Tách dòng biểu hiện gene Xyna từ Bacillus Subtilis CN2 trên E Coli BL21 và nghiên cứu đặc tính của Xylase tái tổ hợp

Tách dòng biểu hiện gene Xyna từ Bacillus Subtilis CN2 trên E Coli BL21 và nghiên cứu đặc tính của Xylase tái tổ hợp Tách dòng biểu hiện gene Xyna từ Bacillus Subtilis CN2 trên E Coli BL21 và nghiên cứu đặc tính của Xylase tái tổ hợp luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

DƯƠNG THỊ LƯƠNG LIÊN

SUBTILIS CN2 TRÊN E COLI BL21 VÀ NGHIÊN C ỨU ĐẶC

LU ẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà N ội – 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Dương Thị Lương Liên xin cam đoan nội dung trong quyển luận văn này với đề tài “Tách dòng, biểu hiện gene xynA từ B subtilis CN2 trên E coli BL21

và nghiên cứu đặc tính của enzyme xylanaseA tái tổ hợp” là công trình nghiên cứu

và sáng tạo do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trần Liên Hà -

Bộ môn Vi sinh - Hoá sinh và Sinh học phân tử - Viện Công nghệ Sinh học và Thực

phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và sự giúp đỡ của TS Ogasawara Wataru Khoa Kỹ thuật Sinh học - Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Nhật Bản

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ogasawara Wataru và TS Takanori Furukawa người đã hướng dẫn và tận tình chỉ bảo cho tôi trong thời gian tôi học tập

và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của PGS TS Ogasawara, Khoa Kỹ thuật Sinh

học Trường Đại học Công nghệ Nagaoka, Nhật Bản Nơi mà tôi đã thu được rất nhiều kiến thức và kinh nghiệm thực tế, giúp tôi trưởng thành hơn trong nghiên cứu

và làm chủ được kiến thức của mình

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể các bạn sinh viên và toàn

thể cán bộ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học C4 – 401 và toàn thể các thầy cô

và bạn bè trong viện, trong phòng thí nghiệm vi sinh C10, và các thành viên của phòng thí nghiệm TS Ogasawara đã giúp đỡ và tạo điều kiện rất nhiều cho tôi trong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng là lòng biết ơn tới bố, mẹ, anh, chị, em trong gia đình tôi, những người bạn của tôi, những người luôn động viên và luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian học

Hà Nội, ngày 29 tháng 11 năm 2011

Học viên

Dương Thị Lương Liên

MỤC LỤC5 - iii 5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT5 - vi 5

DANH MỤC CÁC BẢNG5 - viii 5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ5 - ix 5

MỞ ĐẦU5 - 1 5

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN5 - 4 5

TÀI LIỆU THAM KHẢO5 - 78 5

PHỤ LỤC5 - 84

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

STT Ký hiệu Tên đầy đủ

1 Amax Optical density maximum (mật độ quang cực đại)

2 Amp Ampicillin

3 APS Ammonium persulfate

4 B subtilis Bacillus subtilis

13 DMSO Dimethyl sulfoxide

14 DNA Deoxyribonucleic acid

15 dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

16 DTT Dithiothreitol

17 E coli Escherichia coli

18 EDTA Ethylen diamin tetra acetate

19 EtBr Ethydium bromide

20 EtOH Ethanol

21 IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

22 kDa Kilo Dalton

23 kV Kilo volt

24 LB Luria-Bertani

25 mRNA Messenger RNA (RNA thông tin)

26 MW Molecular weight (khối lượng phân tử)

27 NTA Nitriloacetic acid

28 nu Nucleotide

29 OD Optical density (mật độ quang)

30 PCR Polymerase Chain Reaction

31 PDA Potato Dextrose Agar

32 rpm Revolutions per minute (vòng/phút)

33 SDS Sodium dodecyl sulphate

34 SDS-PAGE 5Sodium dodecyl sulfate5 polyacrylamide gel ectrophoresis

35 SLS Sample loading solution (dung dịch tra mẫu)

41 TE-RNase Tris-EDTA- Ribonuclease

42 Tm Temperature melting (nhiệt độ nóng chảy)

43 X-gal 5-bromo-4-chloro-indolyl-galactopyranoside

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần và chu kì nhiệt của phản ứng PCR 25

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn của pET22b(+) 28

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn của sản phẩm PCR 28

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng loại bỏ nhóm phosphat của vector 29

Bảng 2.5: Nồng độ khuôn DNA cho phản ứng giải trình tự 35

Bảng 3.1: Bảng mô tả độ tương đồng gene xynA từ B subtilis CN2 với các trình tự khác từ ngân hàng Genbank 56

Bảng 3.2: Các đặc điểm của xylanase từ các chủng thuộc chi Bacillus khác nhau 67

Bảng 3.3: Kết quả tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ E coli BL21 (DE3) 70

Bảng 4.1: Giá trị OD đo được tương ứng với nồng độ xylose 89

Bảng 4.2: Giá trị OD đo được tương ứng với nồng độ BSA 89

Bảng 4.3: Thành phần Gel 15% cho 2 bản gel 89

Bảng 4.4 Đệm sodium phosphate 90

Bảng 4.5: Đệm sử dụng để xác định độ bền pH 90

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1: D ạng đơn giản của xylan 4

Hình 1.2: D ạng phức tạp của xylan 4

Hình 1.3: Đơn vị cấu trúc của xylan từ cỏ [8] 5

Hinh 1.4: C ấu hình không gian của G11 xylanase từ Bacillus subtilis (XYNA) 8

Hình 1.5: H ọ 11 xylanase từ Bacillus circulans (1XNB) và Trichoderma harzianum (1XND) 9

Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của xylanse dạng đơn giản 10

Hình 1.7: V ị trí tấn công của endo-1,4-β-xylanase trên mạch xylan 11

Hình 1.8: Cơ chế thủy phân xylan của 1XNB 12

Hình 1.9: C ấu trúc của xylan và vị trí cắt các enzyme trong quá trình sản xuất giấy 15

