Đề tài: Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và ứng dụng pot

Tế bào động vật tách từ mô có thể được nuôi cấy trên các loại môi trườngdinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cách tăng sốlượng và kích thước tế bào.. Kỹ thuật nuô

PHẦN I: MỞ ĐẦU

I Đặt vấn đề:

Thế kỷ 21 là thế kỷ của CNSH, nó sẽ xâm nhập vào mọi lĩnh vực của đờisống Với sự tiến bộ vượt bật của khoa học ngày nay, ngày càng có nhiều sảnphẩm cải tiến phục vụ cho cuộc sống được ứng dụng từ công nghệ sinh học.Điều này có thể thấy qua những kết quả nghiên cứu đã được công bố của cácnước trên thề giới

Trong vòng 30 năm qua, chúng ta chứng kiến những thành tựu đáng kinhngạc của sinh học và công nghệ sinh học cả trong nghiên cứu cơ bản lẫn nghiêncứu ứng dụng Nó không chỉ thành công trong việc khám phá những bí ẩn của

sự sống giúp con người nhìn nhận bản chất thế giới quan sinh học rõ ràng minhbạch, mà sự thành công của sinh học và công nghệ sinh học còn nằm ở chỗ nótạo ra những sản phẩm chuyên về sinh – y – nông nghiệp – công nghệ sinh họcvới đủ mọi cấp độ quy mô Từ sự phát triển này, con người đã thừa hưởng nhiềuthành quả không thể chối cãi: những công cụ chẩn đoán bệnh tật hiệu quả, cáckhuynh hướng giải quyết các vấn đề môi trường, nông nghiệp Đi sâu hơn vàobản chất của sự thành công này, chúng ta không thể “quên ơn” những nghiêncứu từ trong phòng thí nghiệm [2]

Và nếu đặt câu hỏi “Công cụ nào trong phòng thí nghiệm đóng vai trò quantrọng trong các nghiên cứu ?” Có thể dễ dàng tìm thấy câu trả lời từ những nhànghiên cứu sinh y công nghệ sinh học: tế bào và nuôi cấy tế bào là công cụ quantrọng hầu như không thể thiếu trong các nghiên cứu Quả thật không thể nói hếtcông lao của tế bào và kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong nghiên cứu y sinh côngnghệ sinh học ngày nay Chỉ dám nói rằng: Không có chúng, sẽ không có ngànhsinh học hiện đại và công nghệ sinh học

Tế bào động vật tách từ mô có thể được nuôi cấy trên các loại môi trườngdinh dưỡng tổng hợp bên ngoài cơ thể, chúng sinh trưởng bằng cách tăng sốlượng và kích thước tế bào Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đã tạo cơ hội đểnghiên cứu các tế bào ung thư, phân loại các khối u ác tính, mô hình thựcnghiệm để khảo sát tác động của hóa chất, xác định sự tương hợp của môtrong cấy ghép và nghiên cứ u các tế bào đặc biệt cùng sự tương tác của chúng.Vấn đề nuôi cấy tế bào nói chung và nuôi cấy tế bào động vật nói riêngđang ngày càng được dư luận thế giới quan tâm hết mức trên nhiều phương diện

khác nhau, cả về lợi ích lẫn những tác hại có thể vô cùng to lớn mà hiện nayngười ta chưa lường hết được.

Nhằm bổ sung cho mình những kiến thức mới về kỹ thuật nuôi cấy tế bàocũng như xem xét những thành tựu mà kỹ thuật này đã đem lại, được sự hướngdẫn và cho phép của thầy giáo Ngô Đắc Chứng, tôi đã quyết định tìm hiểu về đề

tài: “Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và ứng dụng” Do thời gian hạn chế,

chắc chắn đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, mong quý thầy cô và bạnđọc thông cảm và góp ý để đề tài này được hoàn thiện hơn

II Phương pháp tiếp cận và phạm vi của đề tài

- Mặc dù hiện nay kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã được thực hiện trên rất nhiềuđối tượng khác nhau như vi sinh vật, thực vật, động vật thậm chí cả con người.Mỗi đối tượng khác nhau thì kỹ thuật nuôi cấy tế bào có sự khác biệt lẫn nhau.Nhưng trong phạm vi của đề tài này chúng tôi chỉ xin trình bày về kỹ thuật nuôicấy tế bào trên đối tượng động vật (bao gồm cả trên con người) và những ứngdụng của nó

