Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên b trên màng tế bào hồng cầu người

Tuy nhiên, việc sử dụng máu trong điều trị bệnh gặp phải nhiều rủi ro, do có sự ngưng kết giữa kháng nguyên trên màng hồng cầu người cho với kháng thể trong huyết thanh của người nhận..

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRẦN QUỐC KHÁNH

TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B

TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRẦN QUỐC KHÁNH

TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B

TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ TRUNG

TS NGUYỄN ĐÌNH THẮNG

Hà Nội – 2016

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Trung, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Đình Thắng (Bộ môn sinh lý thực vật và hóa sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) cùng các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy và dìu dắt tôi trong thời gian thực hiện luận văn cũng như trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị, các bạn làm việc tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập

và thực hiện luận văn tại phòng

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn khích lệ động viên tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 9 tháng 12 năm 2016

Học viên

Trần Quốc Khánh

MỤC LỤC

1.3.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất kháng thể đơn dòng tại Việt Nam 17

2.2.6 Tách dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên

2.2.7 Đánh giá tốc độ sinh trưởng và sản xuất kháng thể của tế bào lai 28

2.2.9 Xác định loại globulin miễn dịch và kiểm tra tính đơn dòng của tế bào lai 29

2.2.10 Đánh giá kháng thể do tế bào lai sản xuất 31

3.2 Nghiên cứu tạo tế bào lai giữa myeloma và tế bào lympho B chuột 37

3.2.2 Nghiên cứu tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng gây ngưng kết đặc hiệu

3.2.2.1 Tách hỗn hợp tế bào giàu tế bào lympho B từ hạch bẹn và lách của chuột

3.2.2.2 Dung hợp giữa tế bào myeloma sp2/0 và hỗn hợp tế bào giàu tế bào

3.2.2.3 Nghiên cứu sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên B 41

3.2.2.5 Khả năng sản xuất mAb kháng kháng nguyên B của dòng tế bào lai

3.2.2.7 Cường độ và ái tính mAb do B4D10C9 sản xuất với hồng cầu mẫu B 44

3.2.2.9 Cô đặc dung dịch kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B 47 3.2.2.10 Tạo sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B 49

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.2 Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp huyết thanh mẫu 09

Bảng 1.3 Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp hồng cầu mẫu 10

Bảng 3.1 Biến động hiệu giá kháng thể trung bình khi gây miễn dịch

theo các con đường khác nhau 35

Bảng 3.2 Số giếng hình thành tế bào lai từ thí nghiệm dung hợp hỗn hợp

tế bào lympho giàu tế bào lympho B tách từ lách và hạch bẹn

chuột gây miễn dịch bằng hồng cầu mẫu B với tế bào myeloma

Bảng 3.3 Số giếng chứa tế bào lai tiết kháng thể gây ngưng kết hồng cầu

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 Cấu tạo các chuỗi đường quy định kháng nguyên nhóm

máu hệ ABO

7

Hình 1.4 Kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu 11

Hình 1.5 Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên - kháng thể 13

Hình 2.1 Chuẩn bị vật liệu gây miễn dịch cho chuột 22

Hình 2.2 Gây miễn dịch cho chuột bằng cách tiêm vào hai gan bàn

Hình 2.5 Vị trí các ô đếm trong buồng đếm tế bào 29

Hình 2.6 Cách đọc kết quả trên đĩa elisa của bộ kit Pierce® Rapid

ELISA mouse mAb

31

Hình 3.1 Hình ảnh tế bào đại thực bào khi nuôi cấy tĩnh 38

Hình 3.2 Ảnh chụp tế bào lai quan sát dưới kính hiển vi soi ngược

(độ phóng đại 1000 lần: vật kính 10x, thị kính 20x, máy ảnh 5x)

40

Hình 3.3 Minh họa 5 giếng chứa dịch nuôi cấy gây ngưng kết hồng

cầu mẫu B mà không gây ngưng kết hồng cầu mẫu A và O

41

Hình 3.4 Sàng lọc tế bào lai đơn sinh mAb gây ngưng kết hồng cầu

mẫu B

42

Hình 3.5 Hiệu giá kháng thể của các dòng tế bào lai đơn tiết mAb

gây ngưng kết hồng cầu B

42

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mật độ tế bào lai B4D10C9 sinh trưởng

trong môi trường DMEM +10% FBS và DMEM+1% FBS

43

theo thời gian

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hiệu giá kháng thể theo thời gian của dịch

nuôi cấy tế bào B4D10C9 trong môi trường DMEM+1%FBS và DMEM+10% FBS

44

Hình 3.8 Phản ứng ngưng kết đặc hiệu hồng cầu B của mAb do tế

bào lai B4D10C9 sinh ra

45

Hình 3.9 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên phiến kính xác định ái

tính mAb do dòng tế B4D10C9 sinh ra với hồng cầu mẫu B

Hình 3.13 Phản ứng ngưng kết hồng cầu của kháng thể kháng B thu

được sau khi tủa bằng ammonium sulphate

48

Hình 3.14 Kháng thể kháng B (anti-B) được hoàn nguyên trong dung

dịch hoàn nguyên màu vàng A dung dịch chứa kháng thể B (anti-B); B dung dịch dùng hoàn nguyên kháng thể B

50

Hình 3.15 A Phản ứng ngưng kết của sinh phẩm B với hồng cầu mẫu

A, B và O; B Lọ sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng B

50

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's

Medium

Môi trường Dulbecco biến đổi

DMSO Dimethyl sulfoxide

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA enzyme-linked immunosorbent

assays Fab Fragment antigen-binding Mảnh liên kết kháng

nguyên

FCA Freund’s complete adjuvant Tá chất hoàn toàn

FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và

Dược phẩm Hoa Kỳ FIA Freund’s incomplete adjuvant Tá chất không hoàn toàn HAT hypoxanthyl aminoteptrin

thymidine HGPRT hypoxanthine-guanine

phosphoribosyltransferase

PBS Phosphate buffered saline Đệm muối phosphate PEG polyethylene glycol

RPMI Roswell Park Memorial Institute

medium

Môi trường RPMI WHO World Health Organisation Tổ chức y tế thế giới

MỞ ĐẦU

Máu là thành phần vô cùng quý giá trong điều trị bệnh mà cho đến nay vẫn chưa có một sinh phẩm nào có thể thay thế được, đặc biệt máu được sử dụng trong điều trị nội khoa, cấp cứu ngoại khoa, sản khoa và triển khai nhiều kỹ thuật y học cao cấp như ghép tạng, mổ tim, lọc máu ngoài thận Tuy nhiên, việc sử dụng máu trong điều trị bệnh gặp phải nhiều rủi ro, do có sự ngưng kết giữa kháng nguyên trên màng hồng cầu người cho với kháng thể trong huyết thanh của người nhận Để quá trình truyền máu thành công phải có sự tương thích giữa máu người cho và người nhận Do đó, trước khi truyền máu cần phải tiến hành xác định nhóm máu Năm 2014, Hiệp hội truyền máu quốc tế đã thống kê có 35 hệ nhóm máu với hơn

