Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng: Bài 5 – TS. Vũ Bích Ngọc (2020)

Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng: Bài 5 – TS. Vũ Bích Ngọc trang bị cho người học kiến thức về bảo quản đông lạnh tế bào; dịch vụ làm đông lạnh cơ thể người chết để chờ hồi sinh; bảo quản tế bào, nguyên tắc bảo quản đông lạnh tế bào...

Dịch vụ làm đông

lạnh cơ thể người

chết để chờ hồi sinh

• Khi "khách hàng" đã chết về mặt pháp y, nhân viên Alcor chuyển

họ lên giường lạnh và dùng thiết bị hồi sức tim phổi làm cho máu lưu thông khắp cơ thể một lần nữa Sau đó, họ sử dụng 16 loại thuốc khác nhau để giúp cho tế bào không bị hư tổn sau khi chết trước khi rút hết máu và dịch cơ thể rồi bơm chất lỏng bảo vệ nội tạng vào thay thế

Cuối cùng, các nhân viên tiến hành làm lạnh thi thể 0,5 độ C mỗi giờ cho đến khi đạt tới nhiệt độ của nitơ lỏng -160 độ C sau 2 tuần Tiếp đó, họ cho các thi thể vào

tủ đông lạnh hình trụ trong tư thế đầu lộn xuống

Cryonics

https://www.youtube.com/watch?v=YhPQhU5a7fE

Bảo quản đông lạnh đã tồn tại trong tự nhiên từ rất lâu

1949 Polge, Parks và Smith

1950 Smith

GLYCEROL

Dimethyl sulfoxide- DMSO

1959 Lovelock and Bishop

TĂNG CƯỜNG TÍNH THẤM

là quy trình sinh học nhằm đảm bảo tính ổn định về mặt di truyền

và cấu trúc nguyên vẹn của các tế bào sống; đảm bảo các thành

phần như nucleic acid và protein

của tế bào không thay đổi

Quá trình ổn định vật liệu sinh học

ở nhiệt đô cực thấp được gọi là

bảo quản đông lạnh

Hoạt động biến dưỡng tế bào

ngưng lại là một điều kiện tiên quyết trong quy trình

bảo quản tế bào

Tất cả nước trong hệ thống bị chuyển đổi thành đá THÌ hoạt động biến dưỡng ngưng

Nguyên tắc bảo quản đông lạnh tế bào là làm cho tế bào

mất đi một lượng nước nhất

định nhằm hạn chế tình trạng đóng băng trong quá

trình làm lạnh

Sử dụng chất bảo quản đông

lạnh

Áp lực chọn lọc

khiến dòng tế bào

bất ổn về đặc tính

Sự giới hạn về khả năng tăng sinh của tế bào

Sự bất ổn trong kiểu gen và kiểu

YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỐNG- CHẾT CỦA TẾ BÀO

Chất bảo

quản

Quy trình đông lạnh-

rã đông

Môi trường đông lạnh-chất bảo quản

ØMôi trường cơ bản:

DMEM, IMDM, RPMI, ….

ØHuyết thanh ØKháng sinh ØChất bảo quản

(CPA): glycerol, DMSO

VD: DMEM/F12; 20-40%FBS, 5-10% DMSO, 1% Antibiotic-antimycotic

Chất bảo quản đông lạnh (CPA)

là chất được dùng để bảo vệ mô/tế bào khỏi các tổn thương do đông lạnh (tổn thương do tạo đá ).

Các chất có thể thâm nhập dễ dàng vào tế bào và thường không độc hại cho tế bào

• glycerol và DMSO được sử dụng rộng rãi

• giảm nồng độ các chất điện giải trong suốt quá trình đóng băng

• giảm mức độ co tế bào do thẩm thấu ở nhiệt độ thấp

Các chất tan không thấm qua màng: đường và các hợp chất

có phân tử lượng cao như polyvinylpyrrolidone,

hydroxyethyl starch, polyethylen glycol và dextrans

chất bảo quản không thấm có thể góp phần tăng cường sự thuỷ tinh hoá dung dịch, ổn định protein và màng, ngăn chặn sự tiến triển trong hình thành tinh thể đá

4oC ——> 2 giờ -40oC ——> Một vài ngày -80oC ——> Một vài tháng

Nhiệt độ thấp có khả năng "làm chậm thời gian" hoặc thậm chí

dừng lại thời gian” sinh học.

