BÀI GIẢNG PHÁT HIỆN BIẾN DỊ

Trình bày được các khái niệm cơ bản về biến dị di truyền.Trình bày được nguyên lý của các kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản: Điện di protein và điện di ADN, kỹ thuật PCR, Southern bl

Trình bày được các khái niệm cơ bản về biến dị di truyền.

Trình bày được nguyên lý của các kỹ

thuật sinh học phân tử cơ bản: Điện di

protein và điện di ADN, kỹ thuật PCR,

Southern blot, xác định trình tự ADN.

Phân tích được các ưu điểm, nhược điểm, ứng dụng trong y học của mỗi kỹ thuật

trên.

jkjkjk

 Điện di là sự chuyển động của các

phân tử trong điện trường.

 Thành phần tích điện âm di chuyển về cực dương và ngược lại.

 Phân tử tích điện càng nhiều thì di

chuyển càng nhanh.

 Phân tử càng lớn thì di chuyển càng chậm.

Sự khác biệt của chỉ 1 acid amin trong phân tử protein có thể gây nên sự khác biệt về điện tích của protein.

Bệnh hồng cầu hình liềm: Glutamic (2 nhóm carboxyl) bị thay bởi Valine (1

nhóm carboxyl)

NHƯỢC ĐiỂM: Không phát hiện các loại đột biến

- Đột biến im lặng.

- Đột biến làm đổi nghĩa codon

nhưngacid amin thay thế không thay

đổi điện tích.

- Đột biến xảy ra ở các đoạn ADN không

mã hóa.

Các phân tử ADN mang điêên tích âm sẽ

di chuyển từ cực âm đến cực dương

trong gel agarose hoặc polyacrylamide khi được đăêt trong điêên trường.

Phát hiện các băng ADN:

- Nhuôêm ethidium bromide: đọc dưới đèn UV.

- Có thể nhuộm bạc, xanh methylene.

Các yếu tố ảnh hưởng điện di:

Là phản ứng kéo dài mồi nhờ ADN

polymerasen nhằm tổng hợp in vitro

các đoạn ADN đặc trưng.

Khuôn mẫu là một đoạn ADN nhất định

đã biết hoặc chưa biết trình tự

Các đoạn ADN mới hình thành lại được

sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng

kế tiếp theo phương thức phản ứng chuỗi.

Mồi: đoạn oligonucletide 18-30 Nu, gồm mồi xuôi và mồi ngược.

Enzyme ADN polymerase:

Taq polymerase (VK Thermus aquaticus)

Biến tính: 93-95 o C

Tách ADN thành 2 sợi đơn

Gắn mồi: 50-70 o C

Gắn mồi với trình tự bổ sung

Kéo dài mồi: 72 o C

Tổng hợp sợi ADN mới

Nhanh, dễ thực hiện

Rất nhạy

Có thể khuếch đại ADN mô, tế bào giáng hoá, tế bào trong môi trường đặc biệt, mô đã cố định formalin, ADN giáng hoá (nếu trình tự ngắn)

Dễ phát hiện sản phẩm

Phải biết trình tự ADN ở 2 đầu (flanking)

Có thể nhiễm ADN từ phòng thí nghiệm (khắc phục được)

Chỉ thực hiện được với các đoạn ADN cần khảo sát có kích thước ngắn.

Chẩn đoán đột biến gene trong bệnh lý di truyền.

- Mơ hồ giới tính: xác định gen SRY

- Mất đoạn nhỏ NST Y ở người vô tinh, thiểu năng tinh trùng.

- Teo cơ Duchene: mất đoạn gen dystrophin .

Ứng dụng trong pháp y

Tạo dòng nhanh chóng, là phương tiện giúp nghiên cứu gen, genome

Là một kỹ thuật lai phân tử giữa một

probe ADN với một ADN đích để nhận dạng gen đặc hiệu.

Thực hiện dựa trên việc chuẩn bị các

đoạn DNA được cắt bằng enzym cắt

hạn chế rồi phân tách bằng cách điện di trên gel.

Các đoạn ADN này được biến tính,

chuyển lên màng để lai phân tử.

Nguồn gốc: là enzym của vi khuẩn, có nhiệm vụ cắt ADN virus, nhằm hạn chế

sự xâm nhập virus.

Có vị trí nhận biết đặc hiệu trên ADN

Là trình tự ADN lặp lại đảo ngược 4-8 nu.

Enzym cắt thông dụng: EcoRI

Vị trí nhận biết đặc hiệu là:

GAATTC CTTAAG

Đột biến mất hoặc thêm nucleotide mà

có kích thước trên 50-100 bp.

Đột biến thay thế nucleotide làm mất vị trí cắt hoặc tạo ra vị trí cắt mới của

enzym cắt hạn chế.

Đột biến GAG → GTG ở codon 6.

Làm mất 1 vị trí cắt của MstII

(CCTNAGG)

CCTGAGG → CCTGTGG

Mất nhiều thời gian, nhiều công đoạn phức tạp.

Phụ thuộc vào kỹ thuật tạo dòng (bằng

pp tế bào hoặc PCR) để tạo probe.

Cần nhiều ADN từ bệnh phẩm (5-10 µg)

→ cần nhiều máu để tách chiết ADN.

Không thực hiện được từ ADN thô.

Phương pháp hóa học:

Maxam và Gilbert

Phương pháp enzym (pp dideoxy)

Frederick Sanger

Dùng các dideoxynucleotide thay thế một phần các deoxynucleotide trong quá trình tổng hợp mạch ADN bổ sung.