Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kỹ thuật và ứng dụng: Bảo quản đông lạnh tế bào

Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật - Kỹ thuật và ứng dụng: Bảo quản đông lạnh tế bào trình bày khái niệm bảo quản đông lạnh; vai trò của bảo quản động lạnh; nguyên tắc trong bảo quản đông lạnh tế bào; quy trình bảo quản đông lạnh tế bào...

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT: KĨ THUẬT VÀ ỨNG DỤNG

BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TPHCM KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TPHCM 03/2018

CRYOPRESERVATION

VIỆN TẾ BÀO GỐC

Lê Thị Ngân Hàltnha@hcmus.edu.vn

…"I want to live and live longer and I think that in the future they may find a cure for my cancer and wake me up," the 14-year-old wrote to a British judge before her recent death.

She said "being cryopreserved gives me a chance to be cured and woken

up — even in hundreds of years' time.”…

o Tái lưu thông máu

o Thuốc hỗ trợ bảo vệ tế bào

o Thay máu và dịch lỏng

trong cơ thể bằng chất chống đông

o Giảm nhiệt với tốc độ

0,5/giờ đến nhiệt độ nito lỏng

o Bảo quản trong các tủ

đông hình trụ.

Bảo quản đông lạnh là gì?

Bảo quản: là quy trình sinh học nhằm đảm bảo •nh

ổn định về mặt di truyền và cấu trúc nguyên vẹn củ

a các tế bào sống; đảm bảo các thành phần như

nucleic acid và protein của tế bào không thay đổi

Bảo quản lạnh là việc sử dụng nhiệt độ rất thấp để bảo

vệ tế bào và mô sống còn nguyên vẹn trong một thời gian dài

Vì sao phải bảo quản đông lạnh tế bào?

Thuậnlợi bảotồn gen

Dòng tếbào quýhiếm

Giảm rủironhiễm

Ngăncản sựbiệt hoá/ lãohoá

Đáp ứng của tế bào với các stress khi đông lạnh

Tác nhân stress Phản ứng của tế bào

Giảm nhiệt độ Biến đổi lớp màng lipid, khử polymer

hoá bộ xương tế bàoTăng nồng độ các chất hoà tan Giảm áp suất thẩm thấu

Tăng nồng độ ion Phản ứng trực tiếp trên màng bào

gồm tính tan của màng proteinKhử nước Mất ổn định lớp đôi phospholipid

Hình thành bọt khí Tổn thương cơ học lên màng và bộ

xương tế bào

Tế bào bị chèn xếp khít lại Tổn thương màng

Tính nhớt của môi trường tăng Quá trình khuếch tán/thẩm thấu bị

hạn chế

Giảm thiểu sự hình thành tinh thể băng trong tế bào

(1) Đông lạnh “chậm”

(2) Sử dụng chất bảo quản đông lạnh

(3) rữ các tế bào ở mức nhiệt độ thấp nhất có thể để giảm thiểu tác động của nồng

độ muối cao lên sự biến đổi protein trong TB

(4) tan băng nhanh chóng để giảm thiểu sự phát triển của tinh thể băng (tái kết tinh)

Tae Hoon Jang , Cryopreservation and its clinical applications, 2017

CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH – CRYOPROTECTANTS AGENT

Là các loại hoá chất tan được trong nước, có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào, được sử dụng với mục đích giúp tế bào ngăn ngừa các tổn thương tế bào do đông lạnh.

Nguyên tắc:

(1) Thay thế nước trong tế bào à giảm hình thành tinh thể đá nội bào à

giảm tổn thương do tinh thể đá gây ra.

(2) Hạn chế tăng nồng độ các chất hoà tan nội bào

(3) Kết lên màng bào tương à bảo vệ tế bào.

Hoạt động: “khử nước” trong quá trình đông lạnh, “bù nước” trong quá

Ảnh hưởng của CPA lên Tế bào

Nồng độ?

QUY TRÌNH BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO

NUÔI TĂNG SINH GIẢI ĐÔNG - PHỤC HỒI

LƯU TRỮ LÀM LẠNH

BỔ SUNG CHẤT BẢO QUẢN

CHUẨN BỊ TẾ BÀO

Thiết bị Dụng cụ – hoá chất

Kính hiển vi đảo ngược

• Tủ thao tác an toàn sinh h

CHUẨN BỊ

Đông lạnh

theo chương

Chuyển TB trực tiếp vào -196

Đông lạnh khi tế bào vẫn giữ trạng thái tăng sinh lúc nuôi cấy

Thời gian lưu trữ:

Bất kỳ một gián đoạn nào trong thời gian trữ đông đều ảnh hưởng đến khả năng sống của Tb sau giải đông.

Nhiệt độ lưu trữ: Nhiệt độ Thời gian

Thao tác?

MTGĐ: môi trường cơ bản (RPMI, DMEM/F12, IMDM ) bổ sung 20-30% huyết thanh thai bò (FBS), 1%

kháng sinh-kháng nấm

Cryopreservation Thawing

sinhhoáCPA

Chết TB

Tăng nhiệtLoại CPATốc độ

làm lạnh