-196oC à một vài thế kỷ

Nhi ệ t đ ộ b ả o qu ả n l ạ nh

-50C, cả tế bào và môi trường

quanh nó chưa bị đóng băng

-50C đến -150C, đá ngoại bào hình thành Tế bào ở trạng thái “siêu lạnh” (supercool)

Ở thấp hơn -1200C, phản ứng

hoá học không thể xảy ra đối

với cơ thể sống

Ở -1960C, phản ứng liên quan đến nhiệt không thể xảy ra vì năng lượng nhiệt không đủ, do đó, tế báo có thể được lưu trữ ở nhiệt độ này trong nhiều thế kỷ

Tốc độ làm lạnh Chuẩn hoá thời gian hạ nhiệt

Bảo quản đông lạnh

Đông lạnh

Bổ sung CPA

Kiểm soát tốc độ Vận chuyển của nước

Kie+m soát 2 tiêu chí Kết quả đông lạnh tốt nhất

Cách tiếp cận hiệu quả

để tối ưu hoá bảo quản đông lanh

2 tiêu chí: (1) sự tạo tinh thể đá và (2)thay đổi thể tích tế bào

You hurt

me.

Quy trình đông lạnh quá chậm

Tế bào sẽ mất nhiều nước Thể tích tế bào trở nên quá nhỏ

Tế bào sẽ bị tổn thương nghiêm trọng

Why it’s me?

Optimal

Nếu đông lạnh quá nhanh, tế bào mất rất ít nước

nước được giữ trong tế bào trở thành tinh thể đá,

thể tích tế bào có thể không đổi, thậm chí lớn hơn

Tế bào chịu tổn thương nghiêm trọng do sự tạo đá nội bào

I am Lucky.

Op)mal

Thời gian đông lạnh phù hợp, tế bào giữ được điều kiện tốt nhất cho sự sống sót

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/93/Cryopreservation.jpghttp://www.scq.ubc.ca/a-cold-greeting-an-introduction-to-cryobiology/

Tốc độ làm lạnh có ảnh hưởng lớn

đến sự hình thành đá nội bào

Nuôi cấy/chuẩn bị tế bào

Bổ sung chất bảo quản

Làm lạnh Lưu trữ

Rã đông phục hồi tế bào Nuôi tăng sinh

Kính hiển vi đảo ngược

Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II Máy ly tâm

Bình chứa nitơ lỏng

• Tế bào được nuôi cấy trong Flask hoặc dụng cụ nuôi phù hợp

• Trypsin/EDTA 0,25%

• PBS không Ca2+ và Mg 2+ (PBS-)

• Môi trường đông lạnh tế bào: bao gồm môi trường cơ bản

(RPMI, DMEM/F12, IMDM…) bổ sung 40-50% huyết thanh thai

bò (FBS), 5-10% dimethylsulphoxide (DMSO)

• ống bảo quản đông lạnh (cryovial) 1,5-2 ml

• Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng

Kiểm tra dòng tế bào về sự ổn

định và nhiễm.

Tế bào được nuôi lại để đảm bảo

ở pha log của tăng trưởng.

Dán nhãn cryotubes với tên dòng

tế bào, số lượng tế bào/lọ, ngày

Xác định tỉ lệ tế bào sống chết

Chuẩn bị tế bào trước đông lạnh

Đông lạnh tế bào

Thu tế bào đơn

Bổ sung từ từ (nhỏ giọt) môi trường đông lạnh chứa chất bảo quản đông lạnh (DMSO nồng độ 5-10%) vào ống chứa tế bào

Làm lạnh tế bào theo quy trình phù hợp

(tổn thương do tạo đá ).

