

Cấy tế bào Tế bào phát triển đạt yêu cầu

Vệ sinh thiết bị Thu hoạch

•*Mật độ tế bào thấp hơn so với nuôi c y liên tục hay hệ ấy liên tục hay hệ thống không đồng nhất (cuối quá trình, có ít hơn 5x106 tế bào/ml)

•*Mật độ sản phẩm thường thấp hơn 100mg/l

•*Yêu cần kiểm soát quá trình thấp

*Có sự tích tụ các cơ chất biến đổi và chất thải

*Tỷ lệ thời gian sản xuất và thời gian tái sản xuất

thấp

* Hình thức chemostat

Heä thoáng chemostat

•* Mật độ tế bào đạt được đến mật độ cuối cùng trong hình thức batch và được duy trì ổn định

•* Hàm lượng sản phẩm cao hơn 300mg/l

•* Điều kiện nuôi cấy không đổi

•* Tối ưu cho việc tạo sản phẩm kháng thể nhưng không tối

ưu cho tạo sinh khối

•* Tối ưu cho các thông số ở điều kiện ổn định với độ chính xác cao

•* Năng xuất cao hơn

•* Tốc độ chảy của môi trường và mực chất lỏng trong

bioreacter phải được kiểm soát

V MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

•* Nghiên cứu bệnh lý (bệnh di truyền, ung thư ); nghiên cứu độc tính hoạt chất (các chất ô nhiễm, chất chống ung thư); nghiên cứu cơ bản (apoptosis, ung thư học tế bào, biệt hóa )

• * Ghép mô ở cùng một cơ thể

• * Tạo nên các sản phẩm sinh học như hormone và insulin; tạo ra kháng thể đơn dòng

• * Dùng tế bào nuôi cấy để sản xuất vaccin

Ví dụ như vaccin phòng HBV (Hepatitis B virus) được sản xuất bằng dòng tế bào ung thư gan ở người (tế bào Alexander, tế bào huGK-14) được chuyển plasmid mang gen mã hóa kháng nguyên bề mặt HBs của HBV

• *Sản xuất virus bằng cách gây nhiễm vào tế bào động vật

Virus sản xuất được dùng làm vaccin hay sản xuất enzym RTase (Reverse Transcriptase)…

• *Sản xuất interferon bằng tế bào động vật Interferon do tế bào tiết ra khi bị virus tấn công có tính chất kháng virus và kháng

khối u