300 kháng nguyên nhóm máu khác nhau Hầu hết các kháng nguyên trên màng hồng cầu có tính sinh miễn dịch yếu được dùng để nghiên cứu di truyền và quan hệ huyết thống, chỉ có hai nhóm kháng nguyên đặc biệt quan trọng gây ra phản ứng ngưng kết khi truyền máu dẫn đến tai biến đó là kháng nguyên A, B của hệ nhóm máu ABO và kháng nguyên D của hệ nhóm máu Rh Các nhóm máu nêu trên được xác định bằng phương pháp ngưng kết sử dụng hồng cầu mẫu hoặc huyết thanh mẫu Huyết thanh mẫu chính là các kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên nhóm máu, có 3 loại huyết thanh mẫu anti-A, anti-B, anti-AB được sử dụng trong xác định nhóm máu hệ ABO và huyết thanh mẫu anti-D để xác định nhóm máu hệ

Rh Nhiều phương pháp được phát triển để sản xuất kháng thể đơn dòng như công nghệ lai tế bào, công nghệ bất tử tế bào B, công nghệ phage display, công nghệ kháng thể tái tổ hợp, sử dụng chuột chuyển gene Phương pháp lai tế bào đã được ứng dụng thành công để tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng lại kháng nguyên nhóm máu hệ ABO Hiện nay, nhiều thuốc thử nhóm máu có bản chất là kháng thể đơn dòng được sản xuất thành công như Blood Grouping (Prestige Diagnostics UK), Monoclonal blood grouping reagent (Maxwin international), Anti-A Monoclonal reagent (Atlas Medical), Transclone® (Biorad)

Ngày nay, nhu cầu sử dụng máu trong điều trị bệnh ngày càng lớn do vậy việc sử dụng huyết thanh mẫu càng gia tăng Tuy nhiên, Việt Nam vẫn chưa sản xuất được kháng thể đơn dòng xác định nhóm máu mà chủ yếu sử dụng hồng cầu

mẫu thu thập từ các tình nguyện viên hoặc kháng thể đơn dòng nhập ngoại Việc sử dụng hồng cầu mẫu làm thuốc thử xác định nhóm máu tốn ít chi phí nhưng lại mất rất nhiều máu thu được từ người tình nguyện Còn sử dụng huyết thanh mẫu nhập ngoại lại có giá thành cao làm tăng gánh nặng kinh tế đối với bệnh nhân Xuất phát

từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B trên màng tế bào hồng cầu người” với mục tiêu tạo ra dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng

kháng nguyên B sử dụng như thuốc thử xác định nhóm máu B ở người

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Máu và hệ thống nhóm máu ở người

1.1.1 Khái niệm máu và các thành phần của máu

Máu là một tổ chức di động được tạo thành từ thành phần là các tế bào (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu) và huyết tương (chứa protein, muối khoáng, nước) với vai trò cung cấp các chất nuôi dưỡng và cấu tạo các tổ chức cũng như loại bỏ các chất thải trong quá trình chuyển hóa của cơ thể như khí CO2 và acid lactic Đồng thời máu cũng là phương tiện vận chuyển của các

tế bào (cả tế bào có chức năng bảo vệ cơ thể lẫn tế bào bệnh lý) và các chất khác nhau (các amino acid, lipid, hormone) giữa các tổ chức và cơ quan trong cơ thể Các rối loạn về thành phần cấu tạo của máu hay ảnh hưởng đến sự tuần hoàn bình thường của nó có thể dẫn đến rối loạn chức năng của nhiều cơ quan khác nhau [3, 4] Máu chiếm 1/13 trọng lượng cơ thể (60 - 70 ml/kg); thể tích máu ở nam khoảng

5 - 6 lít, nữ 4,5 – 5 lít; tỷ trọng 1,055 – 1,063, pH 7,33 – 7,43

 Hồng cầu

Hồng cầu trưởng thành là bào quan hình đĩa lõm, không chứa nhân và các bào quan (ty lạp thể, polyribosom) do vậy không có khả năng tổng hợp protein, hồng cầu chứa chủ yếu huyết sắc tố làm nhiệm vụ gắn O2 ở phổi vận chuyển tới các

tổ chức sau đó vận chuyển CO2 đào thải qua phổi Hồng cầu trưởng thành sống 120 ngày, được phân giải chủ yếu ở lách và tổ chức liên võng khác Sự cân bằng giữa môi trường và hồng cầu được duy trì bởi hoạt động của bơm natri nằm trên màng hồng cầu

1.1.2 Vai trò của máu trong y học

Máu mang oxy và các chất dinh dưỡng (protein, gluco, lipit, muối khoáng, các nội tiết tố ) đến các tế bào, đồng thời cũng mang đi các sản phẩm dư thừa của các tế bào này Ngoài ra, máu còn vận chuyển các tế bào miễn dịch để chống lại các tác nhân lây nhiễm và mang tiểu cầu để tạo thành các vết đông máu khi mạch máu

bị tổn thương để ngăn chặn sự mất máu Máu được vận chuyển đi khắp cơ thể qua

hệ thống tuần hoàn Khi cơ thể bị viêm nhiễm, máu vận chuyển nhiều tế bào miễn dịch đến vị trí lây nhiễm để ngăn chặn các tác nhân có hại [15]

Với những chức năng như trên máu đóng vai trò rất quan trọng đối với cơ thể, thiếu máu hoặc máu không thực hiện được chức năng sẽ gây ra nhiều rối loạn cho toàn bộ cơ thể Mất máu do phẫu thuật, bị thương hoặc bị ốm Cơ thể thiếu máu (bệnh thiếu máu địa trung hải, bệnh thiếu máu cấp, tủy xương giảm khả năng sản xuất hồng cầu đối với người xạ trị) hoặc do máu không thực hiện được chức năng (bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm v.v) [4]

