Bài Giảng Kĩ Thuật Nuôi Cấy Sơ Cấp Tế Bào Động Vật

Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào từ mảnh mô sẽ phát triển mọc lan ra từ vùng mô trung tâm.. - Kĩ thuật nuôi cấy mô thường tiến hành đối với các mẫu mô có tế bào phát triển kém, số lư

Kĩ thuật nuôi cấy sơ cấp

tế bào động vật

Primary Cell Culture

Nuôi cấy sơ cấp là gì?

Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền đầu tiên (subculture) Sau đó việc nuôi cấy được gọi là thứ cấp (secondary culture).

Các kiểu nuôi cấy sơ cấp

KIỂU 1: NUÔI CẤY MÔ SƠ CẤP

- Là việc nuôi cấy các mảnh mô in vitro Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào từ mảnh mô sẽ phát triển mọc lan ra từ vùng mô trung tâm

- Kĩ thuật nuôi cấy mô thường tiến hành đối với các mẫu mô có tế bào phát triển kém, số lượng mẫu lớn và khá đơn giản

KIỂU 2: NUÔI CẤY SƠ CẤP HUYỀN PHÙ TẾ BÀO ĐƠN

-Là việc nuôi cấy các tế bào đơn được tách ra từ mảnh mô Trong quá trình nuôi, mỗi tế bào sẽ phát triển tăng sinh thành nhiều tế bào mới

- Kĩ thuật này thường áp dụng cho nuôi cấy các mảnh mô với tế bào phát triển mạnh, số lượng mẫu lớn, nhiều giai đoạn

Thu nhận mẫu và xử lý sơ bộ

Bước 1:

Thu nhận mẫu mô

Nguồn mẫu: từ cơ quan, cơ thể

Quy trình:

1 Thu nhận

2 Làm sạch

3 Bảo quản, vận chuyển về phòng thí nghiệm

4 Xử lý sơ bộ: khử nhiễm, loại bỏ phần thừa, cắt nhỏ để chuẩn bị cho thao tác nuôi cấy

Xử lý sơ bộ mẫu mô bao gồm rửa nhiều lần bằng dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh (thường là gentamicin hay penicillin và streptomicin), kháng nấm (fungizone).

Sau đó cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa (như mỡ…)

Mẫu mô cần được cắt nhỏ ra thành từng mảnh (2 - 3 mm2) Các m nh m ả ơ này có thể được sử dụng để nuôi (phát triển sơ cấp mảnh mơ – primary explant tissue culture), hoặc sử dụng để tách rời thành các tế bào đơn sau đó

Tách rời tế bào, xác định mật độ tế bào

Bước 2:

Cắt nhuyễn mô

Tách tế bào bằng cách ép nhuyễn mô

Bộ màng lọc tế bào

Tách tế bào bằng enzyme

Các cầu nối gian bào

Các enzyme thường được sử dụng

Cầu nối gian bào có bản chất là protein (các tế bào liên kết với nhau và với ECM), do vậy các protease sử dụng để tách tế bào là những enzyme

thuỷ phân protein như:

QUY TRÌNH TRYPSIN ẤM

QUY TRÌNH TRYPSIN LẠNH

(1) Cắt mô thành các mẫu 3 - 4 mm2 và rửa mẫu nhiều lần bằng PBS vô trùng.

(2) Sau khi rửa sạch mẫu, loại bỏ phần PBS rửa mẫu lần cuối và thay thế bằng trypsin 0,25% (1 ml trypsin 0,25% cho mỗi 100 mg mô).

(3) Đặt mẫu ở 4oC trong vòng 6 - 18 giờ

(4) Cẩn thận loại bỏ trypsin sao cho lượng trypsin còn lại ít nhất.

(5) Ủ ống chứa mô ở 36,5oC trong 20 - 30 phút.

(6) Thêm vào môi trường đã được ủ ấm, khoảng 1 ml môi trường cho mỗi 100 mg mô, dùng pipette nhẹ nhàng sục lên xuống cho đến khi mô hoàn toàn rời ra.

(7) Nếu một số mảnh mô vẫn chưa rời nhau, tiến hành lọc bằng cell strainer Trường hợp còn mảnh mô lớn, tăng thể tích môi trường lên 2 ml cho mỗi 100 mg mô để dễ dàng tiến hành thao tác sục bằng pipette và tách hoàn toàn mô.

(8) Thu dịch chứa tế bào và xác định mật độ tế bào bằng phòng đếm hồng cầu Tiến hành nuôi cấy, sao cho mật độ tế bào ban đầu đạt khoảng

106 tế bào/ml.