Hình 1.10: Các d ạng sản phẩm xylanase trên thị trường 17

Hình 2.1: Ph ản ứng nối vector pUC118 và gene xynA 29

Hình 2.2: Ph ản ứng chèn xynA gene vào pET22b(+) 30

Hình 2.3: Vector bi ểu hiện pET22b(+) 37

Hình 2.4: Nguyên t ắc phương pháp sắc ký ái lực sử dụng NiP 2+ P 42

Hình 3.1: Điện di DNA tổng số tách từ B subtilis CN2 trên gel agarose 1% 46

Hình 3.2: Trình t ự mồi xuôi và mồi ngược 47

Hinh 3.3: V ị trí cắt enzyme giới hạn của xynA mang kí hiệu AF027868.1 48

Hình 3.4: K ết quả chạy PCR với cặp mồi đã thiết kế 49

Hinh 3.5: Điện di đồ kết quả các thao tác thực hiện trước khi nối 50

Hình 3.6: Ch ọn lọc khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp pUC118-xynA trên môi trường ch ứa X-gal-IPTG 51

Hình 3.7: Khu ẩn lạc sau khi biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-xynA vào E coli DH5α 51

Hình 3.8: Điện di đồ kết quả tách plasmid pET22b (+) tái tổ hợp và cắt bằng enzyme gi ới hạn 52

Hình 3.9: Điện di đồ kết quả tách plasmid pUC118 tái tổ hợp và cắt bằng enzyme gi ới hạn 53

Hình 3.10: Điện di đồ tinh sạch plasmid pET-xynA bằng PEG 54

Hình 3.11: Tinh s ạch vector pUC-xynA bằng PEG và cắt bằng enzyme giới hạn 55

Hình 3.12: Trình t ự nu của gene xynA từ B subtilis CN2 56

Hình 3.13: So sánh trình t ự gene xynA chủng B subtilis CN2 với đoạn gene mã hoá

xylanse được công bố trên cơ sở dữ liệu NCBI với số hiệu AJ536759.1 57

Hình 3.14: Trình t ự acid amin của xylanase A của B subtilis CN2 58

Hình 3.15: C ấu trúc domain và phân loại xylanase từ B subtilis CN2 58

Hình 3.16: So sánh trình t ự tương đồng các acid amin của xylanase từ B subtilis CN2 v ới trình tự chuỗi acid amin đã được công bố mã hiệu ACP87391.1 59

Hình 3.17: Hình ảnh khuẩn lạc E coli BL21 sau khi biến nạp với pET22b(+) chứa gene xynA 60

Hình 3.18: Điện di đồ protein tan và không tan ở 37°C và nồng độ IPTG khác nhau 61

Hình 3.19: Đồ thị hoạt tính xylanase tái tổ hợp đạt được với cảm ứng IPTG khi thay đổi điều kiện nuôi cấy 61

Hình 3.20: Điện di đồ protein tan với nhiệt độ và nồng độ IPTG khác nhau 62

Hình 3.21: Điện di đồ protein không tan với nhiệt độ và nồng độ IPTG khác nhau 62 Hình 3.22: Điện di đồ enzyme tái tổ hợp biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau khi dùng α-lactose làm chất cảm ứng 64

Hình 3.23: Đồ thị hoạt tính xylanase tái tổ hợp đạt được với cảm ứng α- lactose khi thay đổi điều kiện nuôi cấy 65

Hình 3.24: Vòng thu ỷ phân của xylanase tái tổ hợp trên môi trường đặc chứa xylan 66

Hình 3.25: Độ bền pH của enzyme thô trước khi tinh sạch 67

Hình 3.26: Điện di đồ protein tái tổ hợp sau khi tinh sạch bằng NiP 2+ P 69

Hình 3.27: Điện di đồ protein tái tổ hợp sau khi tinh sạch bằng nhựa TALON 69

Hình 3.28: Độ bền pH của enzyme tái tổ hợp sau tinh sạch với Co2+ 72

Hình 3.29: pH t ối ưu của enzyme tái tổ hợp sau tinh sạch với CoP 2+ P 73

Hình 3.30: Nhi ệt độ tối ưu của enzyme tái tổ hợp sau tinh sạch với CoP 2+ P 74

Hình 3.31: Độ bền nhiệt của enzyme tái tổ hợp sau tinh sạch với CoP 2+ P 75

Hình 3.32: Độ bền nhiệt của enzyme sử dụng nước đề ion ủ trước phản ứng 76

Hình 4 1: Đường chuẩn xylose 89

Hình 4 2: Đường chuẩn Bradford 89

MỞ ĐẦU

Ngày nay nhiên liệu như xăng, dầu, chất đốt, … là một thuật ngữ quen thuộc và phổ biến trong mọi tầng lớp cư dân, nó vô cùng quan trọng và cần thiết trong sinh hoạt cũng như các hoạt động công nghiệp, nó tạo ra nguồn năng lượng cung cấp cho máy móc hoạt động, tạo ra điện, … Nếu không có nhiên liệu thì nền kinh tế không thể phát triển, đời sống con người không thể nâng cao, cuộc sống của con người gặp nhiều khó khăn Từ xưa đến nay con người chủ yếu sử dụng nguồn nhiên liệu khai thác từ tự nhiên hay nguyên liệu hoá thạch từ lòng đất Nhưng do sự khai thác quá mức của con người, hơn nữa sự tạo thành nhiên liệu hoá thạch này đòi

hỏi sự vắng mặt của oxy, áp suất, nhiệt độ (chu trình C) và mất từ hàng chục triệu đến hàng trăm triệu năm Theo ước tính của liên hợp quốc và các quốc gia giàu trữ lượng về dầu mỏ thì hàng năm tổng lượng khai thác của con người hàng tỷ tấn dầu thô, và hàng tỷ tỷ mP

3 Pkhí gas Sự chênh lệch quá lớn giữa sự hình thành và khai thác

dẫn đến lượng nhiên liệu hoá thạch ngày càng cạn kiệt, giá nhiên liệu tăng cao dẫn đến rất nhiều vấn đề tranh chấp, chiến tranh bùng nổ xảy ra giữa các nước, đời sống con người khó khăn, và tất nhiên lượng nhiên liệu khai thác khó có thể đáp ứng đủ nhu cầu của con người Từ đây đòi hỏi phải có sự thay thế nguồn nhiên liệu hoá

thạch bằng một nguồn nhiên liệu khác Nhiên liệu sinh học được các nhà khoa học

và các nước đặc biệt quan tâm nhờ nguồn sinh khối sinh vật sẵn có trên trái đất với

khối lượng lớn, giá thành rẻ có thể phục hồi nhanh chóng, đồng thời giảm thiểu được ô nhiễm môi trường