1.1.3 Phân loại các hệ thống nhóm máu ở người

Việc sử dụng máu để điều trị đã được áp dụng từ thế kỷ 17 và trong suốt thế

kỷ 18, tuy nhiên nhiều tai biến rất nguy hiểm đã xảy ra nhưng mãi đến năm 1900 con người mới bắt đầu hiểu được nguyên nhân của tai biến là do sự ngưng kết giữa kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu người cho với kháng thể trong huyết thanh của người nhận Năm 1901, Karl Landsteiner là người đầu tiên phát hiện ra hệ thống nhóm máu ABO, phân loại các nhóm máu dựa vào kháng nguyên bề mặt trên màng

tế bào hồng cầu, với phát hiện này, ông đã được nhận giải Nobel về sinh lý và y học năm 1930 Nghiên cứu của ông chỉ ra rằng kiểu nhóm máu của những người khác nhau có thể không giống nhau và phụ thuộc vào kháng nguyên tồn tại trên màng hồng cầu Do đó, nhóm máu được phân loại dựa vào sự có mặt hoặc không có mặt của kháng nguyên A hoặc kháng nguyên B trên màng hồng cầu và việc xác định nhóm máu trước khi truyền máu là cần thiết [5]

Năm 2014, theo thống kê của Hiệp hội truyền máu Quốc tế có khoảng 35 hệ thống phân loại nhóm máu (hệ ABO, hệ Rh, hệ MNS, hệ Kell, hệ Kidd, hệ Lewis,

hệ Duffy, hệ Indian,…) với hơn 300 kháng nguyên nhóm máu khác nhau [6] Trên màng hồng cầu người có khoảng 30 loại kháng nguyên thường gặp và hàng trăm loại kháng nguyên hiếm gặp Hầu hết, kháng nguyên nhóm máu trên bề mặt hồng cầu có tính kháng nguyên yếu, thường được sử dụng trong nghiên cứu di truyền chỉ

có 2 kháng nguyên A, B của hệ thống nhóm máu ABO và kháng nguyên D của hệ thống nhóm máu Rh có tính kháng nguyên mạnh đóng vai trò quan trọng trong

truyền máu và trong sản khoa

Kháng nguyên nhóm máu có thể là đường (glycan hoặc carbohydrate) hoặc protein, chúng liên kết với các thành phần khác nhau trên màng hồng cầu DNA của người quy định kiểu kháng nguyên hình thành trên màng tế bào hồng cầu của họ: kháng nguyên đường; kháng nguyên protein (protein xuyên màng một lần, nhiều lần

và protein liên kết glycosylphosphatidylinositol) Kháng nguyên nhóm máu ABO

có bản chất là đường Chúng được sản xuất bởi một loạt các phản ứng với sự tham gia của các enzyme xúc tác chuyển hóa các đơn vị đường DNA quy định kiểu enzyme của mỗi cá thể thông qua đó quy định kiểu kháng nguyên đường hình thành tương ứng trên màng tế bào hồng cầu Ngược lại, kháng nguyên của nhóm máu Rh lại có bản chất là protein, DNA của cá thể mang thông tin di truyền quy định protein

- kháng nguyên Gen RhD mã hóa kháng nguyên D, được biểu hiện ở những người mang gen, một vài người có gen không sản xuất kháng nguyên D và do đó protein RhD vắng mặt trên tế bào hồng cầu của họ Bên cạnh kháng nguyên đường, tế bào hồng cầu có ba loại protein mang kháng nguyên nhóm máu: protein xuyên màng một lần, protein xuyên màng nhiều lần và protein liên kết glycosylphosphatidylinositol (GPI) [9]

Hình 1.1 Kháng nguyên nhóm máu ở người

1.1.4 Hệ thống nhóm máu ABO và kháng nguyên nhóm máu ABO

Theo Landsteiner, trên màng hồng cầu có những kháng nguyên được gọi là

ngưng kết nguyên Có 2 loại ngưng kết nguyên là A và B Ngưng kết nguyên là polysaccharide có mặt trên màng hồng cầu từ giai đoạn sớm của bào thai Ðồng thời trong huyết tương có những kháng thể đặc hiệu của nhóm máu được gọi là ngưng kết tố Có 2 loại kháng thể đặc hiệu là kháng A (anti-A) và kháng B (anti-B) Các kháng thể này có khả năng làm ngưng kết hồng cầu khi hồng cầu nhóm máu A gặp anti-A, hoặc hồng cầu nhóm máu B gặp anti-B Tùy theo, sự có mặt hoặc vắng mặt của một trong hai hoặc cả hai kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu, Landsteiner phân hệ thống nhóm máu ABO thành 4 nhóm máu A, B, AB và O (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Các nhóm máu hệ ABO ở người

Nhóm

máu

Hồng cầu có kháng nguyên A hoặc B

Huyết thanh có kháng thể anti-A hoặc anti-B

Về bản chất, kháng nguyên nhóm máu ABO là các carbohydrate có mặt trên màng hồng cầu và nhiều mô, được đặc trưng bởi một gốc đường đặc hiệu (Hình 1.2) Các chuỗi đường này được gắn trên bề mặt hồng cầu bởi một phần có cấu trúc giống nhau được gọi là thân carbonhydrate (kháng nguyên H) Chuỗi đường cơ bản này không gây ngưng kết hồng cầu nên hồng cầu mang chuỗi đường cơ bản được kí hiệu là nhóm máu O Khi chuỗi đường cơ bản gắn thêm một gốc đường galactose hoặc galactosamine thì chúng gây ngưng kết hồng cầu B, nên đặc trưng cho nhóm máu B Chuỗi đường đặc trưng nhóm máu B được gắn thêm một nhóm N-acetyl thì chúng gây ngưng kết hồng cầu A nên đặc trưng cho nhóm máu A [10]

Hình 1.2 Cấu tạo các chuỗi đường quy định kháng nguyên nhóm máu hệ ABO

(RBC – tế bào hồng cầu, GLU – Glucose, GAL – Galactose/Glucosamine,

FUC – Fructose, NAc – N-Acetyl)

Hệ miễn dịch có hiện tượng chống lại các kháng nguyên khác với kháng nguyên tự thân của hồng cầu Người nhóm máu A có kháng nguyên A trên hồng cầu

mà không có kháng nguyên B do đó có kháng thể kháng kháng nguyên B trong huyết thanh Người nhóm máu B có kháng nguyên B trên màng hồng cầu và kháng thể kháng A trong huyết thanh Người nhóm máu AB có cả kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu do vậy không có kháng thể kháng A và kháng thể kháng B trong huyết thanh Còn người có nhóm máu O thì huyết thanh có cả kháng thể kháng A và kháng B do màng hồng cầu thiếu cả hai kháng nguyên A và B [11]

1.2 Truyền máu và nguyên tắc truyền máu

1.2.1 Nguyên tắc truyền máu

Truyền máu là quá trình đưa các thành phần của máu vào trong tĩnh mạch của một người khác Trước đây, sử dụng máu toàn phần để truyền máu nhưng hiện nay các thành phần của máu được truyền trong các trường hợp khác nhau, hồng cầu được sử dụng để tăng khả năng vận chuyển oxy máu, tránh sự mệt mỏi và các biến chứng khác Truyền máu mất khoảng 1-4 giờ phụ thuộc vào thành phần và thể tích máu được truyền Hầu hết truyền máu được thực hiện tại bệnh viện nhưng nó cũng được thực hiện ở bất cứ nơi nào khi cần thiết Trong hầu hết trường hợp, máu có nguồn gốc từ những tình nguyện viên đã sàng lọc bằng huyết thanh 5 bệnh nhiễm trùng: HIV, HCV, HBV, giang mai, sốt rét [12]

