Giới thiệu kĩ thuật nuôi cấy tế bào động vật (TS Vũ Bích Ngọc)

Mục tiêu môn học• Sau khi học xong môn học này, sinh viên: – Hiểu được cấu trúc và chức năng và đặc tính của tế bào – Hiểu được các vấn đề liên quan đến nuôi cấy tế bào động vật, công n

Trang 2

STT Ngày NỘI DUNG

1 10/9 Bài 1 Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy tế bào động vật (TS Vũ Bích Ngọc)

2 17/9 Bài 2 Sinh học tế bào nuôi cấy (TS Vũ Bích Ngọc)

3 24/9 Bài 3 Kĩ thuật nuôi cấy sơ cấp (TS Vũ Bích Ngọc)

4 1/10 Bài 4 Kĩ thuật cấy chuyền và tạo dòng (ThS Trương Châu Nhật )

5 8/10 Bải 5 Kĩ thuật bảo quản tế bào (Cô Lê Thị Ngân Hà)

6 15/10 Bài 6 Kỹ thuật nhận diện tế bào (ThS Phan Lữ Chính Nhân)

7 22/10 Bài 7 Kĩ thuật phân tách tế bào (ThS Phan Lữ Chính Nhân)

8 29/10 Bài 8 Kĩ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng (ThS Lê Thị Hạnh )

9 5/11 Bài 9 Kĩ thuật biến đổi gen trên tế bào (ThS Đào Thị Thanh Thuỷ)

10 12/11 Bài 10 Ứng dụng của kĩ thuật nuôi cấy tế bào trong y học và nông nghiệp- Ôn

tập (TS Vũ Bích Ngọc)

Trang 3

• thi giữa kì (40%): trắc nghiệm

• thi cuối kì (60%): Trắc nghiệm

Trang 4

Mục tiêu môn học

• Sau khi học xong môn học này, sinh viên:

– Hiểu được cấu trúc và chức năng và đặc tính của tế

bào

– Hiểu được các vấn đề liên quan đến nuôi cấy tế bào động vật, công nghệ tế bào gốc như kỹ thuật, quy

trình, các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tế bào

trước, trong và sau quá trình phân lập, nuôi cấy, tăng sinh, bảo quản, định danh, phân tách tế bào

– Liên hệ được các kiến thức về công nghệ nuôi cấy tế bào sự phát triển của lĩnh vực chăn nuôi và y học

Trang 5

Sinh học của tế bào động vật

Kỹ thuật nuôi Một số kỹ thuật

Ứng dụng của

tế bào động vật

Trang 6

PHÒNG THÍ NGHIỆM

NGUYÊN TẮC VÀ TIÊU CHUẨN

9/24/18 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Trang 8

Một số tiêu chuẩn của một phòng thí

nghiệm sạch

(1) Ap lực trong phòng cao hơn bên ngoài không khí.

(2) Độ vô trùng (có 5 cấp bậc 1, 2, 3, 4, 5 - tương ứng với các mức độ vô khuẩn từ 99; 99,9; 99,99; 99,999; 99,9999%).

(3) Độ ẩm (30-45%), hạn chế tối đa đưa nước vào phòng.

(4) Độ rung

(5) Độ sạch bụi.

(6) Nhiệt độ (điều khiển được).

(7) Luồng không khí lưu thông (400m3/giờ).

Trang 10

Khu vực hành lang

Trang 12

Panel và hệ thống khí

Trang 15

Autoclave

THIẾT BỊ

Water bath

Trang 17

Máy pH

Máy khuấy từ

THIẾT BỊ

Trang 18

TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn 9/24/18

THIẾT BỊ

Trang 19

pipet bán tự động

THIẾT BỊ

Trang 20

Dụng cụ nuôi cấy

Đĩa 35-60-100mm, bình Flask, đĩa nhiều giếng (4-6-24 giếng), bình quay, spinner…

Ống ly tâm, pipette

Trang 22

Một số dụng cụ thủy tinh

Lam và lamelle

Trang 23

Pipet

Trang 24

Chỉ tiêu Điều kiện

Nhiệt độ Hầu hêt là 370C (ĐV có vú, người; trừ tinh trùng-330C); 38,50C

(chim); 25-280C (côn trùng)

>20C so với điều kiện tối ưu từng loại TB

Có thể chịu đến -1960C;

