123doc cac vector trong tao dong

Tế bào vật chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E. coli để khuếch đại một lượng lớn DNA plasmid tái tổ hợp dùng cho các phân tích về sauMột virus mang DNA sợi đôi có kích thước khoảng 50 kbỞ dạng phân tử mạch thẳng có hai đầu bổ trợ sợi đơn dài 12 nucleotide

Có vùng Ori, Có vùng promoter Có các vị trí nhận biết đơn

Chứa các gen làm vô hiệu hóa đoạn DNA không mong muốn được gắn vào.

Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp

Có các gen chỉ thị Có nhiều bản sao Có vùng RBS

VECTOR CHUYỂN GEN

Yêu

cầu

Khái niệm

Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA

Đưa gen vào các tế bào vi sinh vật hay các

động-thực vật

Tạo dòng (cloning) và khuếch đại

(amplification) một đoạn trình tự của DNA

Sản xuất RNA

Sản xuất protein từ gen được tạo dòng

Ứng dụng

Giới thiệu

 6 loại vector phổ biến thuộc 3 nhóm :

plasmid, phage/phagemid , NST nhân tạo

I Plasmid vector

Plasmid

Thông tin di truyền ngoài nhân, tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn

DNA mạch vòng, sợi đôi, kích thước 1-≥ 200kb

Có khả năng tự sao chép

để tồn tại độc lập trong tế

bào

Thế hệ thứ 2

Thế hệ thứ 3

I.1 Tạo dòng trong plasmid

Nguyên tắc

DNA plasmid bị cắt bởi enzyme hạn chế

Gắn in vitro với đoạn DNA ngoại lai tạo ra các plasmid

tái tổ hợp Biến nạp vào

vi khuẩn

Phương thức dùng để phân biệt

1 Khử hoạt tính bằng chèn đoạn (1a)

1 Khử hoạt tính bằng chèn đoạn

1 Khử hoạt tính bằng chèn đoạn

2 Tạo dòng định hướng

Tế bào vật chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E

coli để khuếch đại một lượng lớn DNA plasmid tái tổ

hợp dùng cho các phân tích về sau

3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào

Điện biến

nạp

Ưu điểm

Nhược : Đòi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền

 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli.

Tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở thành tế bào khả biến.

Hóa biến

nạp

II Bacteriophage λ vector

Ưu điểm của Phage λ

Đặc điểm của bacteriophage λ

Phage λ chỉ có thể nhận được DNA lạ trong một chừng mực rất hạn chế Khả năng của nó sẽ bị giảm rất nhiều khi độ dài genome (bộ gen) lớn hơn 105% (51 ÷ 52kb) hoặc nhỏ hơn 78% (38 ÷

38,5kb) so với độ dài ban đầu.

Tạo dòng trong Phage λ

2.1 Chọn vector λ thích hợp

Có hai yếu tố ảnh hưởng đến sự chọn lọc

exotic

~ 60%

genome( nhánh trái , phải) là cần thiết cho sự sinh tan của phage

Khi DNA dài hơn 105%

hoặc ngắn hơn 78% so

với genome tự nhiên

được đóng gói

Giảm Khả năng sống sót của phage

2.2 Những vector được cải tiến

 - Tăng khả năng thích ứng của các đoạn DNA ngoại lai khác nhau với các RE.

 - Cho phép chọn lựa phương thức tái tổ hợp mong

trong việc chọn lọc kháng thể

2 loại vector cải tiến của thế hệ gần nhất

III

Cosmid vector

1 Đăc điểm của cosmid

1.2 Tạo dòng trong cosmid

IV Bacteriophage M13 vector

> 350 bp

 Include: DNA short sections stacked

Hình 4.16 Vector M13mp18 (phagemid) Đây là một trong

các vector được sử dụng phổ biến của nhóm vector

M13mp

Gen Kích thước sản

phẩm Chức năng

1 35-40 kD Protein màng NS; một vài bản sao/tế bào; tương tác với sản phẩm

gen fip của vật chủ (thioredoxin); cần cho sự lắp ráp

2 46 kD Endonuclease/topoisomerase đặc trưng chuỗi và vị trí; khoảng 103

bản sao/tế bào; cần cho sự sao chép của RF

3 42 kD 5 bản sao ở một đoạn cuối của M13; cần cho sự phát sinh hình thái

chính xác của M13;

4 49 kD Protein màng NS; một vài bản sao/tế bào; cần cho sự lắp ráp

5 10 kD (87 aa) Protein cấu trúc chính trong quá trình sao chép; điều hòa sự biểu hiện

8 5 kD (50 aa) Protein cấu trúc chính của vỏ: khoảng 2700-3000 bản sao/virion

10 12 kD (111 aa) Đoạn mang đầu tận cùng N của gen 2; khoảng 500 bản sao/tế bào;

cần cho sự sao chép của RF

VI YAC vector

1 Đặc điểm của YAC(NST nhân tạo của nấm

men)

Hình 4.18 Vector pYAC4 Vị trí tạo dòng

EcoRI ở trong gen sup4 trp1 và ura3 là

các marker chọn lọc ở nhánh trái và phải của YAC tương ứng TEL

là hai trình tự telomere

và CEN4 cung cấp chức năng phần tâm.

Tạo dòng

trong YAC