Màng của mỗi tế bào hồng cầu chứa hàng triệu kháng nguyên tự thân, được

bỏ qua bởi hệ thống miễn dịch Tuy nhiên, trong quá trình truyền máu, các kháng thể nhóm máu có trong huyết tương của người nhận sẽ tấn công bất kỳ tế bào hồng cầu cho nào mang kháng nguyên khác với kháng nguyên tự thân sau đó phá hủy hồng cầu gây ra phản ứng tan máu cấp tính Do đó, xác định sự tương thích nhóm máu giữa người cho và người nhận cũng như sự tương tích nhóm máu giữa người cho và người nhận là cần thiết để truyền máu an toàn [13]

Dựa vào sự có mặt của kháng nguyên bề mặt hồng cầu (A hoặc B) và kháng thể trong huyết thanh (anti-A hoặc anti-B) quá trình truyền máu được thực hiện theo nguyên tắc sau [15]

- Người nhóm máu A có kháng nguyên A trên hồng cầu mà không có kháng nguyên B, có kháng thể kháng kháng nguyên B trong huyết thanh, do đó có thể truyền máu cho người có nhóm máu A hoặc AB

- Người nhóm máu B có kháng nguyên B trên màng hồng cầu và kháng thể kháng A trong huyết thanh, do đó có thể truyền máu cho người có nhóm máu B hoặc AB

- Người nhóm máu AB có cả kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu do vậy không có kháng thể kháng A và kháng thể kháng B trong huyết thanh, do đó chỉ

có thể truyền máu cho người có nhóm máu AB

Người có nhóm máu O thì huyết thanh có cả kháng thể kháng A và kháng B

do màng hồng cầu thiếu cả hai kháng nguyên A và B do đó có thể truyền máu cho tất cả các nhóm máu

Hình 1.3 Sơ đồ truyền máu

1.2.2 Phương pháp xác định nhóm máu hệ ABO

Nhóm máu hệ ABO được xác định bằng phương pháp huyết thanh mẫu hoặc phương pháp hồng cầu mẫu Theo thông tư của Bộ Y tế (2013) để kết luận một nhóm máu thuộc hệ ABO thì mẫu máu phải được định nhóm bằng cả hai phương pháp: phương pháp huyết thanh mẫu và phương pháp hồng cầu mẫu

Phương pháp huyết thanh mẫu dùng huyết thanh đã biết trước kháng thể cho phản ứng với hồng cầu của bệnh nhận để xác định sự có mặt của kháng nguyên trên

bề mặt hồng cầu từ đó xác định được kiểu nhóm máu của bệnh nhân Các mẫu huyết thanh dùng để xác định nhóm máu hệ ABO bao gồm: huyết thanh mẫu anti-

A, anti-B và anti-AB Cách xác định nhóm máu thông qua phương pháp huyết thanh mẫu như sau (Bảng 1.2)

- Không bị ngưng kết với 3 mẫu huyết thanh mẫu thì mẫu là nhóm máu O

- Ngưng kết với cả 3 mẫu huyết thanh mẫu thì mẫu thuộc nhóm máu AB

- Ngưng kết ở mẫu anti-A và anti-AB thì mẫu là nhóm máu A

- Ngưng kết ở vị trí Anti-B và Anti-AB thì mẫu kiểm tra là nhóm máu B

Bảng 1.2 Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp huyết thanh mẫu

(+) tương ứng với trường hợp xảy ra phản ứng ngưng kết;

(-) Tương ứng với trường hợp không xảy ra phản ứng ngưng kết

Phương pháp hồng cầu mẫu sử dụng hồng cầu mẫu đã biết trước kháng nguyên cho phản ứng với kháng thể của bệnh nhân để xác định kháng thể có mặt trong huyết thanh từ đó xác định kiểu nhóm máu của bệnh nhân

Bảng 1.3 Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp hồng cầu mẫu

Hồng cầu mẫu A Hồng cầu mẫu B Hồng cầu mẫu O

(+) tương ứng với trường hợp xảy ra phản ứng ngưng kết;

(-) Tương ứng với trường hợp không xảy ra phản ứng ngưng kết

1.3 Kháng thể đơn dòng

1.3.1 Khái niệm

Kháng nguyên là bất kỳ cơ chất nào có khả năng cảm ứng sự hình thành

kháng thể và phản ứng đặc hiệu với kháng thể được tạo ra Chúng phản ứng với cả thụ thể của tế bào T Trên mỗi phân tử kháng nguyên có các yếu tố quyết định kháng nguyên gọi là epitope và mỗi epitope đặc hiệu với một kháng thể do đó một kháng nguyên có thể liên kết với nhiều kháng thể tại các vị trí liên kết khác nhau Hai đặc tính quan trọng của kháng nguyên là: 1) tính kháng nguyên (có khả năng kích thích hệ miễn dịch của cơ thể); 2) tính miễn dịch (có khả năng kết hợp với kháng thể và các tế bào lympho) Kháng nguyên chia ra thành 2 loại kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức (yêu cầu sự tham gia của tế bào T) hoặc kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức (không yêu cầu sự tham gia của tế bào T để sản xuất kháng thể

mà trực tiếp kích hoạt tế bào B đặc hiệu) [14]

Kháng thể là các phân tử glycoprotein sản xuất bởi tế bào B của hệ miễn

dịch Mỗi phân tử kháng thể gồm 2 chuỗi polypeptide ngắn giống nhau được gọi là chuỗi nhẹ và 2 chuỗi polypeptide dài giống nhau được gọi là chuỗi nặng Bốn chuỗi này được liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide hình thành phân tử dạng chữ Y

- Mỗi chuỗi nhẹ gồm một vùng cố định (trình tự axit amin không thay đổi có thể là kappa - κ hoặc lamda - λ) và một vùng biến đổi (có trình tự axit amin biến đổi

là vị trí liên kết với kháng nguyên)

- Mỗi chuỗi nặng gồm ba hoặc bốn vùng cố định (CH1, CH2, CH3) và một vùng biến đổi (VH) đối xứng với vùng biến đổi của chuỗi nhẹ, có trình tự amino acid rất khác nhau giữa các phân tử kháng thể Hầu hết phần khác nhau này thuộc khu vực siêu biến đổi và thường chỉ gồm 6-10 amino acid Chuỗi nặng của kháng thể có thể là γ (IgG), α (IgA), µ (IgM), ε (IgE) hoặc δ (IgD), IgG, IgA và IgD có 3 vùng hằng định và một vùng bản lề, IgM và IgE có 4 vùng hằng định nhưng không

có vùng bản lề [17]