Hiện tại có một thách thức đặt ra là giá thành của nhiên liệu sinh học còn cao chưa thể cạnh tranh với nhiên liệu hoá thạch Do chúng ta vẫn đang trong giai đoạn tìm kiếm và nghiên cứu công nghệ sản xuất tối ưu và phù hợp với thực tiễn Trữ lượng lớn về số lượng C cố định trong tự nhiên là sinh khối tế bào thực vật, nó gồm

có ba thành phần polymer chính: cellulose chiếm 35-50% , hemicellulose chiếm 35%, và lignin chiếm 10-20% sinh khối Vì vậy sự sử dụng một cách có hiệu quả nguồn sinh khối tự nhiên đóng vai trò hết sức quan trọng nên việc nghiên cứu hệ enzyme phân huỷ lignocelluloses là vô cùng cần thiết Cellulase là enzyme phân

23-huỷ cellulose đã được nghiên cứu từ khá lâu và cũng đã đạt được những thành công

nhất định Enzyme phân huỷ hemicellulose và lignin cũng đang được các nhà nghiên cứu quan tâm Sự phổ biến của xylan trong hemicellulose cho chúng ta thấy

rằng enzyme tổng hợp có hoạt tính phân huỷ xylan đóng vai trò quan trọng trong sự

biến đổi sinh học Các sản phẩm thủy phân từ lignocellulose tạo thành đường đơn

và những mạch polymer ngắn từ đó dễ dàng biến đổi thành nhiên liệu lỏng, protein đơn bào, dung môi và các sản phẩm khác bằng việc sử dụng vi sinh vật lên men đã được chọn lọc

Các quá trình biến đổi sinh học và loại trừ các phần thừa và phần không sử

dụng sinh ra từ nông nghiệp, lâm nghiệp có sự hấp dẫn đặc biệt giúp tận dụng nguồn thải và giảm ô nhiễm môi trường Không chỉ vậy xylanase cũng có nhiều tính

chất đặc biệt hữu ích có thể ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp và thương

mại như công nghiệp giấy, bột giấy, thức ăn gia súc, công nghiệp bánh mỳ Những ứng dụng khác trong lĩnh vực bia rượu, nước giải khát, [20] Do vậy trong những

thập niên gần đây các nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về enzyme này

Sử dụng enzyme vi sinh vật cho quá trình thủy phân công nghiệp của lignocellulose có nhiều ưu điểm vì tính ôn hòa của điều kiện phản ứng, tuy nhiên

hoạt tính và khả năng xúc tác quá trình phân huỷ cơ chất thì rất cao Hiện nay enzyme nói chung và xylanase nói riêng có giá thành còn rất cao nên đòi hỏi chúng

ta cố gắng khai thác các vi sinh vật có khả năng sinh enzyme với số lượng lớn, hoạt tính cao đáp ứng cho quá trình phân hủy sinh học Hơn nữa ngày nay enzyme ứng

dụng trong các quá trình công nghiệp đòi hỏi thực hiện phản ứng ở các điều kiện

khắc nghiệt hơn về nhiệt độ, pH và thời gian dài Nên việc tìm kiếm những vi sinh

vật có khả năng tạo ra những enzyme có đặc điểm đáp ứng nhu cầu thực tiễn luôn luôn được đặt ra

Một câu hỏi lớn được quan tâm là những vi sinh vật có chứa gene có khả năng sinh enzyme cao, song chỉ những trường hợp thiếu chất dinh dưỡng thì nó mới

biểu hiện, hoặc nó không chỉ tạo ra một loại enzyme ta cần với nồng độ cao mà còn nhiều loại enzyme khác có thể gây ức chế enzyme ta cần, hoặc những vi sinh vật đó gây độc cho những sản phẩm quá trình lên men, Vì vậy làm thế nào để chúng ta

có thể ứng dụng chủng đó vào sản xuất hay tạo chủng sản xuất enzyme mà ta muốn

có nồng độ cao mà vẫn đảm bảo an toàn cho các sản phẩm sử dụng cho mục đích tiêu dùng hay những mục đích khác Và chính việc giải quyết những câu hỏi tương

tự như vậy đã khiến cho các nhà khoa học quan tâm đến việc tách dòng và biểu hiện gene xylanase từ rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau lên các vi sinh vật có sức chịu đựng tốt, phát triển nhanh và không gây độc (loại bỏ các gene gây độc) chủ yếu là

E coli, B subtilis, P pastoris, S serevisia,

Xuất phát từ những thách thức đặt ra, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tách dòng, biểu hiện gene xynA từ B subtilis CN2 trên E coli BL21 và nghiên

cứu đặc tính của xylanase tái tổ hợp” với những nội dung sau:

1 Tách dòng gene xynA t ừ B subtilis CN2

2 Giải trình tự gene xynA từ B subtilis CN2

3 Biểu hiện gene xynA từ B subtilis CN2 lên E coli BL21 (DE3)

4 Tinh sạch enzyme xylanaseA bằng sắc ký ái lực

5 Khảo sát một số đặc tính của xylanase tái tổ hợp để đề xuất phương hướng ứng dụng phù hợp đối với enzyme này trong thực tế

Cùng với sự nghiên cứu không mệt mỏi của các nhà khoa học, sự trao đổi kinh nghiệm và kết quả, cùng nhau giải quyết những khó khăn Chúng ta đều có thể

khẳng định chắc chắn rằng trong tương lai gần thì nhiên liệu sinh học sẽ là nguồn nhiên liệu phổ biến, hữu dụng và thay thế được nguồn nhiên liệu hoá thạch chúng ta đang sử dụng và lệ thuộc vào nó Góp phần xây dựng thế giới hoà bình, trong lành

và giàu mạnh

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN

1.1 Xylan

Xylan là thành phần chính của hemicellulose β-1,4-xylan là các polysaccharide của đường xylose được tìm thấy trong thành tế bào trong tất cả các

loại thực vật trên cạn và trong hầu hết các phần của cây Để thủy phân các thành

phần khung xương của chúng đòi hỏi sự hợp tác của nhiều loại enzyme khác nhau

chủ yếu là β-1,4-xylanase (1,4-β-D-xylan xylanohydrolase; EC3.2.1.1) và xylosidase (1,4- β-D-xylan xylohydrolase; (EC3.2.1.37) [32,59]