- Để thực hiện đề tài này tôi đã sưu tầm thông tin, hình ảnh từ các nguồnkhác nhau như giáo trình, bài giảng, tạp chí, các phương tiện thông tin đạichúng, internet,… các tài liệu và hình ảnh sưu tầm được qua việc phân tích sosánh từ nhiều nguồn để đảm bảo tính chính xác và tổng hợp thành bài viết này

PHẦN II: NỘI DUNG

I Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào là tổ hợp các thao tác kỹ thuật nhằm tạo ra những cơquan, bộ phận hoặc cơ thể hoàn chỉnh từ một hay một số tế bào ban đầu Kỹthuật này có sự khác nhau đối với các đối tượng khác nhau: Vi sinh vật, thực vật

và động vật do đặc điểm riêng biệt của từng loại tế bào

1 Tế bào động vật và cơ sở của việc nuôi cấy tế bào động vật

Tế bào động vật trong cơ thể trưởng thành hầu như ít biểu hiện tính toànnăng, có quá trình chết theo chu trình, rất nhạy cảm với môi trường, tốc độ sinhsản chậm,… vì thế rất khó để nuôi cấy một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào của

cơ thể trưởng thành Các tế bào động vật là tế bào eukaryote, chúng được liênkết với nhau bởi các nguyên liệu gian bào để tạo thành mô Mô động vật thườngđược phân chia theo 4 nhóm: biểu mô (epithelium), mô liên kết (connectivetissue), mô cơ (muscle)và mô thần kinh (nerve) Biểu mô tạo thành lớp phủ vàlớp lót trên các bề mặt tự do của cơ thể, cả bên trong và bên ngoài Ở mô liênkết, các tế bào thường được bao bọc trong thể gian bào rộng (kéo dài), đó có thể

là chất lỏng, hơi rắn hoặc rắn Các tế bào mô cơ thường thon dài và được gắnvới nhau thành một phiến hoặc một bó bởi mô liên kết Mô cơ chịu tráchnhiệm cho hầu hết chuyển động ở động vật bậc cao Các tế bào mô thần kinhgồm có thân tế bào chứa nhân và một hoặc nhiều phần mở rộng dài và mảnhđược gọi là sợi Các tế bào thần kinh được kích thích dễ dàng và truyền xungđộng rất nhanh.[3]

1.1

C ác t ế bà o dị c h hu y ề n ph ù

Tế bào hồng cầu và bạch huyết là các mô liên kết không điển hình dạngthể lỏng Các tế bào máu hoặc dịch bạch huyết là các tế bào dịch huyền phù

(suspension cells), hoặc không dính bám khi chúng sinh trưởng trong nuôi cấy in

vitro Các tế bào không dính bám không đòi hỏi bề mặt để sinh trưởng.

Chẳng hạn, các tế bào bạch huyết (lymphocytes) (Hình 1a) bắt nguồn từ môbạch huyết là các tế bào không dính bám và có hình cầu đường kính từ 10-20 µm.Chúng có thể được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng theo phương thức tương

tự vi khuẩn

1.2 Các tế bào dính bám

Hầu hết các tế bào động vật bình thường là các tế bào dính bám, vì thế chúng

cần có bề mặt để gắn vào và sinh trưởng Trong các ứng dụng, người ta sử dụngrộng rãi các loại tế bào dính bám là tế bào biểu mô và nguyên bào sợi (fibroblast)(Hình 1b và c) Các tế bào dính bám cần có một bề mặt ẩm để sinh trưởng như làthủy tinh hoặc plastic Đĩa petri hoặc các chai trục lăn là các loại được sử dụngrộng rãi nhất Các chai được đặt nằm trên một trục lăn quay tròn chậm trong tủ

ấm Chai có dung tích 1 l chứa khoảng 100 ml môi trường là thích hợp cho các tếbào vừa sinh trưởng trên thành chai vừa tiếp xúc với môi trường và không khí Tuynhiên, chai trục lăn chỉ dùng cho quy mô phòng thí nghiệm vì diện tích bề mặt trênmột đơn vị thể tích của chai nuôi cấy khá nhỏ (500 cm2/l)

Hình 1: Các tế bào động vật thường được sử dụng trong nuôi cấy.

(a) tế bào bạch huyết, (b) tế bào biểu mô, (c) nguyên bào sợi

Tỷ lệ diện tích/thể tích có thể được tăng lên khi các tế bào sinh trưởng trêncác giá thể là polymer bọt biển (spongy), thể gốm (ceramic), các sợi rỗng, bao vithể (microcapsule), hoặc trên các hạt nhỏ có kích thước hiển vi gọi là microcarrier.[3]

2 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

Năm 1907, Harrison là người đầu tiên đã nuôi cấy thành công một mảnh

mô phôi ếch trong dịch bạch huyết với kỹ thuật “giọt treo” (Hanging drop).

