123doc tao dong va xay dung thu vien cdna

Nhận dạng các dòng cDNA quan tâm Chứa ít nhất một phần của chuỗi nucleic acid chính xác của dòng cDNA mong muốn. Tiến hành dưới các điều kiện nghiêm ngặt Một lượng không đổi của các nhánh bacteriophage λ được gắn với các lượng khác nhau của cDNA, mục đích là để xác định lượng cDNA tạo ra ít nhất là 5x106 bacteriophage tái tổ hợp.

BÀI THUYẾT TRÌNH CHƯƠNG 6

I.Tách chiết, tinh sạch, phân tích RNA

II.Tổng hợp cDNA(complementary DNA)

III.Tạo dòng phân tử của cDNA sợi đôi

IV.Các phương pháp tạo dòng cDNA khác

V Các vector bacteriophage λ dùng trong tạo dòng cDNA

VI.Nhận dạng các dòng cDNA quan tâm

VII.Xây dựng thư viện cDNA trong bacteriophage λ vector

NỘI DUNG TẠO DÒNG VÀ XÂY DỰNG THƯ VIỆN cDNA

I Tách chiết, tinh sạch, phân tích RNA

2 Phân lập RNA poly(A)+ _tinh sạch mRNA từ RNA tổng

số

2 Phân lập RNA poly(A)+ _tinh sạch mRNA từ RNA tổng

số

3 Phân tích RNA

Hình

Phân tích sự biểu hiện của gen bằng lai Northern.

• Hình phía dưới là điện di RNA tổng số(ở đây là tiểu phần 16S, 18S) trên agarose gel được biến tính bằng

formamide

• Hình phía trên là tín hiệu phóng xạ thu được từ phản ứng lai giữa RNA tổng số với mẫu dò được đánh dấu bằng 32P

Lai Dot

Lai Dot được Kafatos và cộng sự (1979) thực hiện đầu tiên bằng cách :

Chấm các mẫu nhỏ của dung dịch RNA lên màng nitrocellulose

 màng được làm khô, lai với mẫu dò đặc trưng RNA hoặc DNA có đánh dấu 32P

 ủ với phim X-quang

 Đơn giản để nhận biết cường độ biểu hiện của 1 gen đặc biệt nào đó trong mô đặc trưng hoặc tế bào nuôi cấy

 Khó định lượng kích thước chính xác

 Đơn giản để nhận biết cường độ biểu hiện của 1 gen đặc biệt nào đó trong mô đặc trưng hoặc tế bào nuôi cấy

 Khó định lượng kích thước chính xác

II Tổng hợp cDNA

III.Tạo dòng phân tử cDNA sợi đôi

cDNA sợi đôi được phân tách

Plasmid của vi khuẩn

1.2 Đuôi dC:dG

2 Các linker và adapter nhân tạo

Hình minh họa một linker (a) Đoạn 5’-CCGGATCCGG-3’ mang vị trí nhận biết cho BamHI (b) Linker này

được gắn vào cDNA đầu bằng nhờ DNA ligase (c) Cấu trúc này sau đó được cắt bằng BamHI để tạo ra đầu 5’

lồi

Hình 6.7 Minh họa một adapter.

(a) Adapter, có đầu tận cùng 5’ tương ứng với enzyme HindIII, được gắn vào cDNA đầu bằng nhờ DNA

ligase

(b) Đầu 5’ của adapter có thể được dephosphoryl hóa để ngăn cản sự tự kết nối lại