Cấu trúc của xylan

Hình 1.1: D ạng đơn gi ản của xylan

Xylan là một ví dụ của một pentosan bao gồm các đơn vị D-xylose liên kết

với nhau bởi liên kết β 1→4

Trong thành tế bào xylan được cấu thành từ các liên kết 1,4-β-D-xylosyl

ngắn thành một khung xương với các α-D-glucosyluronic acid (GlcA), α-D-glucosyluronic acid (MeGlcA), α-L-arabinosyl, O-acetyl, feruloyl, hoặc các chuỗi bên coumaroyl Mức độ polymer hoá của xylan trong gỗ cứng là 150-200 gốc β-xylopyranose, gỗ mềm là 70 đến 130 gốc β-xylopyranose

4-methyl-O-8

Hình 1.2: D ạng phức tạp của xylan

Hình 1.3 : Đơn vị cấu trúc của xylan từ cỏ [8]

Trong mô hình mạch của tế bào thực vật β-1,4-xylan chủ yếu tìm thấy trong

lớp thành tế bào thứ hai, là thành phần chính của tế bào trưởng thành trong mô gỗ, trong hemicellulose ở các lớp tế bào đầu tiên của cây một lá mầm, xylan là một thành phần thứ yếu của lớp thành tế bào đầu tiên cây hai lá mầm Điều quan trọng xylan được coi như một nguồn cung cấp C chính trong brichwood với 35% khối lượng khô Nhìn chung, xylan là một hemicellulose quan trọng trong gỗ của cây hạt kín 15-30% và ít phổ biến trong cây hạt trần từ 7-12% trong lượng khô [1]

1.2 Xylanase

1.2 1 Tên gọi và đặc tính của xylanase

Xylanase được mô tả bởi hiệp hội quốc tế hóa sinh và công nghệ sinh học phân tử (IUBMB)) như sau:

- Số đăng ký: EC 3.2.1.8

- Số đăng ký sở lý thuyết hóa học của xylanase: 9025-57-4

- Tên hệ thống: 1,4-D-xylanohidrolase

- Tên thường : Endo-1,4- xylanase

Các Tên khác: β-xylanase; β-1,4-xylanase; β-1,4-xylan xylanohidrolase; β-D-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4-xylanase; endo-β-1,4-D-xylanase; endo β-1,4-xylan-D-xylanohidrolase; (từ vi khuẩn) endo-xylanase; β-

xylanase, pentosanase, xynA protein, xylanase, xylanase j, xylanase y, xylanase z, xylanase III

Thuộc loại: Hydrolase (enzyme thủy phân)

Cơ chất: Xylan

Sản phẩm: Xylose

Ngu ồn gốc [59]:

- Vi khuẩn: B polymyxa, Cryptococcus albidus, Cellulomonas fimi,

- Nấm: Aspergillus spp (nudulans, ochraceus, fumigatus), Penicillium, Fuarium, Chaetomium, Aureo bacidium, Rhizomucor, A Ozyrae, Clostridium stercorarium,

- Nấm men: S thermomonospora, S Lividans¸ S Exfoliatus,

C

- Nấm (Aspergillus spp, Trichoderma spp): 40 - 80P

o P

C

- Nấm men (Streptomyces spp): 50- 65P

o P

C

- Xạ khuẩn (Trichoderma spp): 45- 65P

o P

Kh ối lượng phân tử

- Vi khuẩn (chi Bacillus) : 9,5- 56 kDa

- Nấm (Aspergillus spp, Trichoderma spp) : 8- 53 kDa

- Nấm men (Streptomyces spp) : 24 - 50 kDa

- Xạ khuẩn (Trichoderma spp): 8,5 - 53 kDa

1.2.2 Phân loại xylanase

Enzyme xylanase thường được tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật Chúng được phân chia thành rất nhiều họ dựa vào nguồn gốc, cơ chất, hoạt động, trình tự,

cấu trúc domain, đặc điểm hoá lý và chức năng của chúng, sự quan trọng trong công nghiệp, sự thích nghi với các điều kiện môi trường khác nhau Nhưng có 2 họ rất

phổ biến và được quan tâm đặc biệt là:

- Endo-xylanase họ 10 gồm các enzyme có nguồn gốc từ thực vật, nấm mốc

và vi khuẩn có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp (họ F)

- Endo-xylanse họ 11 gồm các enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao (họ G)

Sự khác biệt về đặc tính xúc tác của họ 10 là có khả năng thủy phân các liên

kết glycoside cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử Trong khi đó họ 11 không có khả năng đó [5] Endo-xylanase họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh thì endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế Do đó, các endo-xylanase của họ 10 hoạt động linh động hơn họ 11 Điều này cũng có nghĩa là họ 11 hoạt tính xúc tác chọn lọc hơn

Ngoài việc phân loại xylanase làm 2 nhóm lớn, nhiều nhà khoa học cũng đã

tiến hành nghiên cứu, phân chia xylanase thành những nhóm nhỏ hơn Sapag [50] chia xylanase họ 11 thành 6 nhóm chính Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các enzyme của nấm mốc Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương Nhóm B và C thì chứa các enzyme chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương, những loài thường sống trong dạ cỏ

1.2.3 Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase

Có một sự biến đối khá lớn giữa các enzyme phân hủy xylan sinh tổng hợp

từ nấm và vi khuẩn, enzyme được tiết ra trong môi trường chứa cơ chất xylan và phân hủy nó thành những oligosaccharide ngắn hơn và những phần này có thể sử

dụng như một nguồn năng lượng cho vi sinh vật Xylanase được phân thành hai họ F10 và G11 dựa trên sự tương đồng trình tự chuỗi amino acid và sự phân tích cấu trúc không gian 3 chiều

a b

Hinh 1.4: C ấu hình không gian của G11 xylanase từ Bacillus subtilis (XYNA)