Sử dụng tủ ấm (incubator) trong nuôi in vitro

pH Duy trì cân bằng Ion, chức năng enzym nội bào, gắn kết hormone

với GF lên receptor

Có thể làm thay đổi chuyển hoá tế bào gây apoptosis, sản xuấtprotein shock nhiệt

Ngưỡng: 6,5-7,8, thường được điều chỉnh 7-7,4

Áp suất thẩm thấu Tác nhân chính: muối, glucose

Tác động đến sự tăng trưởng và chức năng tế bàoThích hợp 290-310 mOsm

Các loại khí CO2 (5%-10%), O2, N2

Điều kiện Lý - Hoá

Trang 25

Môi trường nuôi cấy TBĐV

Trang 26

Thành phần môi trường

Muối vô cơ Cân bằng ASTT, điều hoà điện thế màng

Cần trong nền chất tế bào (bám gắn và hoạt độngnhư cofactor

Hệ đệm Bicarbonat/phosphat/hepes

Carbonhydrate Glucose, galactose, maltose, fructose (1-4,5 g/l)

Vitamin Cơ chất cho nhiều cofactor

Thường là riboflavin,thiamin, biotin Protein và peptide Albumin, transferrin, fibronectin, fetuin

Acid béo và lipid Dạng: cholesterol và steroid

Cần trong môi trường không huyết thanhYêu tố vi lượng Kẽm, đồng, selenium, tricarrboxylic acid trung gian

Huyết thành Cung cấp chất dinh dưỡng, GF, chống oxy hoá, cải thiện tính dính của

tế bào

Trang 27

SINH HỌC CỦA TBĐV

Đặc điểmcủa tế bàođộng vật

Một số kháiniệm dòng

tế bào

Các cấp độnuôi cấy mô

và tế bàođộng vật

Trang 28

Chu kì tế bào

MMitosis

G1Gap1

G2Gap2

G0

SSynthesis

Metaphase check point

• chromosome align on spindle

ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Trang 29

Chu kì tế bào

• Interphase:

– Nhìn chung kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động vật có vú

– Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein và phát triển về kích thước

• Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi chu kì tế bào và không phân chia

• Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước, tổng hợp RNA và protein, có 1 G1

Checkpoint

• S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra

• Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục phát triển và sản xuất các protein mới Có 1 G2

Checkpoint

• Mitosis hay M Phase:

– Sự phát triển và tổng hợp protein ngừng

– Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau.

– Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ

– Có Checkpoint trong giữa kì của Mitosis (Metaphase Checkpoint) để đảm bảo

tế bào hoàn thành xong sự phân chia.

Trang 30

SỰ TĂNG SINH IN VITRO

– Trạng thái tự nhiên của tế bào:

• Vai trò của bộ gen – Giới hạn Hayflick

• Vai trò của sự biểu hiện gen

– Môi trường nuôi cấy

• Cơ chất tế bào bám

• Thành sinh lí và sinh hoá của môi trường nuôi

• Thành phần của phase khí

• Nhiệt độ nuôi

• Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền

Trang 31

Tính cơ học yếu (dễ vỡ)

Trang 32

Dung hợp, biếnnạp, tải nạp… tếbào à Thay đổikiểu gen và kiểuhình

Trang 33

Tính cơ học yếu

Tăng trưởng và phân chia chậm

Cơ chế kìm hãm ngược

Tính chất cần giá đỡ

Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

Có thể được bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu

Trang 36

Trang 37

Tăng sinh

Trang 38

Thu nhận

cơ quan

Tế bàothứcấpCấy chuyền

Cấy chuyền

Tế bào sơ cấp

Nuôi mô

CắtnhỏThành

tế bàođơn

Tế bào sơ cấp

Trang 39

Các kiểu nuôi cấy tế bàoàLoại tế bào

1 Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture)

– Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu như

• Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy

• Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học)

• Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức

• Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn

Trang 40

2 Nuôi cấy thứ cấp

– Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ cấp

• Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy tế bào sau khi chúng gia tăng số lượng bản sao trong nuôi cấy – Thường chứa kiểu êế bào đơn

– Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ

– Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy:

• Dòng tế bào

• Dòng tế bào liên tục

Các kiểu nuôi cấy tế bào

Trang 41

• Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng Master

và ngân hàng làm việc để duy trì những dòng này trong thời gian dài

Các kiểu nuôi cấy tế bào

Trang 42

Dòng tế bào liên tục

(CHO, Schneider-2, COS1, hela Vero…: khả năng phân bào vĩnh viễn/dài; không thay đổiđặc tính

Trang 43

2) Dòng tế bào liên tục

• Có thể tăng sinh không hạn định

• Chúng thường là những tế bào chuyển dạng:

Trang 44

Chuyển dạng (Transformation) Và

Chuyển nhiễm (Transfection)

• Chuyển dạng

– Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông qua ưự thay đổi DNA

và sự biểu hiện gen

Trang 45

*

Trang 46

Tại sao cần nuôi cấy mô/tế bào?