Kháng thể đơn dòng là kháng thể được sản xuất bởi một dòng tế bào B và nhận diện đặc hiệu một epitope trên kháng nguyên

Hình 1.4 Kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu

1.3.2 Vai trò và ứng dụng của kháng thể đơn dòng

Kháng thể đơn dòng là công cụ hữu ích trong nhiều nghiên cứu y sinh và có giá trị kinh tế cũng như giá trị y học lớn Một số lượng lớn kháng thể đơn dòng đã được ứng dụng cho chẩn đoán, trị liệu và các xét nghiệm có độ nhạy cao [18]

Một số ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong lĩnh vực khoa học, công nghệ, y tế [6]:

- Xác định hormon: Kháng thể đơn dòng được sử dụng để xác định mức

hormon trong máu, nước tiểu, nước bọt để chẩn đoán các bệnh liên quan đến tuyến nội tiết như định lượng các hormon LH, FSH, progesteron, ostrogen

- Trong phân loại vi sinh vật: Kháng thể đơn dòng giúp định loại vi khuẩn,

virus, nấm gây bệnh ở người, động vật

- Trong dược học: Nghiên cứu dược động học của thuốc (quá trình biến đổi

và đào thải của thuốc trong cơ thể) Dùng phát hiện các thuốc bị cấm sử dụng (doping, các chất gây nghiện), các chất độc hại với cơ thể tồn dư trong lương thực, thực phẩm

- Trong ghép tủy xương: Sau khi ghép tủy xương, muốn tránh hiện tượng đào

thải mảnh ghép, người ta phải sử dụng thuốc chống đào thải làm ức chế hệ miễn dịch dẫn đến hệ thống phòng ngự của cơ thể bị tê liệt, dễ nhiễm bệnh Đưa mAb đặc hiệu có định hướng vào cơ thể, chúng chỉ ức chế các yếu tố gây hiện tượng đào thải mảnh ghép mà không ức chế toàn bộ hệ thống miễn dịch của cơ thể, vì vậy mà sức

đề kháng của cơ thể ít bị suy giảm hơn

- Thử thai: Khi một người nữ mang thai, hormon HCG được bài tiết qua

nước tiểu Dung dịch mAb kháng HCG liên kết với một enzyme sẽ bị biến đổi màu khi có sự hiện diện của HCG (Human Chorionic Gonadotropin) Do đó, khi cho dung dịch này vào ống nghiệm đựng nước tiểu nếu nước tiểu đổi màu thì có thai và ngược lại

- Trong bệnh tim mạch: Tơ myosin là một loại tơ cơ cấu thành nên các tế bào

cơ Một phần myosin của cơ tim bị phá hủy sau cơn nhồi máu Bằng cách tiêm mAb đáp ứng với myosin ta có thể xác định được số lượng myosin mất để đánh giá tình trạng tổn thương của tim Kháng thể đơn dòng được dùng để xác định vị trí cục máu đông trong cơ thể bệnh nhân bằng cách gắn vào sợi fibrin khi có cục máu đông Việc này giúp các bác sĩ chẩn đoán và xử lý kịp thời

- Trong việc chống thải loại mô ghép: Kháng thể đơn dòng giúp xác định mô

người cho có tương thích với người nhận hay không và ngăn ngừa hệ thống miễn dịch của bệnh nhân thải loại mô ghép

- Trong lĩnh vực chẩn đoán: Việc ứng dụng mAb vào lĩnh vực chẩn đoán đã

đưa ra thị trường sản phẩm que thử nhanh, kit ELISA chẩn đoán nhanh (dựa trên phản ứng ngưng kết kháng nguyên và kháng thể) Đây là ứng dụng nổi bật và phổ biến nhất của mAb, trong đó mAb là yếu tố cơ sở không thể thiếu để sản xuất các

loại que thử nhanh, kit ELISA phát hiện nhiều loại kháng nguyên khác nhau như hormon (que thử thai phát hiện HCG, que thử phát hiện LH xác định rụng trứng ở phụ nữ), tác nhân gây bệnh, morphin, tồn dư kháng sinh, các dấu ấn ung thư như PSA, AFP

Hình 1.5 Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên - kháng thể

- Trong việc định nhóm máu hệ ABO và Rh: Kháng thể đơn dòng là những

công cụ thiết yếu trong nghiên cứu, điều trị và kỹ thuật chẩn đoán [7, 24] Nhưng thành công lớn của mAb là sử dụng trong miễn dịch, huyết học Ngày nay mAb dần thay thế kháng thể đa dòng vì tính đặc hiệu, khả năng cung cấp với số lượng lớn, chi phí sản xuất thấp

Trước đây, thuốc thử xác định nhóm máu hệ ABO là huyết thanh đa dòng có nguồn gốc từ người hoặc dịch chiết lectin của thực vật Ngày nay, mAb được sử dụng để tạo thuốc thử định nhóm máu hệ ABO [16] Kháng thể đơn dòng chuột có nhiều ưu điểm hơn so với kháng thể đa dòng có nguồn gốc từ người ở việc nhận diện kháng nguyên A và B yếu, không lẫn tạp kháng thể, giá thành thấp và không bị phụ thuộc Đã có nhiều công bố về việc sản xuất thành công mAb chuột để định nhóm máu hệ ABO Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều sinh phẩm định nhóm máu hệ ABO có bản chất là mAb đã được thương mại như: Febrile Antigen Reagents (Atlas Medical), Transclone (Biorad), Blood grouping anti sera (Maxwin

international), Blood Grouping (Prestige Diagnostics U.K.), ALBAclone (Quotient)

1.3.3 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng

Một vài phương pháp được sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng của người gồm: bất tử tế bào B, công nghệ phage display, chuột chuyển gen, công nghệ kháng thể đơn dòng tái tổ hợp [15]