Phần cấu trúc điển hình nhất của G11 xylanase là chứa 2 vòng xoắn gấp nếp

β được gọi là gấp “jellyroll” (thạch tròn) giống như một bàn tay phải hình 1.4a Trong đó những mạch β riêng biệt đan vào và ra tạo thành các vùng ngón tay và lòng bàn tay như trong hình 1.4b vùng P và F phần khe nối các phần còn lại được

tạo thành giữa 2 vùng này tạo thành trung tâm hoạt động và gắn cơ chất của protein Vòng tròn mở rộng tạo thành vùng dạng ngón cái (vùng T), cái này có thể điều khiển vị trí đóng mở của trung tâm hoạt động (chứa glutamic ở vị trí 75 và 78) đóng vai trò điều hòa sự gắn của cơ chất với vùng xúc tác của enzyme [44]

Các amino acid cấu thành xylanase họ 11:

Hình 1.5: H ọ 11 xylanase từ Bacillus circulans (1XNB) và Trichoderma harzianum

(1XND)

Từ hình 1.5 ta thấy cấu trúc không gian và các amino acid cấu thành hình dáng của của họ 11 xylanase từ Bacillus circulans và Trichoderma harzianum rất

giống nhau mặc dù nó có khoảng cách di truyền rất lớn một enzyme từ vi khuẩn còn

một enzyme từ nấm mốc Vị trí của nhiều amino acid bảo vệ thì được giữ rất gần nhau Màu xám thể hiện tờ gấp nếp β hình thành vùng lõm 2 lớp xung quanh vị trí

hoạt động Màu xám đen thể hiện một vòng xoắn và nén α [56]

1.2.4 Chức năng và cơ chế thủy phân của xylanase

a) Ch ức năng của xylanase

Xylanase là một enzyme xúc tác thủy phân liên kết 1,4-beta-D-xylose trong xylan thành phần của hemicellulose, là một trong những thành phần cấu trúc lên thành tế bào thực vật, làm phá vỡ cấu trúc của thành tế bào giải phóng đường xylose

và giúp các enzyme khác hoạt động thuận lợi và hiệu quả hơn trong quá trình sản

xuất Arabinoxylan cũng được biết đến như một pentonsan là những xylan phân nhánh cao trong bột lúa mỳ và bột lúa mạnh đen có hàm lượng xylan cao Xylanase thuộc nhóm pentosanase, một nhóm của enzyme phá hủy các thành phần của thành

tế bào chất nền của thực vật (sợi), bẻ gãy hợp chất đặc biệt trong thành tế bào thực

vật

Tạo điều kiện để các enzyme tiêu hóa phía sau làm việc hiệu quả do hạn

chế bởi tính nhầy của dịch vùng dạ dày và kích thích tiêu hóa giúp hấp thu chất dinh dưỡng tốt hơn Chống lại sự tăng số lượng của vi khuẩn kị khí và giảm tỷ lệ mắc

β-1,4-D-Hình 1.6: Cơ chế hoạt động của xylanse dạng đơn giản

Do cấu trúc của xylan ở dạng liên kết trong thành tế bào rất phức tạp nên để phân huỷ hoàn toàn mạch xylan thành các mạch ngắn đơn giản hơn thì xylanase không thể hoạt động một mình mà phải hoạt động cùng với nhiều enzyme khác (hình 1.7) Endo-1,4-β-D-xylanase phân cắt ngẫu nhiên khung xylan, β-D-xylosidase (EC 3.3.1.37) phân cắt các xylose một cấu tử thành các xylo-oligosaccharide đầu không khử Trong khi loại bỏ các nhóm bên của xylobiose thì được xúc tác bởi α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55), α-D-glucuronidase (EC

3.2.1.139), acetylxylan esterase (EC 3.1.1.72), ferulic acid esterase (EC 3.1.1.73) và p-coumaric acid esterase

Hình 1.7: V ị trí tấn công của endo-1,4-β-xylanase trên mạch xylan

Sự thủy phân của các enzyme thủy phân polysaccharide kiểu như cellulase

và xylanase có thể là kết quả của sự duy trì hay nghịch chuyển của trung tâm anomeric của các monomer đường khử của carbonhydrat [10] Đề xuất này bao gồm

một hoặc hai trạng thái chuyển tiếp hóa học Sự dịch chuyển glycosyl thường dẫn đến sự thay đổi tính ái nhân ở C bão hòa của trung tâm anomeric và diễn ra với sự duy trì hoặc nghịch chuyển của cấu hình anomeric Có sự liên quan của cơ chế dịch chuyển kép cho sự duy trì anomeric của sản phẩm

Cơ chế dịch chuyển kép bao gồm các đặc điểm:

- Xúc tác axit với việc thêm một proton vào cơ chất

- Một nhóm carboxyl của enzyme ở trạng thái hoạt động

- Một liên kết trung gian cộng hóa trị glycosyl xuất hiện giữa enzyme với cacbonhydrat này trong đó cấu hình anomeric của đường tham gia liên

kết này đối lập với đường của cơ chất

Các tương tác không phải cộng hóa trị được tạo ra với tỷ lệ tăng lên [3]

Hình 1.8: Cơ chế thủy phân xylan của 1XNB

a) Cơ chất xylan được gắn vào vị trí lõm tạo thành giữa tyr65 và tyr69 glu172 là chất xúc tác acid/base, glu78 là tác nhân b) Glycone được gắn với glu78, liên kết này được giữ trong suốt phản ứng chuyển glycosyl c) Nước thay thế tác nhân d) Phá bỏ liên kết và làm yếu glycone cho phép enzyme di chuyển đến một vị trí mới trên cơ chất Bởi vì aglycone được giải phóng trong (b) và glycone được giải phóng trong (d) Nhiều xylanase của họ 11 thể hiện một cơ chế cắt trong mạch ngẫu nhiên hơn là theo một quy luật nhất định [56]

Leggio và các cộng sự (2000) [23] đề xuất cơ chế xúc tác của xylanase qua

3 giai đoạn :

- Xylanase nhận biết và gắn vào xylan

- Gốc xylosyl ở vị trí -1 bị làm biến dạng và bị làm lỏng lẻo hướng về phía

gốc xúc tác, liên kết glycosidic bị cong và phá vỡ để tạo thành dạng liên

kết cộng hóa trị enzyme-cơ chất trung gian

- Chất trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, tiếp theo đó

cơ chế thủy phân glycosyl cổ điển tiếp tục diễn ra và sản phẩm được giải phóng

1.2.5 Ứng dụng của xylanase

Những enzyme có hoạt tính xylanase là hemicellulase mà xúc tác phản ứng

thủy phân xylan, thường liên kết với các thành phần cellulose và lignin của tế bào cây Vì vậy mà các enzyme phân hủy xylan được sản xuất nhờ vi khuẩn Bacillus macerans Cơ chất có thể sử dụng như một nguồn cơ chất C dạng rắn lignocellulose như:

- Ngũ cốc trong bữa ăn

- Công nghệ vi sinh thực phẩm /công nghệ chất độc / kiểm soát chất lượng

- Kĩ thuật môi trường

- Xử lý sinh học /phân bón /biến đổi sinh học

Ứng dụng thương mại:

- Ứng dụng kỹ thuật gene công nghiệp

- Rượu vang và các loại rượu

- Nước ngọt và thực phẩm tự nhiên

- Thực phẩm cho sức khỏe

- Sản phẩm thực phẩm nói chung

- Công nghiệp dệt, giấy và các ngành công nghiệp khác

Xylanase thường được sử dụng kết hợp với nhiều enzyme khác như cellulase, mananase, … [20]

S ử dụng trong làm bánh mỳ để cải thiện tính nhão của bột nhào (khả năng

làm việc, tính bền) và để tối ưu quá trình sản xuất quá trình lên men ở điều kiện ôn hòa hơn Cải thiện hương vị và mùi vị, tăng cường sự ổn định cho bột nhào, ruột

mềm và mịn, cải thiện cơ cấu ruột bánh, tăng thể tích vỏ giòn, thay thế các hóa chất

phụ gia là do liên quan đến sự tương tác giữa lúa mì và gluten protein arabinoxylan

dẫn đến tăng cường thêm sự co giãn của gluten

Xylanase có thể sử dụng để trộn vào bánh Trong sản xuất rượu vang và nước quả sử dụng xylanase tăng cường khả năng trích ly của quả Trong công nghệ

sản xuất cồn xylanase giải phóng chất nhầy trong hạt ngũ cốc để sử dụng trong quá trình lên men

Nh ững ứng dụng khác:

Ch ất phụ gia cho thức ăn gia súc: thêm vào thức ăn gia súc để tăng khả

năng hấp thụ dinh dưỡng từ thức ăn gia súc để cải thiện khối lượng gia súc, gia cầm

lấy trứng, thịt sữa Những enzyme này góp phần giúp quá trình tiêu hóa thức ăn từ

thực vật thông qua quá trình giải phóng các xylanase trong thực vật Chúng có thể cũng được sử dụng trong các quá trình tách hạt lúa mỳ

Trong công ngh ệ in báo xylanase cùng với cellulose tỉ lệ 50:50 sẽ làm cho

giấy báo sau in sáng hơn, nét hơn, chống bẩn tốt hơn, năng suất cũng cao hơn so với

sử dụng chất hóa học

Trong s ản xuất rượu vang xylanase được sử dụng để phân hủy xylan,

pectin và hemicellulose có mặt trong hoa quả thành các phân tử đơn giản như xylose và glucose Bằng sự phá hủy thành tế bào, nó giúp chiết các chất trong nước

quả tốt hơn

S ử dụng trong công nghiệp giấy để tăng cường sức bền của sợi trong tẩy

trắng bột giấy từ tre và cây khuynh diệp, tăng khả năng lọc bột giấy và giữ nước,

giảm thời gian xử lý bột giấy mới, tăng cường sự tự do trong các sợi tái chế, loại bỏ

có chọn lọc xylan từ bột giấy tăng cường khả năng tấy trắng giấy, giảm tính nhớt Đặc biệt xylanase sử dụng trong ngành công nghiệp này với mục đích như một chất thay thế yếu tố tẩy trắng hóa học như chlorine và các dẫn xuất của nó, để giảm thiểu

những ảnh hưởng có hại đến môi trường [20]

Xylanase từ nấm sợi thì thích hợp cho các quá trình công nghiệp được phát triển gần đây mà có liên quan đến tẩy trắng bột giấy Trên thực tế điều kiện tối ưu

của xylanase được sử dụng cho xử lý bột giấy trong công nghiệp giấy là ở pH acid

và nhiệt độ 50P

o P

C

8

Hình 1.9: C ấu trúc của xylan và vị trí cắt các enzyme trong quá trình sản xuất giấy

Có 5 enzyme tham gia phản ứng trong quá trình sản xuất giấy theo trình tự

Phân h ủy chất thải nông nghiệp (rơm, rạ )

Các đặc tính sinh học và hoạt độ tối ưu của xylanase phù hợp với phương pháp công nghiệp hiện đại để tẩy trắng bột giấy Đây là một sự thuận lợi để nâng cao chất lượng quá trình tẩy trắng bằng phương pháp sinh học, thân thiện với môi trường và tránh sự tạo thành các sản phẩm phụ độc cho người khi sử dụng công nghệ hóa học Đặc biệt hơn xylan được tổng hợp từ nấm, có khả năng lên men ở nhiệt độ cao

Một vài enzyme đã sản xuất để sử dụng trong thực phẩm được ghi nhận là nguyên nhân gây dị ứng khi hít phải Điều này thể hiện rằng dị ứng enzyme trong điều kiện nhà máy sản xuất là dễ xảy ra Giống như các enzyme khác, xylanase có

thể là nguyên nhân dị ứng nghề nghiệp với những người nhạy cảm Năm 1998, hiệp

hội các nhà máy lên men các sản phẩm enzyme cử nhóm làm việc đối với khách hàng dị ứng từ những enzyme có trong thực phẩm, dị ứng được thực hiện phân tích sâu tại chỗ Nhóm đã kết luận rằng không có những dấu hiệu khoa học nào gây

phản ứng dị ứng cho những người tiêu dùng với một số lượng nhỏ enzyme có trong

thực phẩm và những enzyme còn lại trong thực phẩm không gây ra bất kỳ sự rủi ro nào cho người tiêu dùng Xylanase của nấm và vi khuẩn đã từng được sử dụng trong thực phẩm với số lượng lớn trong nhiều năm

Do xylanase nhạy cảm với nhiệt và có thể mất hoạt tính trong quá trình nướng bánh hoặc nấu chín thức ăn Các thí nghiệm được thực hiện với xylanase cho

thấy rằng các enzyme hoạt động ở nhiệt dưới 50P

o P

C thì trên 50P

o P

C enzyme bị mất hoạt tính nhanh chóng Do đó không có enzyme nào có thể hoạt động trong thức ăn đã qua chế biến và sẽ không gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng do xylanase còn sót lại trong thực phẩm

