Chương 5 Tạo dòng genomic DNA của eukaryote và xây dựng thư viện genomic DNA

Mục đích : Kỹ thuật lai Southern Xác định có hay không sự hiện diện của gen ? Xác định số bản sao của gen đó trong genome Nguyên tắc: Dựa vào sự lai phân tử Các thí nghiệm lai trên màng thường được tiến hành bằng cách đánh dấu mẫu dò bằng 32P Tuy nhiên,các phương pháp không dùng đồng vị phóng xạ (ví dụ: digoxigenindUTP) ngày càng được sử dụng phổ biến

Th vi n genomic DNA ư ệ

 Khái ni m ệ

 Xây d ng th vi n : 4 giai đo n ự ư ệ ạ

Nội dung Tạo dòng genomic DNA của eukaryote và xây dựng

thư viện genomic DNA

RE

II T o dòng các đo n DNA đ xây d ng th vi n ạ ạ ể ự ư ệ

Vector Năm đưa vào sử dụng Vật chủ Cấu trúc Kích thước đoạn chèn (kb)

III Đóng gói in vitro DNA tái t h p và xâm nhi m vào tb v t ch ổ ợ ễ ậ ủ

V i vector là bacteriophage lamda, cosmid, th tái t h p ớ ể ổ ợ

tr n c a 2 lo i này không th chuy n vào VK ầ ủ ạ ể ể

V i vector là bacteriophage lamda, cosmid, th tái t h p ớ ể ổ ợ

tr n c a 2 lo i này không th chuy n vào VK ầ ủ ạ ể ể Đóng gói in vitro DNA

 Nguyên lý s đóng gói ự in vitro

 Giai đo n xâm nhi m ạ ễ

IV Phân tích genomic DNA b ng lai Southern ằ

Đ nh nghĩa ị

M c đích ụ : K thu t lai Southern ỹ ậ

* Xác đ nh có hay không s hi n di n c a gen ? ị ự ệ ệ ủ

* Xác đ nh s b n sao c a gen đó trong genome ị ố ả ủ

Nguyên t c ắ : D a vào s lai phân t ự ự ử

Cách ti n hành lai Southern : 3 b ế ướ c

Chuy n DNA t agarose gel lên màng lai ể ừ

Lai các nucleic acid đ ượ c c đ nh trên màng v i ố ị ớ

các m u dò đ ẫ ượ c đánh d u ấ Lai các nucleic acid đ ượ c c đ nh trên màng v i ố ị ớ

các m u dò đ ẫ ượ c đánh d u ấ

Genomic DNA đ ượ c c t b ng 1 ho c 1 vài RE ắ ằ ặ  t p h p các đo n DNA đ ậ ợ ạ ượ c phân tách theo kích th ướ c b ng đi n di ằ ệ agarose gel

L ượ ng m u: ẫ

- 2-10µg đ i v i genomic DNA ố ớ

- N u m u DNA đ ế ẫ ượ ạ c t o dòng trong plasmid ho c phage ặ  1 l ượ ng ít h n nhi u (kho ng vài picogram) ơ ề ả

Phân tách các đo n c t h n ch c a genomic DNA ạ ắ ạ ế ủ

SM PC 1 2 3 4 5 6

- SM: Chỉ thị kích thước chuẩn của DNA DNA của

bacteriophage λ được phân cắt bằng HindIII hoăăc 1-kb

ladder DNA là các chỉ thị kích thước chuẩn của DNA thông

dụng nhất cho Southern blot

- PC: đối chứng dương tính (đoạn DNA làm mẫu

2 Chuyển DNA từ agarose gel lên màng lai

(Đun 800 C, chân không)

Dài 2h

Giấy lọc

Gel

Màng lai

Giấy lọc Cathode (-)

Anode (+)

Đệm chuyển Giấy lọc Gel Màng Giấy lọc Giấy bổi Vật nặng 500 g

S đ th m tích n a khô ơ ồ ẩ ử

S đ th m tích n a khô ơ ồ ẩ ử

S đ th m tích mao d n ơ ồ ẩ ẫ

S đ th m tích mao d n ơ ồ ẩ ẫ

T i thi u các lk không đ c hi u v i màng lai và DNA không ph i ố ể ặ ệ ớ ả

chu i đích ỗ

T i đa ph n ng lai đ c hi u c a m u dò v i DNA chu i đích ố ả ứ ặ ệ ủ ẫ ớ ỗ

3 Lai m u dò – các DNA đ ẫ ượ c c đ nh ố ị

Các đi u ki n ti n lai và lai ề ệ ề

C ườ ng l c ion cao ự

C ườ ng l c ion cao ự

Các tác nhân ngăn ch n lk ặ không đ c hi u ặ ệ

Các tác nhân ngăn ch n lk ặ không đ c hi u ặ ệ

M u dò-màng lai: ẫ dd Denhardt, s a ữ khô không ch t béo ho c ch t t y SDS ấ ặ ấ ấ