 Bất tử tế bào B sản xuất kháng thể đơn dòng

Bất tử tế bào B được thực hiện bằng công nghệ lai tế bào hoặc công nghệ bất

tử EBV (Epstein-Barr virus) Với công nghệ lai tế bào, sự dung hợp giữa tế bào lympho B miễn dịch và tế bào myeloma (người hoặc chuột) tạo ra tế bào lai mang đặc tính của cả 2 dòng tế bào đó là khả năng sinh trưởng vô hạn và sản xuất kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên gây miễn dịch Biến nạp EBV là cách làm bất tử tế bào lympho B Tuy nhiên, tế bào lympho B biến nạp EBV không thể sinh trưởng vô hạn bởi vì chúng không phải là các tế bào ung thư, chúng khó nhân dòng và chỉ sản xuất một lượng nhỏ kháng thể Công nghệ tế bào lai - EBV được thiết lập dựa trên

sự kết hợp của 2 phương pháp và duy trì những ưu điểm của cả hai

 Công nghệ phage display sản xuất kháng thể đơn dòng

Công nghệ phage display chọn lọc các gen quy định vùng chức năng (vùng biến đổi) của kháng nguyên để biểu hiện các mảnh kháng thể chức năng Các bước chính trong phage display bao gồm: xây dựng thư viện kháng thể, biểu hiện trên bề mặt phage, lựa chọn phage biểu hiện kháng thể, sàng lọc phage biểu hiện kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đích

Mảnh gen VH và VL được khếch đại từ mARN của tế bào lympho B sử dụng RT-PCR Mảnh gen mã hóa vùng biến đổi chuỗi đơn (single chain fragment variable - scFv) được tạo ra bằng cách tổ hợp ngẫu nhiên mảnh gen VH và VL sử dụng PCR Thư viện sau đó sẽ được tách dòng để biểu hiện scFv trên bề mặt của thực khuẩn thể Lựa chọn phage biểu hiện scFv đặc hiệu với kháng nguyên mong muốn bằng cách cho các dòng thực khuẩn thể biểu hiện scFv liên liên kết với các kháng nguyên hoặc hapten khác nhau Các kháng thể không bám được loại bỏ bằng cách rửa sau đó kháng thể bám được rửa giải và nhân lên bằng cách lây nhiễm vào

E coli Lặp lại bước này một vài lần thì có thể lựa chọn được các mảnh scFv đặc

hiệu kháng nguyên Sau đó, sự đặc hiệu của mảnh scFv có thể được sàng lọc sử dụng phương pháp miễn dịch enzyme hoặc lọc tế bào hoạt hóa huỳnh quang nếu protein liên kết màng tế bào là đích Khi sự đặc hiệu đã được phân lập, gen của các vùng biến đổi kháng thể được đưa vào vector biểu hiện toàn bộ kháng thể người và chuyển vào tế bào để sản xuất kháng thể đơn dòng người Một thư viện phage display phân lập mAb đã được cấp phép bởi FDA và ít nhất 35 mARN người tạo ra

từ công nghệ phage display đã được thử nghiệm lâm sàng

 Chuột chuyển gen sản xuất kháng thể đơn dòng

Sử dụng chuột biến đổi gen là một kỹ thuật khác để tạo kháng thể đơn dòng

Kỹ thuật chuyển gen chuột gồm sự phân cắt các locus gen mã hóa chuỗi nặng, chuỗi

nhẹ của chuột và chuyển gen mã hóa chuỗi nặng, chuỗi nhẹ kappa của người vào

 Công nghệ kháng thể tái tổ hợp sản xuất kháng thể đơn dòng

Công nghệ kháng thể tái tổ hợp từ dòng tế bào B sản xuất kháng thể được tiến hành như sau:đầu tiên tiến hành phân lập được tế bào B đơn từ lách chuột hoặc

tế bào máu ngoại vi người (bằng vi hạt mang marker chọn lọc tế bào B) sau đó tách mRNA tổng hợp cDNA gen mã hóa cho các đoạn biến đổi trên chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể (bằng RT-PCR), tiến hành tổ hợp các gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (sử dụng kỹ thuật PCR overlapping), cuối cùng biểu hiện trong vector nhân

dòng để sản xuất kháng thể đơn dòng người đặc hiệu in vitro Đây là phương pháp

biểu hiện kháng thể đơn dòng người có hiệu quả cao, tạo ra lượng lớn kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên trong một thời gian ngắn và yêu cầu một số lượng

ít tế bào

 Công nghệ tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng

Tế bào lai là tế bào được tạo ra sau quá trình dung hợp 2 tế bào và có chức năng sinh tổng hợp các sản phẩm mong muốn Tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng (kháng thể đặc hiệu kháng nguyên) được tiến hành như sau: gây miễn dịch trên chuột với kháng nguyên đặc hiệu Sau một vài tuần, thu máu từ chuột đã gây miễn dịch để định lượng kháng thể trong huyết thanh Khi hiệu giá kháng thể

đủ cao, thu lách chuột để tách tế bào lympho B Dung hợp tế bào lympho và ung thư tủy myeloma thiếu gen HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase), nuôi cấy tế bào trong môi trường HAT (hypoxanthyl aminoteptrin thymidine) Tế bào myeloma mất khả năng tổng hợp kháng thể và thiếu enzyme HGPRT (enzyme cho phép tế bào tổng hợp purine từ hypoxanthine) Ban đầu, sự vắng mặt của HGPRT không phải là vấn đề vì tế bào có thể sử dụng con đường thay thế để tổng hợp purine Tuy nhiên, khi tế bào nuôi cấy trong môi trường aminoteprin, chúng không thể sử dụng con đường thay thế khác và nó phụ thuộc hoàn toàn vào HGPRT

để tồn tại Tế bào lympho B được phân lập từ chuột có enzyme HGPRT và cũng có khả năng sản xuất kháng thể, khi tiếp xúc với kháng nguyên nó sẽ biệt hóa thành tương bào plasma sản xuất kháng thể nhưng đó lại là giai đoạn cuối cùng của quá trình biệt hóa nên chúng không thể nhân lên trong nuôi cấy Do vậy, chỉ có tế bào lai mới có khả năng tồn tại trong môi trường HAT Dịch nuôi cấy tế bào lai được kiểm tra để tìm những tế bào sản xuất kháng thể mong muốn Sau khi tạo được dòng tế bào lai đặc hiệu kháng nguyên thì kháng thể đơn dòng được sản xuất bằng cách tiêm dòng tế bào lai này vào khoang bụng của chuột hoặc sử dụng kỹ thuật

nuôi cấy tế bào in vitro [20-22]

