Kỹ Thuật Nuôi Cấy Sơ Cấp Tế Bào Động Vật

Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào từ mảnh mô sẽ phát triển lan ra từ vùng mô trung tâm.. KIỂU 2: NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN Là việc nuôi cấy các tế bào đơn được tách ra từ

Kỹ thuật nuôi cấy sơ cấp

tế bào động vật

Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

Khái niệm

Nuôi cấy sơ cấp (primary culture) là quá trình nuôi tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền đầu tiên (subculture) Sau đó, việc nuôi cấy được gọi là thứ cấp (secondary culture)

Hai kiểu nuôi cấy sơ cấp

KIỂU 1: NUÔI CẤY MẢNH

MÔ SƠ CẤP

Là việc nuôi cấy các mảnh

mô in vitro Trong quá trình

nuôi cấy, các tế bào từ mảnh

mô sẽ phát triển lan ra từ

vùng mô trung tâm

KIỂU 2: NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN

Là việc nuôi cấy các tế bào đơn được tách ra từ mảnh mô Trong quá trình nuôi, từng mỗi

tế bào sẽ phát triển tăng sinh thành nhiều tế bào mới

NUÔI CẤY MẢNH MÔ SƠ CẤP (mảnh mô ung thư vú)

Thu nhận tế bào đơn nhân tủy xương chuột

NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ

TẾ BÀO ĐƠN (thu từ máu cuống rốn)

Nuôi cấy

Xử

lí m

ẫu

Nuôi cấy tế bào đơn:

Tách mô thành tế bào đơn Nuôi cấy mảnh mô:Cố định mảnh mô

Thu nhận mẫu

Quy trình nuôi cấy sơ cấp

• Tùy loại mẫu mô cũng như thời gian cần thiết vận chuyển về phòng thí nghiệm: có kế hoạch vận chuyển chúng trong điều kiện thích hợp.

Xử lí mẫu đối với nuôi cấy huyền phù

tế bào đơn

Các tế bào động vật trong khối mô liên kết chặt chẽ với nhau nhờ các cầu nối hình thành giữa các tế bào với nhau

Biện pháp:

– (1) tác dụng một lực cơ học để bẻ gãy những cầu nối

– (2) dùng enzym để phân hủy các cầu nối nói trên

Cắt nhuyễn

Ép nhuyễn

Tách bằng màng lọc

Biện pháp

cơ học

Phương pháp ép nhuyễn

Ép nhuyễn mô: dùng 2 phiến lame

ép chặt mảnh mô để thu tế bào đơn đối với những mô có liên kết yếu.

Phương pháp tách bằng màng lọc

Tách bằng màng lọc tế bào (Cell

strainer): kích thước lỗ trên màng

từ 70–100 µm, chỉ cho những tế bào đơn có kích thước tương ứng qua màng.

Tách mô thành tế bào đơn bằng enzym

• Quy trình trypsin ấm

• Quy trình trypsin lạnh

Quy trình trypsin ấm

giờ Loại bỏ trypsin

ủ ống chứa mẫu mô trong 36,50C,

20 – 30 phút

Thêm môi trường, sục nhẹ nhành cho đến khi mô rời ra

Nếu các mảnh mô chưa rời ra có thể thêm môi trường để dễ huyền phù hoặc dùng màng lọc

Thu dịch huyền phù

tế bào, xác định mật độ, tiến hành

nuôi

Quy trình trypsin lạnh

Tách tế bào bằng phương pháp khác

• Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng

• Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt

Phương pháp ly tâm theo gradient tỉ trọng

• “Tế bào quan tâm là tế bào a Tế bào này nằm trong 1 khối mô rắn cùng với 3 loại tế bào

khác là b, c và d Các tế bào có tỉ trọng như

sau: a = 1,070 g/cm3, b = 1,077 g/cm3; c =

1,067 g/cm3, d = 1,080 g/cm3”.

• c = 1,067 g/cm3 > a = 1,070 g/cm3 > b = 1,077 g/cm3 > d = 1,080 g/cm3

Phương pháp tách tế bào dựa vào

marker bề mặt tế bào

Đặt mảnh mô vào dụng cụ nuôi

Mảnh mô nổi

Cố định mảnh mô Mảnh mô sống Thành công

Xử lí mẫu đối với nuôi cấy mảnh mô

Nuôi cấy

Cấy chuyền

• Hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ

• Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám dính)

• Tách các tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi

• Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới

Cấy chuyền tế bào bám dính

Nuôi cấy tế bào trong các flask nuôi cấy hay các spinner có thể được duy trì bằng cách pha loãng tương đương của huyền phù

tế bào bằng môi trường tươi:

(1) Giữ flask thẳng đứng, dùng pipette huyền phù vài lần để tách cụm các tế bào

(2) Hoặc tách một lượng huyền phù để đếm, hoặc chuyển 200µl thành 1mL huyền phù vào bình nuôi chứa 10mL môi trường

Cấy chuyền tế bào huyền phù

bioreactor