1.2.6 Dạng sản phẩm xylanase trên thị trường

Xylanase có thể được xử lý dưới dạng:

- Dạng rắn: như các vi hạt, viên, bột

- Dạng lỏng

Cả hai dạng này đều được làm công thức với thành phần phù hợp như chất

ổn định, chất bảo vệ và chất mang phù hợp cho sử dụng trong thực phẩm mang lại

hiệu quả kinh tế cao có thể dùng thay cho chất phụ gia mà không độc hại với môi trường và người sử dụng

Hình 1.10: Các d ạng sản phẩm xylanase trên thị trường

1.3 Những thành tựu trong tách dòng và biểu hiện gene xynA mã hoá

xylanase

1.3.1 Ở nước ta

Hiện nay các nghiên cứu về xylanase mới chỉ tập trung nghiên cứu đặc tính xylanase của các chủng và khả năng ứng dụng của chúng Ví dụ nghiên cứu về xylanase của Aspergillus niger và ứng dụng trong tẩy trắng bột giấy của Nguyễn

Văn Diệp và cộng sự (2005) [39]

Công trình nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase của nấm

mốc Aspergillus oryzae (8,8 U/mg protein) và đã tách dòng biểu hiện thành công 2

gene của Aspergillus oryzae (gene xylitol dehydrogenease XdhA AB109101 và gene L-Arabinitol 4- dehydrogenease LadA AB116938) của Trần Liên Hà và cộng

sự (2004, 2005)

Năm 2004, Nguyễn Thị Uyên Thảo và các cộng sự đã công bố nghiên cứu

về việc sử dụng vi nấm Trichoderma để thu nhận các enzyme cellulase, xylanase và

pectinase từ nguồn nguyên liệu là bã khoai mì Tổ hợp enzyme này được nghiên

cứu và ứng dụng vào sản xuất thức ăn chăn nuôi [37]

Đỗ Thị Tuyên và cộng sự tiến hành nghiên cứu và đánh giá một số tính chất hóa lý của chủng Aspergillus niger DSM1957 trên dịch tinh sạch sơ bộ [9] Hoạt

tính của enzyme xylanase đạt cao nhất ở nhiệt độ 55P

o P

C, pH là 5,0 Hoạt tính xylanase bị giảm khi ủ với một số ion kim loại (FeP

2+

P, FeP 3+

P, CaP 2+

P, MgP 2+

P, ZnP 2+

P, CuP 2+ P,

Bên cạnh đó cũng có một số đề tài nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp Năm

2009, Nguyễn Thị Thu Thùy và cộng sự đã biểu hiện và đánh giá tính chất hóa lý

của xylanase tái tổ hợp từ Aspergillus oryzae VTCC – F187 trong Pichia pastoris

GS115 [38]

Nguyễn Hải Chiều và cộng sự (2008) biểu hiện thành công một cDNA xylanase phân lập từ Aspergillus awamoris trong Pichia pastoris Xylanase tái tổ

hợp có hoạt tính cao nhất ở pH 4,0 Dải bền nhiệt của enzyme từ 20 - 60°C [36]

Lê Văn Trường, Thomas Schweder đã biểu hiện gene mã hóa xylanase

trong Bacillus subtilis s ử dụng promoter alpha-amylase từ Bacillus amyloliquefaciens Sau khi biểu hiện, lượng rXynA được tiết ra với mức độ cao, đạt khoảng 0,5 mg/ml trên môi trường BMM Nhiệt độ tối ưu và pH tối ưu cho hoạt tính xylanase là 50P

o P

C, pH 6,0

1.3 2 Trên thế giới

Các gene xylanase đã biểu hiện và giải trình tự:

- Gene xynA, xynB, gene xlnA và xlnB mã hóa X22 và X24, gene XYL2, XYL3, gene (xyl11), gene xynZG , gene dnaK–dnaJ (Bacillus), gene Xyn11, gene xylanase BS1, BS2, BS3,…

- Nghiên cứu xylanase từ vi khuẩn gồm có các loài Bacillus subtilis, Bacillus pumilis, Aeromonas caviae,… N ấm men như Candida tropicalis, Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, N ấm mốc như Aspergillus niger, Aspergillus usamii, Aspergillus oryzae, Penicillium purpurogeneum,…

- Biểu hiện trên vi khuẩn (E coli, B subtilis), nấm men (Saccharomyces cerevisiae), n ấm mốc (Aspergillus kawachii),… đã tạo ra xylanase tái tổ hợp, Với kĩ

thuật này đã nâng cao được hoạt lực của enzyme lên nhiều lần so với chủng gốc ban đầu Tuy nhiên hệ thống biểu hiện ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình Quereshy

và cộng sự (2000) đã chỉ ra rằng khi biểu hiện gene xylanase của Bacillus circulans lên Bacillus subtilis có nhi ều ưu điểm hơn biểu hiện trên E coli Hoạt lực của

enzyme tái tổ hợp ở Bacillus subtilis (1120 U) hơn 14 lần so với ở E coli (79 U)

[46] Nguyên nhân của sự tăng lên này là do tính tương đồng của vật chủ do đó giúp tăng cường quá trình phiên mã, dịch mã cũng như ổn định của gene biểu hiện Chính vì vậy mà các hệ thống biểu hiện luôn được nghiên cứu và ứng dụng

Các nhà khoa học đã không ngừng tìm kiếm các enzyme có hoạt lực cao trên các loài sinh vật phổ biến như: Nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, và

đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể Chỉ xét riêng về xylanase ta có:

Tách dòng và bi ểu hiện trên nấm mốc

Yeshitila Degefu và cộng sự (2001) đã tách dòng, giải trình tự và biểu hiện

một gene xylanase từ nấm Helminthosporium Turcicum gây bệnh cho ngô [61]

Pérez-Gonzalez và cộng sự (1996) đã tách dòng và biểu hiện lên

Saccharomyces cerevisiae t ừ 2 gene xylanase của Aspergillus nidulans (xlnA và xlnB, mã hóa X22 và X24 ) và cơ chế kiểm soát sự biểu hiện gene xylanase [42]