• Các tác động của các mô xung quanh

• Các biến đổi mà do các điều kiện của động vật

• Sản xuất các sản phẩm thương mại

Trang 47

NUÔI TẾ BÀO

SƠ CẤP

NUÔI CẤY PHÁT TRIỂN MẢNH

MÔ SƠ CẤP CẤY CHUYỀN

*

Trang 48

THU NHẬN MẪU MÔ

CẮT NHỎ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)

NUÔI SƠ CẤP

Cấy chuyền

DÒNG TẾ BÀO

Tách tế bào bằng enzym (ủ…)

Trang 49

Thu nhận

cơ quan

Cell lineCấy chuyền

Cấy chuyền

Nuôi mô

CắtnhỏThành

tế bàođơn

Nuôi sơ cấp

Trang 50

Tách tế bào bằng phương pháp khác

Ly tâm đẳng tỷ trọng

Dựa vào marker bề mặt

Trang 52

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO

Cung cấp hormone và GF cần thiết cho chức

Cung cấp các nhân tố bám dính (fibronectin,

vitronectin…) Phủ đĩa với các nhân tố bám dính hay polylysine

Hoạt động như một đệm pH Sử dụng các hệ đệm hữu cơ…

Cung cấp các chất dinh dưỡng Sử dụng các môi trường phức tạp

Chứa các chất ức chế protease Sử dụng chất ức chế trypsin khi cấy chuyền và

thêm các chất ức chế protease thích hợpChứa các nhân tố biệt hoá Bổ sung hay không, để điều hoà sự phát triển

tế bào và biệt hoáChứa các nhân tố gây sự lão hoá trong các tế

bào chuột bình thường9/24/18 TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vnKhông có tác dụng lên sự già yếu tế bào, các tếbào phát triển liên tục

Trang 53

MỘT SỐ KỸ THUẬT LIÊN QUAN

KỸ THUẬT

VÔ TRÙNG

QUAN SÁT TẾ BÀO

KIỂM SOÁT NHIỄM

ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO

Trang 54

– Khử trùng bằng nhiệt ẩm (nồi autoclave)

• Áp suất autoclave và nhiệt độ

¤ Một số phương pháp vô trùng thường dùng khác

Ø Chiếu tia UV: sử dụng cho tủ thao táchoặc phòng thao tác

Ø Chiếu tia Gamma: dùng để vô trùngcác dụng cụ nhựa

Ø Lọc vô trùng: sử dụng phin lọc vớiđường kính lỗ lớn nhất là 1 nm, thường dùng cho các môi trường hoặcchất lỏng dễ bị biến tính ở nhiệt độcao

TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Kỹ thuật vô trùng

9/24/18

Trang 56

Phát hiện nhiễm Ngăn ngừa nhiễm

Nguồn: nấm, vi khuẩn, mycoplasma, virus,

tế bào

Nhận biết: độ acid bất thường, môi trường

đục, xuất hiện quả cầu, dây, quan sát dưới

KHV, nhuộm huỳnh quang, kháng thể, phân

tích PCR

Vệ sinh dụng cụ, khu vực thao tácThao tác độc lập trên mỗi dòng tế bàoLoại bỏ nhiễm:

- bỏ vật dụng/mẫu đã bị nhiễm

- Dùng kháng sinh/nấm

- Tái thiết lập bằng PP pha loãng tới hạn

- Ly tâm percoll (nấm mốc/men)

Kiểm soát nhiễm

Trang 57

Đông lạnh Giải đông

Giữ tế bào ở trạng thái ngủ (Lưu trữ tế bào

sống trong thời gian dài) Đưa tế bào về trạng thái sinh lý bìnhthường (hoạt hoá tế bào) Cần có chất bảo quản đông lạnh (DMSO,

glycerol, PEG, trehalo, dextro…) Cần có môi trường dinh dưỡng

Nên đông lạnh chậm: T0 mát (2-80C) à âm

(-15- -800C)à âm sâu (-1960C) Nên giải đông nhanh (37

0C)

Đông lạnh – giải đông tế bào

Trang 58

CÁC TẾ BÀO ĐỘNG VẬT LÀM NGUYÊN LIỆU CẤY GHÉP

TẠO CƠ QUAN TỪ

TBĐV

SẢN XUẤT CÁC VIRUS DIỆT CÔN TRÙNG

Trang 59

Mô hình thử nghiệm – chẩn đoán bệnh

Trang 60

Công nghiệp thẩm mỹ

9/24/18

TS Vũ Bích Ngọc- vbngoc@hcmus.edu.vn

Trang 61

Sinh học tế bào

Chẩn đoán tiền sinh

Trang 62

Sản xuất các hợp chất sinh học

- Vaccin virus

- Interferone

- Kháng thể đơn dòng

- Hoạt chất sinh học (nhân

tố chống đông máu, hoạt

hoá plasminogen…)

Trang 63

Cấy ghép tế bào – cơ quan

Tế bào làm vật liệu cấy ghép

Trang 64

Định dạng
Số trang	64
Dung lượng	3,39 MB