Năm 1923, Carel đã hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong các bình thủy tinh(in vitro), dễ tiệt trùng và tạo điều kiện cho tế bào phát triển tốt Nhưng phải chờđến những năm 1960, khi hoàn thiện được môi trường nuôi cấy nhân tạo thì kỹthuật nuôi cấy tế bào động vật mới được phát triển mạnh và được ứng dụng vàonhiều ngành công nghệ sinh học.[5]

2.1 Môi trường nuôi cấy

Vấn đề quan trọng bậc nhất trong nuôi cấy tế bào động vật là môi trườngnuôi cấy phải đủ chất dinh dưỡng, nhân tố sinh trưởng, độ pH và nồng độ muối

ổn định, đồng thời phải có hệ thống thải bỏ các sản phẩm trao đổi độc hại để tếbào có thể sống và phát triển được Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vậtlớn hơn vi sinh vật do, không giống các vi sinh vật, động vật không trao đổi chất

nitrogen vô cơ Vì thế, nhiều amino acid và vitamin cần phải được bổ sung vàomôi trường Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy tế bào động vật bao gồmcác amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh trưởng, muốikhoáng và glucose Ngoài ra, môi trường cần được cung cấp từ 2-20% (theo thểtích) huyết tương của động vật có vú Mặc dù huyết thanh có thành phần chưađược xác định đầy đủ, nhưng nhiều nghiên cứu đã cho thấy nó rất cần thiết cho

sự phát triển và tồn tại của tế bào trong nuôi cấy

2.1.1 Môi trường hóa chất

Huyết thanh dùng trong môi trường nuôi cấy không chỉ đắt tiền mà còn lànguồn nhiễm bẩn virus và mycoplasma Do bản chất hóa học của huyết thanhchưa được xác định đầy đủ nên trong một số trường hợp có thể ảnh hưởng xấuđến kết quả nuôi cấy Sự hiện diện của nhiều protein khác nhau trong huyếtthanh cũng có thể làm phức tạp các quá trình phân tách và tinh sạch đầu ra Vì lý

do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xây dựng công thức môi trườngkhông có huyết thanh Những công thức này chứa các hormone và các nhân tốsinh trưởng được tinh sạch để thay thế cho huyết thanh

Môi trường hóa chất được sáng chế từ những năm 1950 đã thay thế hoàntoàn cho các dịch sinh học như dịch chiết từ phôi gà, huyết tương,… Môi trườnghóa chất được điều chế hàng loạt, cất giữ được lâu, dễ thay thế, thêm, bớt cácchất cần thiết, ít bị lây nhiễm… Môi trường nuôi cấy có chứa đủ các chất dinhdưỡng (Cacbonhydrat, acid amin, vitamin, nguyên tố vi lượng, hormon, nhân tốsinh trưởng) Hiện nay, người ta dùng một số môi trường nuôi cấy như môitrường Eagle, môi trường Dulbecco,…

Môi trường nuôi cấy phải đẳng trương để duy trì cân bằng áp suất thẩmthấu Người ta thường dùng bicacbonat để tạo hệ đệm kết hợp với hệ làm giàu

CO2 môi trường (5-10% CO2/95% không khí) trong đó tế bào được nuôi Độ pHthích hợp là 7,4 Người ta thường sử dụng đỏ phenol để kiểm tra độ pH của môitrường, nếu môi trường chuyển dần từ đỏ sang vàng cam thì tế bào phát triển tốt,nếu chuyển sang vàng nhạt là môi trường bị nhiễm khuẩn

2.1.2 Nhân tố sinh trưởng

Nếu không có nhân tố sinh trưởng thì tế bào động vật sẽ không phát triển.Người ta thường phải bổ sung huyết thanh bê vào môi trường nuôi cấy (10-15%)

vì trong huyết thanh có chứa nhân tố sinh trưởng Nhưng dùng huyết thanh vừa

đắt tiền lại vừa dễ bị nhiễm khuẩn cho nên ngày nay người ta thường dùng cácchất bổ trợ để thay thế cho huyết thanh như: insulin, transferin, ethanolamin,…hoặc sử dụng lớp tế bào nuôi.