QUY TRÌNH TRYPSIN LẠNH

TÁCH TẾ BÀO BẰNG PHƯƠNG PHÁP LY TÂM THEO GRADIENT TỶ TRỌNG

Một số môi trường ly tâm theo gradient tỷ trọng thường sử dụng: Percoll, Ficoll…

Phương pháp này đã được dùng để phân tách tinh trùng, hay các tế bào đơn nhân trong máu.

-Bao phủ bề mặt mỗi tế bào trong cơ thể là những protein đặc biệt gọi là receptor

-Receptor có khả năng liên kết hay đính một cách đặc hiệu với những phân tử tín hiệu

-Có rất nhiều receptor, chúng khác nhau ở cấu trúc và ái lực với những phân tử tín hiệu

-Bình thường, tế bào sử dụng những receptor và những phân tử tín hiệu như là cách để truyền đạt thông tin với những tế bào khác, và tiến hành

những chức năng riêng của chúng trong cơ thể

-Trong phương pháp này, những receptor bề mặt tế bào đóng vai trò là marker của nó.

Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt

NUÔI CẤY MẢNH MÔ

Đặt mảnh mô vào dụng cụ nuôi có môi trường nuôi

PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH MẢNH MÔ

PHƯƠNG PHÁP 1: Dùng lamel vô trùng đè lên trên mảnh mô

PHƯƠNG PHÁP 2: Cố định mô bằng huyết thanh

Mảnh mô

Đĩa nuôi cấy

Huyết thanh

PHƯƠNG PHÁP 3: Tăng sự kết dính & lật ngược bình nuôi

Cho mảnh mô tiếp xúc với huyết thanh khoảng 2

– 6 giờ

Đảo ngược bình nuôi qua đêm

Bổ sung môi trường nuôi cấy và nuôi bình thường

PHƯƠNG PHÁP NUƠI CẤY TẾ BÀO ĐƠN

(1)Dùng pipetman hút vào 4 eppendorf, mỗi cái 1 ml dịch tách tế bào.

(2) Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi.

(3) Cho vào mỗi eppendorf 1 ml môi trường nuôi, huyền phù tế bào bằng vortex.

(4) Hút dịch huyền phù tế bào ở 4 eppendorf cho vào một bình nuôi cấy (bình Roux) và bổ sung 1-2 ml môi trường.

(5) Ủ ở 37,5oC trong tủ nuôi, sau 24 giờ thay môi trường mới và tiếp tục ủ.

Sau lần nuôi cấy sơ sẽ cấp thu được các tế bào sơ cấp

CẤY CHUYỀN (SUBCULTURE)

Cấy chuyền bao gồm các thao tác sau:

- Tách bỏ môi trường nuôi cấy cũ.

- Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám).

- Tách các tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi

- Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới.

CẤY CHUYỀN TẾ BÀO BÁM DÍNH

(2) Rửa dụng cụ nuôi với PBS (5 ml/ bình Roux 25 cm2).

(3) Bổ sung dung dịch trypsin (2–3 ml/ bình Roux 25 cm2).

(4) Ủ trong tủ ấm 370C

(5) Khi các tế bào đều có hình tròn và nổi lên trên bề mặt dung dịch, tiến hành huyền phù với môi trường có bổ sung huyết thanh (5 ml/ bình Roux 25 cm2), và rửa tế bào bằng cách ly tâm ở 800 vòng/ phút trong 5–10 phút

Tiếp theo, tái huyền phù bằng môi trường nuôi (5 ml/ bình Roux 25 cm2) Bước này có thể bỏ nếu như tỷ lệ pha loãng cao (>1:50) trong môi trường có chứa huyết thanh Tỷ lệ pha loãng được đề nghị là 1:4.

Nuôi cấy các tế bào trong các flask hay các spinner có thể được duy trì bằng việc pha loãng một lượng tương đương của huyền

(1) Giữ flask đứng thẳng, dùng pipette huyền phù vài lần tách rời các cụm tế bào

trường phát triển Nếu tỷ số pha loãng 1/10, thể tích thích hợp của huyền phù tế bào sẽ được đặt vào ống ly tâm 15 ml, pha loãng thành 10 ml bằng môi trường, sau đó ly tâm ở 900 vòng/ phút, trong vòng 3 – 4 phút Tái huyền phù cặn vón vào môi trường tươi và lấy một thể tích tương đương lượng tế bào mong muốn vào các bình, tiến hành nuôi

CẤY CHUYỀN TẾ BÀO HUYỀN PHÙ

Hình ảnh minh họa

Phân lập phôi chuột và nuôi cấy tế bào

Thu nhận phôi gà từ trứng