Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng: Bài 2 – TS. Vũ Bích Ngọc (2020)

Bài giảng Nuôi cấy tế bào động vật, kĩ thuật và ứng dụng: Bài 2 – TS. Vũ Bích Ngọc (2020) cung cấp những thông tin về nuôi cấy in vitro, yếu tố nào ảnh hưởng đến khả năng sống sót và tăng sinh của tế bào động vật...

Câu hỏi

yếu tố nào ảnh hưởng đến khả

năng sống sót và tăng sinh của tế bào động vật

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự thành công

của nuôi cấy tế bào

Phân chia chậm

Tăng trưởng, phân chia chậm (20-40 giờ) Hiệu suất sinh chất có hoạt tính sinh học thấp

Chu kì tế bào

Interphase (kỳ trung gian)

M Mitosis

G1 Gap1

G2 Gap2

Metaphase

• NST sắp xếp trên mặt phẳng thoi vô sắc

• Kéo dài từ 12-14 giờ

trong mô động vật có vú

• Tế bào tổng hợp DNA,

tạo protein và gia tăng

kích thước

o Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi chu kì

tế bào và không phân chia (2n đơn)

o Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước,

tổng hợp RNA, robosomes và protein,

có 1 G1 Checkpoint (5-6 giờ) (2n đơn)

o S Phase: nhân đôi DNA (2n kép)

o Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục phát

triển, hình thành thoi vô sắc, sản xuất

các protein mới Có 1 G2 Checkpoint

• Là điểm quan trọng quyết

định sự phân chia của tế

• Khi tế bào vượt qua điểm này,

đi vào phase S, quá trình

phân chia không thể đảo

ngược.

Điểm kiểm soát G1

• Đảm bảo tế bào phân chia thuận lợi

• Nếu tế bào bị lỗi hoặc tổn thương, G2 checkpoint sẽ dừng lại để sửa chữa

• Nếu tổn thương không thể đảo ngược, tế bào đi vào quá trình apoptosis à đảm bảo DNA hư hỏng tế bào không truyền cho thế hệ sauà quan trọng trong ngăn ngừa ung thư

Điểm kiểm soát G2

Pha phân bào (M)

M Mitosis

G1 Gap1

G2 Gap2

Metaphase

• NST sắp xếp trên mặt phẳng thoi vô sắc

• Tế bào chia thành 2

tế bào giống nhau.

• Mitosis thường xảy

Điểm kiểm soát thoi vô sắc

Pha phân bào (M)

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DNA BẰNG FCM

Tính chất cần giá đỡ

-TB bám vào giá đỡ để có thể sống sót, phân chia

- Ngoại trừ: hồng cầu, TB ung thư, 1 số dòng TB liên tục

Tính cơ học yếu

Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

Dung hợp, biến nạp, tải nạp… à tế bào thay đổi kiểu gen và kiểu hình

• Ở mỗi tế bào phân chia,

sự tự làm mới và biệt hoá được quyết định bởi

tương tác của yếu tố bên trong và tín hiệu hướng dẫn hoặc tín hiệu chọn lọc bên ngoài

Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

Bảo quản tế bào

• Lưu trữ tế bào được cả triệu năm

• Tế bào giữ nguyên độ tuổi tại thời điểm

đông lạnh

Các yếu tố ảnh hưởng

đến sự thành công của

nuôi cấy tế bào (tăng sinh

invitro)

SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ BÀO

– phụ thuộc vào trạng thái tự nhiên của tế bào:

• Vai trò của bộ gen – Giới hạn Hayflick

• Vai trò của sự biểu hiện gen– phụ thuộc Môi trường nuôi cấy

Vai trò của bộ gen -giới hạn HayFlick

Leonard Hayflick (1965)

Tế bào phân chia 50-

70 lần

4/20/20 ngocvu@sci.edu.vn

Vai trò của bộ gen

Chiều dài telomere giảm

theo tuổi

1

Hoạt tính của telomerase cao nhất ở các pass đầu tiên

2

Mức độ hoạt động của telomerase khác nhau giữa các loài và các nguồn thu: giảm nhiều nhất ở rASC và

hBMMSC

3

Izadpanah R, Trygg C, Patel B, et al Biologic Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived

Thời gian nhân đôi của rBMMSC không thay đổi

trong suốt quá trình nuôi trong khi ở hASC, rASC,

hBMMSC thời gian này tăng gấp 2

Izadpanah R, Trygg C, Patel B, et al Biologic Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived

From Bone Marrow and Adipose Tissue Journal of cellular biochemistry 2006;99(5):12854/20/20 ngocvu@sci.edu.vn

Duy trì tính đa tiềm năng của tế bào

Các yếu tố khác (bổ sung từ ngoài): định hướng sự biệt hoá của tế bào

BMP-6, TGF-β3, dexamethasone, ascorbate phosphate, proline, pyruvate, insulin, transferrin, selenous acid, 5aza-cystidine

proteoglycan • Phức hợp nối chặt (Tight junctional complex)

trong tế bào biểu mô cho sự tương tác tế bào-tế bào.

kích thích sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự

thành công của nuôi cấy tế bào

Tế bào thích hợp Điều kiện thích hợp

Phase rắn

• Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển

eg glass, plastic, collagen, agarPhase lỏng

• Các đặc tính sinh lí và lí hóa của thànhphần môi trường nuôi

Phase khíNhiệt độ

Độ vô trùng của môi trường

Pha rắn

• Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và

di chuyển

• Dụng cụ phổ biến nhất là polystyrene plastic

• Những cơ chất khác như glass, filter wells

by cell contact and substance secreted

• Neurons on glial cell feeder layers

Phase lỏng

• Thành phần của môi trường

– Muối vô cơ

• Cân bằng áp suất thẩm thấu

• Điều hòa điện thế màng: sodium, potassium và calcium ions

• Cần thiết cho sự bám dính như enzyme cofactor

– Carbohydrate

• Hầu hết chứa 4-20 mM glucose

• Nguồn năng lượng: glycolysis

4/20/20 ngocvu@sci.edu.vn

Phase lỏng

– Proteins and Peptides

• Được sử dụng để thay thế hiện diện trong huyết thanh eg transferrin, fibronectin

– Amino acids

• Quan trọng cho sự tăng sinh và biệt hóa

• glutamine có thể đi vào chu trình Kreb’s cycle– Fatty Acids and Lipid

• Quan trọng trong môi trường serum free media e.g cholesterol and steroids cần thiết cho các tế bào đặc biệt

Phase lỏng

– Vitamin

• vitamins B cần thiết cho sự phát triển và sự tăng sinh

• Tiền chất cho các co-factors

• Vitamins thường sử dụng là thiamine, riboflavin and biotin– Trace Element

• zinc, copper, selenium và tricarboxylic acid

• Selenium là chất khử độc và giúp tách các gốc O2 tự do

4/20/20 ngocvu@sci.edu.vn

Phase lỏng

– Hệ đệm

• Hầu hết các tế bào cần pH tối ưu: 7.2 - 7.4

• Kiểm soát pH cần thiết cho nuôi cấy tối ưu:

– Hệ thống đệm bicarbonate/CO2– Hệ đệm hóa chất: HEPES

• Môi trường nuôi cấy thương mại như pH indicator

– vàng (acid) hay hồng (alkali)– Áp suất thẩm thấu

• Tương tự áp suất thẩm thấu của huyết tương (300 mOsm/kg)

Phase lỏng

– Huyết thanh

• Nhân tố không xác định: albumins, growth factors và growth inhibitors

• Gia tăng khả năng đệm

• Tăng khả năng bám dính và trung hòa chất độc

• Quan trọng cho các tế bào phát triển chậm hay khi nuôi mật độ thấp

• Biến thiến từng mẻ

• Huyết thanh bất họat nhiệt (incubation at 56ºC for 30 minutes) có thể giúp giảm rủi ro nhiễm

4/20/20 ngocvu@sci.edu.vn

Phase khí

• Quan trọng cho hệ đệm

– 5-10% CO2– Sản xuất sản phẩm: pyruvate

NAD+ NADH

+ CO2

Pyruvate Dehydrogenase

pyruvate acetyl-CoA

Hình dạng tế bào khi nuôi

• Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính:

– Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào)

• Dòng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma)

– Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi

• Tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal, fibroblasts

Hela-Epithelial

BAE1-Endothelial

Nhiệt độ

– Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào loài

• Nhiệt độ cơ thể mà tế bào được thu nhận

• Nhiệt độ của của vùng mô thu nhận tế bào (skin temperature may be lower than the rest of the body)

4/20/20 ngocvu@sci.edu.vn