2.1.3 Các chất kháng sinh

Các chất kháng sinh như penecillin, streptomicin hoặc amphotericin Bthường được dùng để chống nhiễm khuẩn cho mẻ cấy Tuy nhiên, các chấtkháng sinh thường độc vì vậy phải dùng với liều lượng thích hợp và phải kếthợp với quy trình tiệt trùng chu đáo.[2]

Bảng 1 Thành phần môi trường Eagle (1959).[3]

Hình 1: Môi trường nuôi cấy

(*Nguồn: Website của ĐH Nông nghiệp 1 Hà Nội)

2.2 K ỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất cácsản phẩm sinh - dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lênmen Từ lâu, hệ lên men đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men.Đầu tiên, sự lên men là thuật ngữ dùng cho sản xuất cồn Sau đó, các nhà vi sinhvật học ứng dụng các nguyên tắc trên để tách chiết các vitamin, các acid hữu cơ

và các kháng sinh… Kết quả dẫn đến sự phát triển nhanh chóng các phươngpháp và các hệ thống lên men khác nhau

Các nguyên lý tương tự sau đó được ứng dụng cho nuôi cấy sinh khối tếbào động vật và thực vật Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vậtkhó khăn hơn nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi chấttrong các loại tế bào này diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinhtrưởng chậm của tế bào Các tế bào động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạphơn so với vi khuẩn và nấm men, chúng không có thành tế bào như vi khuẩn vìthế rất dễ biến dạng và vỡ Do đó, các hệ thống khuấy và sục khí được thiết kếkhác với nuôi cấy vi khuẩn Mặc dù có một số điểm không thuận lợi, nhưng hệthống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật ít nhất cũng vàichục năm trước đây Các dòng tế bào khác nhau như BHK-21, LS, các tế bào

Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theo phương thức nuôi cấychìm ngập trong môi trường để sản xuất các viral vaccine và các sản phẩm khác.Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phụcbằng cách đưa vào các cánh khuấy có dạng hình mái chèo Việc cung cấp khítrực tiếp có thể tạo ra bọt khí dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp khí bằngcách khuếch tán thông qua ống silicone Môi trường chứa nhiều protein huyếtthanh có khả năng gây ra hiện tượng tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ Đốivới nuôi cấy mật độ cao, cần cung cấp thêm oxygen Phương pháp dùng ốngsilicone để sục khí có nhiều ưu điểm do không tạo ra bọt khí và tốc độ truyềnoxygen là thỏa đáng.

Như vậy, các hệ lên men vi sinh vật được cải tiến thích hợp có thể dùng đểnuôi cấy sinh khối các tế bào động vật sinh trưởng trong dịch huyền phù Nếumuốn nuôi cấy một dòng tế bào dính bám thì nên dùng một hệ thống chất mangnhư là microcarrier

Các dòng tế bào động vật có vú thường được sử dụng trong nuôi cấy làCHO4, NS05, BHK6, HEK-2937 và tế bào võng mạc của người

Người ta có thể sử dụng tế bào tự do (bạch cầu, limpho,…) hoặc tế bào của

mô để nuôi cấy Mô được phẩu thuật trong môi trường vô trùng, cắt thành mảnhnhỏ và được xử lý bằng enzyme kết hợp với kỹ thuật nghiền mô để tách thành tếbào riêng biệt ở dạng huyền phù Trong môi trường nuôi cấy, các tế bào tự dothường ở dạng huyền phù, còn tế bào mô thường bám vào đáy bình thành lớp.Người ta sử dụng buồng đếm hoặc máy đếm tự động để tính toán số lượng tếbào theo từng giai đoạn phát triển

Người ta có thể thực hiện các mẻ cấy liên tục bằng cách trích một phần mẻcấy trước để cấy chuyền vào môi trường mới, nếu là mẻ bám thì phải sử dụngenzyme để tách riêng tế bào và phải làm rất nhanh trong vòng 15 phút vì enzyme

có thể gây hại cho tế bào.[2]

2.2.1 Nuôi cấy sơ cấp

Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấychuyền đầu tiên (subculture)

Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là một hỗn hợp các dòng

tế bào khác nhau, hoặc chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế bàoquan tâm và những tế bào khác (được gọi là tế bào nhiễm) Có thể loại bỏ các tếbào nhiễm bằng cơ học hay enzyme khi tách mô hay bằng cách duy trì các điều

kiện chọn lọc dương tính cho sự sống sót của một kiểu tế bào quan tâm cần thunhận.