M u dò-DNA không là chu i đích: ẫ ỗ

Salmon sperm DNA ho c thymus DNA ặ

Tm c a m u dò và DNA ủ ẫ

s i đôi ợ

Tm c a m u dò và DNA ủ ẫ

s i đôi ợ

Nhi t đ nóng ch y c a DNA s i đôi   ệ ộ ả ủ ợ

Tm(oC) = 81,5oC + 16,6 (log10M) + 0,41 (%G + C) - 0,72 (%f ) - 500/n

Nhi t đ nóng ch y đ ệ ộ ả ượ c dung cho th lai RNA-DNA: ể

Tm (oC) = 79,8oC + 18,5 (log10M) + 0,58 (%G + C) - 11,8 (%G + C)2

- 0,56 (%f ) - 820/n  

Trong đó

M là n ng đ phân t c a các cation hóa tr 1 (đ c tr ng là Na ồ ô ử ủ ị ặ ư +)

(%G + C) là n ng đ ph n trăm c a guanine và cytosine ồ ô ầ ủ

(%f) là % c a formamide (t/n làm m t s n đ nh c a xo n đôi) ủ ấ ự ổ ị ủ ắ

n là chi u dài c a th lai (theo base) ề ủ ể

Áp d ng v i các DNA s i đôi dài h n 100-200 nucleotide ụ ớ ợ ơ

Áp d ng v i các DNA s i đôi dài h n 100-200 nucleotide ụ ớ ợ ơ

*C ườ ng l c dùng trong các TN lai là s ngh ch đ o c a giá tr chu n C ự ố ị ả ủ ị ẩ

C = Tm – Ti

Thông th ườ ng các các ph n ng lai và các b ả ứ ướ c r a đ u tiên đ ử ầ ượ c ti n hành ế ở

đi u ki n c ề ệ ườ ng l c th p (~ C cao) và tăng d n các b ự ấ ầ ở ướ c ti p theo ế

Chú ý :Tm c a các m u dò oligonucleotide ng n h n 50 nucleotide th ng ủ ẫ ắ ơ ườ

đ ượ c tính b ng bi u th c: ằ ể ứ

Tm (oC) = 4 (G + C) + 2(A + T)

*Các thí nghi m lai trên màng th ệ ườ ng đ ượ c ti n hành b ng cách đánh d u m u dò b ng ế ằ ấ ẫ ằ 32P

*Tuy nhiên,các ph ươ ng pháp không dùng đ ng v phóng x (ví d : digoxigenin-dUTP) ngày càng đ ồ ị ạ ụ ượ c

s d ng ph bi n ử ụ ổ ế

Hình 5.7 Hình ảnh phân tích Southern blot của hai thí nghiệm khác nhau Các băng màu đen là tín hiệu lai giữa DNA đích và mẫu dò.

A) Hình ảnh phóng xạ tự ghi trên phim X-quang

với mẫu dò được đánh dấu 32P

B) Hình ảnh bắt màu trên màng lai Hybond-N với mẫu dò được đánh dấu digoxigenin-dUTP

Nguồn gốc các

vector

Virus

Plasmid hoặc BAC,YAC

Plasmid hoặc BAC,YAC

Khuẩn lạc

Sinh tan tế bào bị xâm nhiễm Vết tan (plaque)

* V Sàng lọc thư viện genomic DNA

*V Sàng lọc thư viện genomic DNA

Các vector trong tạo

dòng

Chứa các gen chỉ thị cho phép chọn lọc những tế

bào vật chủ mang vector

Chứa các gen bổ sung

1 Đánh dấu ở đuôi

2 Đánh dấu bằng dịch chuyển điểm đứt

3 Đánh dấu bằng kéo dài primer

* VI Các phương pháp đánh dấu đoạn DNA bằng phóng xạ

*VI Các phương pháp đánh dấu đoạn DNA bằng phóng xạ

2 Đánh dấu bằng dịch chuyển điểm đứt

3 Đánh dấu bằng kéo dài primer

Click to edit Master text styles

Second level

Third level

Fourth level

Fifth level

Lập bản đồ vật lý của DNA

Sản xuất các dòng mang các đoạn chèn DNA khác nhau

Xác định gen gây xơ nang

Xác định các gen gây bệnh hoặc các chuỗi DNA quan tâm cho những nghiên cứu xa hơn

Xác định các gen gây bệnh hoặc các chuỗi DNA quan tâm cho những nghiên cứu xa hơn

Sử dụng trong quá trình chromosome walking

VII Ứng dụng của thư viện genomic DNA

1 Phương pháp hóa học Maxam-Gilbert

2 Phương pháp enzyme Sanger

3 Xác định trình tự nucleotide trên máy tự động

VIII Phân tích trình tự của đoạn DNA được tạo dòng

1 Phương pháp hóa học Maxam-Gilbert

2 Phương pháp enzyme Sanger

Liên quan đến phát hiện huỳnh quang của nucleotide được đánh

dấu

Liên quan đến phát hiện huỳnh quang của nucleotide được đánh

dấu

Phân tích DNA bằng khối phổ

Điện di mao quản hoặc lai với các đoạn oligonucleotide được

Hình : Máy phân tích trình t nucleotide t đ ng và hình nh đi n di các băng DNA phát huỳnh quang ự ự ộ ả ệ quan sát đ ượ c trên máy đ c ọ

THANK YOU