Đáp ứng miễn dịch ở động vật không chỉ phụ thuộc loại kháng nguyên mà còn còn phụ thuộc vào rất nhiều các yếu tố như kiểu hình di truyền của động vật chủ, liều lượng kháng nguyên, con đường gây miễn dịch và sự có mặt của các tá chất miễn dịch Cấu trúc di truyền của động vật chủ có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của động vật chủ cũng như cường độ của đáp ứng đó Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các gen trong phức hợp MHC có liên quan đến việc kiểm soát tính sinh miễn dịch của cơ thể Các protein là sản phẩm của các gen này tham gia vào quá trình trình diện kháng nguyên cho tế bào T và đóng vai trò trung tâm quyết định cường độ đáp ứng miễn dịch với một kháng nguyên Ngoài ra, đáp ứng miễn dịch của động vật chủ với một kháng nguyên còn phụ thuộc vào các gen

mã hóa các thụ thể của tế bào B, tế bào T nhận diện kháng nguyên và các gen mã hóa các protein khác tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch Sự thay đổi di truyền của tất cả các gen này sẽ ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch của động vật

chủ với một kháng nguyên đã biết trước

Tá dược là những chất khi được trộn với kháng nguyên sẽ làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên bằng cách kéo dài sự tồn tại của kháng nguyên trong

cơ thể của động vật gây miễn dịch Các tá chất của Freund gồm có kháng nguyên trong dung dịch nước, dầu khoáng và một chất nhũ hoá, tá chất này được phân tán dầu thành các giọt nhỏ bao quanh kháng nguyên vì vậy kháng nguyên được giải phóng rất chậm từ nơi tiêm vào cơ thể Tá chất Freund hoàn toàn (FCA) có

thêm Mycobarterium đã bị giết bằng nhiệt có hiệu lực cao hơn tá chất Freund không

hoàn toàn (FIA) bởi vì các thành phần muramyl dipeptide của vách tế

bào Mycobarterium sẽ hoạt hoá đại thực bào làm tăng hoạt động thực bào, kích

thích hoạt hoá các tế bào TH Cả hoạt động trình diện kháng nguyên và các tín hiệu đồng kích thích tế bào TH đều tăng lên khi có tá chất Do vậy, tá chất Freund được

sử dụng gây nhũ với hồng cầu để gây miễn dịch cho chuột [28-30]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất kháng thể đơn dòng tại Việt Nam

 Nghiên cứu về kháng thể đơn dòng tại Việt Nam

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về sản xuất kháng thể đơn dòng: Đỗ Thị Thảo và đồng tác giả (2008) đã thành công trong việc tạo dòng tế bào lai sinh mAb kháng protein vỏ VP28 của virus WSSV gây bệnh đốm trắng cho tôm sú; Nguyễn Thị Trang và đồng tác giả (2010) cũng tạo được polyhedrin của virus MBV gây bệnh còi trên tôm, progesteron-BSA AFP; Lê Quang Huấn và đồng tác giả đã nghiên cứu tạo mAb kháng tế bào ung thư vú bằng kỹ thuật phase display [1, 2] Tuy nhiên, đến nay chưa có báo cáo nào về việc tạo mAb kháng các kháng nguyên trên hồng cầu nhằm ứng dụng trong chẩn đoán và định nhóm máu tại Việt Nam

 Sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu dùng định nhóm máu ở Việt Nam

Trước đây, thuốc thử xác định nhóm máu hệ ABO là huyết thanh đa dòng có nguồn gốc từ người hoặc dịch chiết lectin của thực vật [14] Ngày nay, kháng thể đơn dòng được sử dụng để tạo thuốc thử xác định nhóm máu ABO Kháng thể đơn dòng chuột có nhiều ưu điểm hơn so với kháng thể đa dòng có nguồn gốc từ người bao gồm nhận diện kháng nguyên A và B yếu, loại bỏ kháng thể lẫn tạp, hiệu quả

giá thành và nguồn kháng thể có sẵn không phụ thuộc vào người Đã có nhiều báo cáo sản xuất thành công kháng thể đơn dòng chuột để xác định nhóm máu hệ ABO [23, 25] Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều thuốc thử xác định nhóm máu hệ ABO có bản chất là kháng thể đơn dòng đã được thương mại như: Febrile Antigen Reagents (Atlas Medical), Transclone (Biorad), Blood grouping anti sera (Maxwin international), Blood Grouping (Prestige Diagnostics U.K.), ALBAclone (Quotient) Tuy nhiên, kháng thể đơn dòng sử dụng để xác định nhóm máu hệ ABO vẫn chưa được sản xuất tại Việt Nam

Cho đến nay, Việt Nam chưa có đơn vị hay tổ chức nào sản xuất được mAb đặc hiệu dùng để định nhóm máu hệ ABO và hệ Rh Hầu hết huyết thanh mẫu đang được sử dụng để chẩn đoán nhóm máu đều nhập ngoại với giá thành khá cao Trước đây, Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương đã tự sản xuất huyết thanh mẫu từ huyết tương tách từ máu của nguời tình nguyện Phương pháp này tốn ít chi phí nhưng sử dụng nhiều máu thu gom từ tình nguyện viên Nếu tiếp tục sản xuất huyết thanh mẫu theo phương pháp này sẽ ảnh hưởng đến sản lượng máu dùng cho chữa bệnh, mà mục tiêu và ý nghĩa cao cả của hiến máu nhân đạo là để chữa bệnh cứu người khi cả thế giới chưa nghiên cứu được máu nhân tạo thay thế

Trên thị trường Việt Nam, một số công ty được Bộ Y tế cấp phép nhập khẩu huyết thanh mẫu có chứng chỉ CE như Bio-Rad Việt Nam và Biotech Việt Nam Biotech Việt Nam phân phối huyết thanh mẫu do hãng Spinreact, Tây Ban Nha sản xuất với giá 280.000 đồng/bộ gồm 3 lọ huyết thanh anti A, anti B và anti AB (mỗi

lọ 10 ml) Còn hãng Bio-Rad đang chào bán huyết thanh mẫu với giá 600.000 đồng/bộ gồm 3 lọ huyết thanh anti A, anti B và anti AB (mỗi lọ 10 ml) Như vậy, số tiền cần bỏ ra để nhập khẩu huyết thanh mẫu đủ để định nhóm máu hệ ABO thu gom hàng năm khoảng vài chục tỷ đồng, và để xét nghiệm nhóm máu hệ ABO trên toàn quốc lên đến vài trăm tỷ đồng Đây là con số thực sự lớn trong bối cảnh nước

ta còn nghèo nhưng người bệnh lại phải chi trả tiền thuốc men chữa trị quá lớn

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

Động vật gây miễn dịch: Chuột BALB/c do Học Viện Quân y cung cấp

được dùng làm vật chủ để gây miễn dịch với những ưu điểm sau: Sinh sản nhanh và chi phí nuôi rẻ nên được chọn làm nguồn cung cấp tế bào lympho; Tỉ lệ mắc ung thư rất thấp nhưng rất nhạy cảm với các chất gây ung thư; Có khả năng sản xuất u tương bào khi gây đáp ứng miễn dịch với dầu khoáng để sản xuất kháng thể đơn

dòng

Dòng tế bào myeloma: Dòng tế bào myeloma sp2/0 của hãng ATCC được sử

dụng làm nguồn tế bào dung hợp (do TS Lê Văn Phan- Học Viện Nông Nghiệp cung cấp)