VD: glycerol, DMSO……

liquid nitrogen (-196oC),

và bảo quản trong thời gian dài

Các bước cơ bản cho bảo quản đông lạnh mô/te bào

Chuyển sang -800C, để qua đêm

Chuyển vào bình ni tơ lỏng

LÀM LẠNH THEO CHƯƠNG TRÌNH

Đặt tế bào vào hệ thống làm lạnh

theo chương trình

cài đặt hệ thống làm lạnh với thông

số nhiệt độ và thời gian làm lạnh

tương ứng

chuyển vào bình ni tơ lỏng

• Ở tốc độ làm lạnh cực nhanh và độ nhớt cao, tế bào không hình thành tinh thể đá nội bào và ngoại bào

• việc kiểm soát độ nhớt mong muốn cần phải được khảo sát và chuẩn hoá

• phương pháp đã thành công cho tế bào tinh trùng, trứng,

• Nhiệt độ khởi động: 4 0 C hoặc RT

• Tốc độ hạ nhiệt: làm lạnh -1 0 C mỗi phút và hạ nhiệt đến

• nhiệt độ đạt dưới -100 0 C, có thể đặt trực tiếp vào ni tơ lỏng

• cọng rạ hoặc các lọ chứa được làm lạnh bằng nitrogen

• Các loại tế bào khác nhau có thể đòi hỏi tốc độ làm mát khác nhau

Các tế bào cần được làm tan nhanh chóng và sau đó pha loãng từ từ vào môi trường tăng trưởng.

Chuyển một ống tế bào 1ml vào ống ly tâm 15 ml Thêm từ từ (nhỏ giọt) 10ml môi trương ấm.

DMSO có thể gây độc cho tế bào à nên thay môi trường nhanh.

Có thể thay DMSO bằng glycerol

Rã đông tế bào

Lấy mẫu đông lạnh khỏi

làm tan nhanh tinh thể đá có thể cứu được nhiều tế bào vì có thể ngăn chặn được sự tăng trưởng của tinh thể đá nhỏ thành tinh thể đá lơn hơn (tái kết tinh) trong tế bào (-5 đến -15 độ)

1 số nghiên cứu cho thấy làm ấm chậm có hiệu quả tối ưu cho các mẫu đông lạnh lậm

trong quá trình rã đông, môi trường chứa chất bảo quản thường được pha loãng trước khi loại bỏ hoàn toàn khỏi tế

bào

tế bào nhạy cảm với việc phình

ra hơn so với việc co nên việc loại bỏ chất bảo quản có thể gây hư hại tế bào nhiều hơn so

với việc bổ sung (ASTT)

tế bào bám dính, việc thao tác

rã đông đơn giản hơn với việc loại bỏ môi trường đông lạnh khỏi lớp đơn tế bào và bổ

sung môi trường nuôi tế bào mới.

huyền phù tế bào, ly tâm để tách tế bào khỏi môi trường

có chất bảo quản đông lạnh

• Bể ổn nhiệt

• Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II

• Máy ly tâm

• Tủ ủ nuôi tế bào (370C, 5% CO2)

• Ống chứa tế bào đông lạnh

• Môi trường rã đông: bao gồm môi trường cơ bản (RPMI, DMEM/F12, IMDM…) bổ sung 20- 30% huyết thanh thai bò (FBS), 1% kháng sinh- kháng nấm

• Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng

• Flask nuôi tế bào

Sau khi rã đông 1 ngày, tỷ lệ tế bào chết chiếm một số lượng đáng kể, nên thay môi

trường mới để loai bỏ tế bào chết

Các thao tác trên tế bào nên được thực hiện nhẹ nhàng để tránh gây tổn thương cho tế

bào.

Tế bào từ các bình bảo quản đông lạnh (ở nhiệt thập cực thấp) nên được chuyển ngay sang bể ổn nhiệt (370C) để tránh tối đa sự

tái kết tinh tinh thể đá

Ủ ấm môi trường nuôi tế bào ở 370C và chuyển vào tủ thao tác vô trùng

Lấy ống tế bào từ bình ni tơ lỏng, chuyển ngay vào bể ổ nhiệt ở 370C, ủ đến khi dung dịch tan băng trên 70% (tránh cho nước dính vào

nắp cryovial, có thể gây nhiễm khuẩn)

Nhẹ nhàng hút chuyển tế bào sang ống ly tâm 15 ml

Nhẹ nhàng bổ sung thêm môi trường rã đông với tốc độ 6-10 ml môi trường rã đông trong 2 phút, trộn nhẹ

Ly tâm ở tốc độ 1.500-3.000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ môi trường có chứa DMSO, thu tế bào

Tái huyền phù tế bào trong môi trường rã đông hoặc môi trường chuyên biệt

Phần tế bào còn lại trong ống ly tâm có thể sử dụng để kiểm tra tỷ lệ sống chết của tế bào