Hình 2: Sơ đồ nuôi cấy sơ cấp (*Nguồn:CNSH trên người và động vật )

Thu nhận mẫu mô

Cắt nhỏ (Chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)

Cắt nhỏ

(Mảnh nhỏ để nuôi) Tách TB bằng cơ học(nghiền, ép) Tách TB bằng enzyme(ủ,…)

Nuôi mẫu mô sơ cấp

Qui trình nuôi cấy sơ cấp gồm:

- Bước 1: Thu nhận mô (tươi hoặc đông lạnh) có chứa tế bào sống

- Bước 2: Phẫu tích và (hoặc) tách rời tế bào, xác định nồng độ

- Bước 3: Nuôi cấy tế bào

2.2.1.1 Thu nhận mẫu và xử lý sơ bộ

Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kỳ mô nào của cơ thể, trước khi lấyphải làm sạch mô tại vị trí lấy, đưa mô vào bảo quan trong dung dịch DPBS,nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm

Xử lí mẫu sơ bộ bao gồm rửa nhiều lần bằng dung dịch PBS có bổ sungkháng sinh, kháng nấm, sau đó cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa,… mẫu môcần được cắt nhỏ thành từng mảnh 2-3 mm2

2.2.1.2 Tách rời các tế bào

Có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như:

- Tách tế bào bằng cơ học: nghiền, ép

- Tách tế bào bằng cách ủ với enzyme trypsin hay collagenase

- Tách tế bào bằng phương pháp li tâm theo gradient tỷ trọng

- Tách tế bào bằng phương pháp dựa vào marker bề mặt

Kết quả của giai đoạn này thu được dịch tách tế bào

2.2.1.3 Nuôi cấy

- Dùng pipetman hút vào bốn eppendorf, mỗi cái 1 ml dịch tách tế bào

- Li tâm 1000 vòng/ph trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi

- Cho vào mỗi eppendorf 1 ml môi trường nuôi, huyền phù tế bào bằngvortex

- Hút dịch huyền phù tế bào ở bốn eppendorf cho vào một bình nuôi cấy(bình Roux) và bỏ sung 1ml môi trường

- Ủ ở 37,50C trong tủ nuôi, sau 24h thay môi trường mới và tiếp tục ủ.Sau lần nuôi cấy sơ cấp sẽ thu được các tế bào sơ cấp Đối với trường hợplượng mẫu mô quá ít, người ta nuôi cấy nguyên mảnh mô để thu nhận tế bào sơcấp.[4]

2.2.2 Đời sống tế bào động vật trong nuôi cấy

Tế bào mô động vật, đặc biệt là động vật có vú có đặc điểm là khi nuôi cấy,

dù là cấy chuyền chỉ qua được 50 thế hệ, sau đó chúng thoái hóa và chết Số thế

hệ tế bào tùy thuộc vào độ biệt hóa của mô mà ta lấy tế bào Đối với tế bào gốc

thì khả năng sinh trưởng sẽ dài hơn so với tế bào biệt hóa, tế bào gốc phôi cókhả năng sinh trưởng dài hơn tế bào gốc cơ thể trưởng thành Tuy vậy, người ta

đã tạo ra được các dòng tế bào “bất tử” tức là tế bào có khả năng sinh trưởngliên tục trong môi trường cấy chuyền Đó chính là các tế bào ung thư của cơ thểhoặc là dạng tế bào được làm chuyển dạng “ung thư hóa” với những biến đổi ditruyền Sự chuyển dạng thường được thực hiện nhờ tác nhân gây đột biến, nhờvirut, nhờ gen ung thư,… Ngày nay, người ta đã nuôi cấy và cất giữ nhiều dòng

tế bào “bất tử” nhân tạo như các dòng tế bào chuột, chuột Hamster TQ, khỉ,…hoặc lấy từ cơ thể từ các mô ung thư tế bào Hela (tế bào ung thư cổ tử cung) hay

tế bào Namalwa (tế bào ung thư limphoma của một phụ nữ có tên là Namalwa)

2.2.3 Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy.