 Việc sử dụng adapter có hiệu quả hơn linker

 Adapter khồng cần cắt hạn chế khi gắn với cDNA như linker

 Nồng độ phân tử linker/adapter > nồng độ đầu tận cùng của cDNA ít nhất 100 lần

IV Các phương pháp tạo dòng cDNA khác

2 Bổ sung cac tuần tự linker khác nhau

3.Tạo dòng cDNA bằng các primer-adapter

V Các bacteriophage λ

vector dùng trong tạo dòng cDNA

V Các bacteriophage λ vector dùng trong tạo dòng cDNA

V Các bacteriophage λ vector dùng trong tạo dòng cDNA

1 Các bacteriophage λ được dùng phổ biến

λgt10

λgt10

Xây dựng các thư viện chỉ được sàng lọc bằng

các mẫu dò nucleic acid

Xây dựng các thư viện chỉ được sàng lọc bằng

các mẫu dò nucleic acid

Nhận các DNA ngoại lai trong vùng mã hóa của

1 Các bacteriophage λ được dùng phổ biến

Có vị trí nhận biết đơn EcoRI nằm ở ngược hướng 53

bp của codon kết thúc dịch mã của gen lacZ

Có vị trí nhận biết đơn EcoRI nằm ở ngược hướng 53

bp của codon kết thúc dịch mã của gen lacZ

Chèn được đoạn DNA ngoại lai dài khoảng 7,2kb

cDNA sợi đôi đầu bằng

mang các liker SalI không

cần phải bảo vệ bằng methyl hóa trước khi cắt bằng RET

được loại bỏ sao cho vị

trí XbaI ở trong vùng tạo

các vi trí SalI và NotI

VI Nhận dạng các dòng cDNA quan tâm

Phương pháp sàng lọc

PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC

Lai nucleic acid

Lai nucleic acid

Các mẫu dò tương đồng

• Chứa ít nhất một phần của chuỗi nucleic acid chính xác của dòng cDNA mong muốn.

• Tiến hành dưới các điều kiện nghiêm ngặt

Các mẫu dò oligonucleotide nhân tạo

Là các đoạn nucleotide của trình tự xác định được tổng hợp in vitro

Các mẫu dò tương đồng từng phần

• Dùng để phát hiện cDNA có quan hệ họ hàng nhưng không giống hệt nhau.

• Nếu mẫu dò không có sẵn thì thay đổi bằng một vài phương pháp.

Lai nucleic acid

Phát hiện các kháng nguyên miễn dịch đặc hiệu

Protein phải thể hiện các hoạt tính sinh học hoặc enzyme chính xác

Sự tương ứng giữa các phần của chuỗi nucleotide với các chuỗi amino acid

Sự tương ứng giữa các bản đồ peptide của chuỗi polypeptide và của protein đích thực

Sự kết tủa miễm dịch của polyypeptide tăng khả năng chống lại protein quan tâm

Kết tủa miễn dịch protein đích thực với kháng thể tăng khả năng chống lại các peptide

tổng hợp

2 Các phương pháp xác nhận các dòng cDNA

Để đảm bảo mức độ chính xác của các dòng cDNA thu được cần:

VII.Xây dựng thư viện cDNA

1 Chọn lọc kích thước của cDNA

2 Gắn các cDNA với các nhánh của bacteriophage λ

2 Gắn các cDNA với các nhánh của bacteriophage λ

3 Phân tích các đoạn chèn cDNA

4 Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh

5 Khuếch đại thư viện cDNA

Loại bỏ linker thừaSize pt cDNA<500bp

Loại bỏ linker thừaSize pt cDNA<500bp

Môột lượng không đổi của các nhánh bacteriophage λ được

gắn với các lượng khác nhau của cDNA, mục đích là để xác định lượng cDNA tạo ra ít nhất là 5x106 bacteriophage tái tổ hợp

Môột lượng không đổi của các nhánh bacteriophage λ được

gắn với các lượng khác nhau của cDNA, mục đích là để xác định lượng cDNA tạo ra ít nhất là 5x106 bacteriophage tái tổ hợp

Điêộn di trên agarose gel 1% Nếu các bacteriophage tái

tổ hợp chứa các đoạn chèn kích thước trung bình xấp xỉ 1

kb hoăộc lớn hơn, thì có thể tiến hành các bước tiếp theo

Điêộn di trên agarose gel 1% Nếu các bacteriophage tái

tổ hợp chứa các đoạn chèn kích thước trung bình xấp xỉ 1

kb hoăộc lớn hơn, thì có thể tiến hành các bước tiếp theo

Hình : Sơ đồ xây dựng thư viện

cDNA

THANK YOU