2.1.2 Sinh phẩm

Bộ hồng cầu mẫu: hồng cầu mẫu ABO 5% do Viện huyết học và Truyền

máu Trung ương cung cấp được sử dụng làm tác nhân gây miễn dịch và là panel hồng cầu sàng lọc dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng gây ngưng kết đặc hiệu hồng cầu mẫu

Mẫu máu toàn phần: 400 mẫu máu (100 mẫu mỗi nhóm máu) thu thập từ

các bệnh nhân và người tình nguyện tại Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp – Hải Phòng

dùng để nghiên cứu, xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của các kháng thể đơn dòng

Bộ huyết thanh mẫu: gồm anti-A, anti-B, anti-AB được mua của công ty

Biorad (Pháp) làm đối chứng dương trong các thí nghiệm nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy tế bào: Môi trường DMEM, RPMI 1640 (Gibco, Mỹ);

Môi trường chọn lọc HAT (78% DMEM, 20% FBS, 2% HAT 50x); Môi trường HT (78% DMEM, 20% FBS, 2% HT 50x); Huyết thanh Fetal Bovine Serum - FBS

(Sigma, Mỹ)

Các dung dịch: Dung dịch PBS (0,01 M Na2HPO4, 0,002 M KH2PO4; 0,0027 M KCl; 0,137 M NaCl, pH 7,4, ở 25°C); NaCl 0,9% (9 g NaCl + 1000 ml

H2O); (NH4)2SO4 bão hòa 100% (541,8g (NH4)2SO4 bổ sung nước để được 1000 ml); EDTA 0,5 M (18,612 g EDTA.Na.2H2O bổ sung vào 80 ml H2O khử ion Dùng NaOH 10N để chỉnh pH=8); Tá chất hoàn toàn Freund’s complete adjuvant - FCA, tá chất không hoàn toàn Freund’s incomplete adjuvant - FIA, chất bảo quản đông lạnh Dimethylsulfoxide - DMSO, tác nhân dung hợp 50% Polyethylene Glycol 1500 - PEG 1500 (Sigma, Mỹ); Kit xác định phân lớp kháng thể đơn dòng chuột bằng ELISA (Pierce® Rapid ELISA mouse mAb isotyping kit - Thermo, Mỹ); Các hóa chất khác (Merck, Đức)

2.1.3 Máy móc và thiết bị

Các máy móc thiết bị của Phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam được sử dụng cho nghiên cứu: Tủ nuôi cấy tế bào động vật (Panasonic, Nhật), tủ cấy an toàn cấp 2 (Esco, Singapo), pipet điện cầm tay, máy li tâm (Eppendorf, Mỹ), máy khuấy từ (Ika werke, Đức), kính hiển vi phản pha (Olympus, Philippines), tủ lạnh (Sanyo, Nhật), bình bảo quản mẫu chứa nitơ lỏng (Taylor Wharton, Mỹ) và các thiết bị khác

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Gây miễn dịch và đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch

2.2.1.1 Gây miễn dịch trên chuột Balb/c

 Nguyên lý

Gây miễn dịch là quá trình kích thích cơ thể hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể bằng cách tiêm các kháng nguyên vô hại hoặc chất kích thích miễn dịch (tá chất), nhằm mục đích hoạt hóa tế bào B đặc hiệu kháng nguyên cho tạo tế bào lai Trong đáp ứng miễn dịch dịch thể, khi cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên qua quá trình gây miễn dịch với tá chất tương ứng dẫn đến hoạt hóa và mở rộng dòng tế bào

B đặc hiệu Trong lần tiếp xúc kháng nguyên thứ 2, các tế bào lympho B biệt hóa thành tế bào plasma tiết kháng thể hoặc tế bào B nhớ Hầu hết tế bào plasma có đời sống ngắn được duy trì trong cơ quan lympho thứ cấp (hạch lympho) Có rất nhiều

con đường gây miễn dịch cho chuột bao gồm: tiêm dưới da, tiêm trong da, tiêm cơ, tiêm vào xoang bụng, tiêm tĩnh mạch, tiêm não, tiêm ngực, tiêm mũi Gây miễn dịch qua bàn chân chuột là phương pháp phổ biến được sử dụng để gây miễn dịch cho chuột Đây là phương pháp kết hợp giữa tiêm dưới da và tiêm trong da Các tế bào lympho sẽ được tập trung chủ yếu ở hạch lympho vùng kheo ở chân [24-27]

 Quy trình gây miễn dịch trên chuột BALB/c

Chuẩn bị hồng cầu mẫu:

- Dung dịch hồng cầu mẫu B 5% được chuyển toàn bộ vào fancol 15 ml, ly tâm 1000 rpm trong 5 phút Loại bỏ dịch nổi, thu cặn hồng cầu

- Cặn hồng cầu được tái huyền phù vào 10 ml nước muối sinh lý, ly tâm

1000 rpm trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi, tiếp tục thu cặn hồng cầu

- Bước trên được lặp lại cho đến khi sạch sắc tố do hồng cầu vỡ giải phóng ra

- Hồng cầu mẫu B được pha loãng 5% để gây nhũ hóa

Quy trình gây miễn dịch:

- Hồng cầu mẫu B 5% được nhũ hóa với tá chất Freund (FCA hoặc FIA) theo

tỉ lệ 1:1 tạo thành nhũ tương;

- Chuột BALB/c được tiêm 150 µl nhũ tương vào theo 3 con đường (tiêm dưới da, tiêm vào xoang bụng và tiêm bắp) và gây miễn dịch trong 3 lần (lần tiêm đầu sử dụng tá chất FCA và hai lần tiêm sau sử dụng tá chất FIA) Khoảng cách giữa các lần tiêm là 3 ngày

- Chuột BALB/c sau khi được gây miễn dịch sẽ tiến hành thu máu ở đuôi Phân lô chuột:

- Chuột được phân làm 3 lô gồm: tiêm dưới da, tiêm xoang bụng và tiêm bắp Mỗi lô gồm 3 chuột

- Mỗi chuột BALB/c sẽ được tính hiệu giá kháng thể riêng, sau đó cộng kết quả trung bình từ 3 con chuột để xác định hiệu giá trung bình

- Dựa trên hiệu giá kháng thể để xác định vị trí gây miễn dịch thu được

hiệu quả cao nhất

Hình 2.1 Chuẩn bị vật liệu gây miễn dịch cho chuột (tá chất và hồng cầu mẫu

được nhũ hóa bằng dụng cụ trộn)

C

Hình 2.2 Gây miễn dịch cho chuột bằng cách tiêm vào hai gan bàn chân chuột

A Chuột trước khi gây miễn dịch; B Tiêm kháng nguyên dưới da gan bàn chân