Sự sinh trưởng của tế bào động vật in vitro thường trải qua 3 pha:

- Pha chậm (Lag phase) là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trườngnuôi cấy cho đến khi tế bào bắt đầu phát triển Thời gian này dài hay ngắn tùythuộc vào trạng thái biệt hóa của mô được trích tế bào

- Pha tiến triển (exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia liên tục,tăng nhanh số lượng tế bào trong khoảng thời gian từ 15 – 25 giờ với số lượng tếbào đạt 1-2 x 106/cm3, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ

- Pha dừng (Stationary phase) là giai đoạn sau pha tiến triển, trong đó sốlượng tế bào không thay đổi, tức là khi môi trường dinh dưỡng nghèo dần và bắtđầu tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc hại Bắt đầu xuất hiện tự hoại tế bàothể hiện ở chổ nhân bị đứt chẻ và trên bề mặt tế bào tạo thành các mảnh khối cóthể quan sát được dưới kính hiển vi Muốn cho tế bào tiếp tục sinh trưởng cầnthực hiện các mẻ cấy chuyền với môi trường mới

2.2.4 Các phương thức nuôi cấy

Phương thức nuôi cấy đơn giản nhất là nuôi cấy theo mẻ (batch culture),trong đó tế bào được nuôi vài ngày cho tới khi sinh trưởng dừng lại Đây là hệthống nuôi cấy kín vì không cho thêm gì vào và cũng không lấy từ môi trường ramột chất gì Điều kiện chuẩn: mật độ tế bào trong môi trường là 105/cm3 và nuôitrong 3 ngày cho tới khi mật độ tế bào đạt 106/cm3 Trong khi nuôi cấy phảikhuấy lắc để huyền phù tế bào và chất dinh dưỡng phân bố đều trong môitrường Tuy nhiên, môi trường sẽ nghèo dần chất dinh dưỡng và tích lũy nhiềuchất độc (sản phẩm chuyển hóa của tế bào) do đó tế bào sẽ đi vào thoái hóa

Người ta có thể kéo dài thời gian nuôi cấy bằng cách bổ sung thêm chất dinhdưỡng vào môi trường nuôi cấy theo thời gian để tế bào tiếp tục tăng sinh,nhưng đến một thời gian nhất định, sinh trưởng sẽ dừng lại vì môi trường đã tíchlũy quá nhiều chất độc như amoniac hay lactat,…

Để giải quyết vấn đề trên người ta tiến hành phương thức nuôi cấy liên tục(continuous culture), trong đó môi trường luôn được đổi mới và các chất độcluôn được loại bỏ tương tự như trong cơ thể Có hai cách nuôi cấy liên tục: Cáchthứ nhất là dùng hệ thống tiếp liệu chất dinh dưỡng nhưng vẫn duy trì tế bàotrong mẻ cấy cho đến khi số lượng tế bào đạt 107/cm3 Cách thứ hai là đồng thời

có thêm hệ thống rút bớt môi trường cùng với tế bào ra khỏi mẻ cấy, như vậy hệ

số tăng trưởng tế bào sẽ tỷ lệ với hệ số đổi mới dòng chảy vào và ra Một hệ cânbằng như vậy được gọi là hệ ổn hóa (chemostat), là một dạng nồi lên men dùng

để nuôi cấy liên tục.[2,5]

II Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật

1 Nuôi cấy và tạo tế bào lai soma động vật

1.1 Tế bào lai soma

Như đã biết in vivo, sự tạo thành tế bào lai soma là vô cùng hiếm Tuynhiên in vitro người ta có thể nuôi cấy các loại tế bào của cùng một mô, của các

mô khác nhau trong cùng một cơ thể, của các cơ thể khác nhau trong cùng mộtloài, thậm chí người ta có thể nuôi cấy các tế bào giữa các loài khác xa nhau đểtạo nên tế bào lai soma (hybridoma)

Năm 1960, lần đầu tiên, các tác giả Barski, Sorieul, Cornefert thông báo là

đã tạo được tế bào lai soma in vitro khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào sarcoma củachuột thuộc hai dòng khác nhau Các dòng tế bào nuôi cấy khác biệt nhau ởnhiều đặc điểm: Khả năng tạo thành u khi tiêm chúng vào chuột mang tínhtương hợp mô và số lượng, hình thái nhiễm sắc thể của chúng cũng khác nhau.Khi tế bào lai được hình thành từ các tế bào cùng một khởi nguồn, thì tếbào lai được gọi là tế bào đồng nhân (Homocaryon – lai giả), còn khi các tế bàolai được nuôi cấy thuộc các cơ thể khác nhau về bậc phân loại khác nhau ta thuđược tế bào lai dị nhân (Heterocaryon – lai thật) Như vậy, theo nghĩa đúng đắnthì heterocaryon mới thực sự là tế bào lai (hybridoma) Khi nuôi cấy trộn lẫn các

tế bào thuộc hai loài khác nhau người ta vẫn có thể thu được tế bào lai một cáchngẫu nhiên nhưng xảy ra với tần số rất thấp Vì vậy, để thu được tế bào lai dễ