Các chủng nấm đã được tách dòng và biểu hiện là Aureobasidium pullulans, Cochliobolus carbonum, Penicillium chrysogeneum, Trichoderma reesei,

A awamori, A kawachi, A tubingenesis,…

Quá trình biểu hiện này lại chưa được biết nhiều về cơ chế kiểm soát sự

biểu hiện gene xylanase mà chỉ trong từng trường hợp của gene xlnA của A tubigenesis mới điều hòa được các nhân tố liên quan trong xylanase cụ thể được xác định rõ ràng trong promoter của gene

Hai gene của A nidulans là xlnA và xlnB mã hóa xylanase X22 và X24 từ

những chủng nấm này đã được tách dòng và giải trình tự cDNA và được biểu hiện trong phòng thí nghiệm lên chủng Saccharomyces cerevisiae dưới sự kiểm soát của

promoter điển hình của nấm men và kết quả là trong cấu tạo chromosome của chủng

nấm men này đã mang gene xylanase tái tổ hợp

Tách dòng và biểu hiện không đồng nhất gene mới mã hóa xylanase từ

Plectosphaerella cucumerina (xynZG) theo phương pháp genome-walking PCR và chuyển gene vào Pichia pastoris GS115 [62]

Tách dòng và biểu hiện gene trên nấm men

1 Kit biểu hiện protein “K lactis” (vector biểu hiện pKLAC2) trên vật chủ (nấm men Kluyveromyces lactis) [35]

Cung cấp một phương pháp dễ dàng cho biểu hiện một gene quan tâm vào

nấm men Kluyveromyces lactis Protein có thể được sản xuất nội bào hoặc ngoại

bào, sử dụng vector biểu hiện pKLAC2 Với kit này chúng ta sẽ có nhiều điểu kiện thuận lợi hơn trong quá trình tách dòng và biểu hiện gene trên nấm men Đây sẽ tạo nên một bước ngoặt lớn trong biểu biện gene trên thế giới

2 Meltem AfiAN và cộng sự (2007) đã biểu hiện gene

β-(1,3-1,4)-Glucanase lên Streptococcus salivarius subsp thermophilus [29]

Tách dòng và biểu hiện gene xylanase trên vi khuẩn, đặc biệt là Bacillus

1 Charles C Lee và cộng sự (2008) đã tách dòng gene xyn11 từ Bacillus licheniformis và nghiên cứu đặc tính của enzyme tái tổ hơp trên vật chủ là

4 Xác định riêng biệt hai gene mã hoá xylanase của Bacillus circulans

bằng tách dòng và biểu hiện gene trên Escherichia coli (sử dụng vector pUC19 và

chuyển gene vào E coli) [60]

5 Tách dòng và biểu hiện gene xylanase từ Bacillus polymyxa lên E coli

[13,47]

6 Xylanase từ Bacillus, Vector biểu hiện cho xylanase pUB-BPX12 cho Bacillus pumilus là PRL B12, Xylanase gene t ừ B pumilus PRL B12 vector tách

dòng plasmid pUB131 [41]

C HƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Chủng giống và vector cho tách dòng và biểu hiện

Nguồn sinh vật: chủng Bacillus subtilis CN2 [57] được chọn lọc từ bộ sưu

tập giống của Bộ môn Vi sinh - Hoá sinh - Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh

học và Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Tế bào chủ: Những tế bào E coli DH5α (Promega) có khả năng tương thích

với phương pháp chọn lọc lacZ xanh/trắng, dễ dàng được chuyển bằng plasmid

DNA hiệu quả cao, E coli BL21(DE3) (Novagen) (mang một bản sao của gene mã

hoá T7 polymerase trong lamda lysogen (DE3) trên chromosome [22]) được sử

dụng cho biểu hiện protein tái tổ hợp

Vector PUC118 là plasmid vector từ hãng Invitrogen được sử dụng cho tách dòng, vector pET22b(+) (Novagen) dùng cho tách dòng và biểu hiện

2.1.2 Môi trường nuôi cấy và giữ giống vi sinh vật

Các môi trường LB và TB nuôi cấy vi khuẩn được thanh trùng ở nhiệt độ

121P

o

P

C trong 20 phút

Môi trường nuôi cấy: môi trường LB [C.8]

Môi trường biểu hiện: môi trường LB thêm chất cảm ứng IPTG với các

nồng độ khác nhau và thêm MgCl2 Môi trường Terrific Broth (TB) [55] được pha như phần phụ lục [P.7]

Môi trường giữ giống:

- Môi trường giữ giống PDA [C.9]

- Môi trường giữ giống Glycerol lỏng: môi trường LB lỏng và Glycerol 10% Hoạt hoá vi khuẩn với thời gian 14 đến 16 h (qua đêm) bằng LB

lỏng, sau đó bổ sung Glycerol 100% với thể tích chiếm10% tổng thể tích dung dịch

2.1.3 Hóa chất, enzyme, kit, thiết bị sử dụng

Hóa ch ất:

* Glucose, Xylose, Agar, Agarose, Bacto Triptone, Bacto yeast extract (cao nấm men), KHR 2 RSOR 4 R, NaCl, MgSO4.7HR 2 RO, NaHR 2 RPOR 4 R, NaR 2 RHPOR 4 R, MgClR 2 R, Glycerol, Acid acetic, Ethanol 100%, NaCl, Tris, HCl, Methanol, NaR 3 RPOR 4 R, Boric acid, (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)

* Birchwood xylan, Beechwood xylan (Sigma)

* Ampicilin, IPTG, X-gal,

Hoá chất trong phản ứng PCR từ hãng Takara

Kit:

Tách plasmid - Plasmid Midi kit (100), nhựa Ni-NTA (Qiagen), TALON (invitrogen), Kit tách protein - Bug Buster (Invitrogen), DNA Ligation Mix (Takara), kit loại bỏ nhóm phosphate đầu 5’ rAPid alkaline phosphatase (Roche Applied Science (USA))

Thi ết bị:

- Các thiết bị để nuôi cấy và giữ giống: Tủ cấy (YAMATO clean bench, HITACHI), tủ lạnh (SANYO medicool), tủ lạnh sâu -20P

o P

C (BIOMEDICAL FREEZER, SANYO), tủ lạnh sâu -81P

o P

C ( UNTRA LOW, SANYO), thiết bị thanh trùng (LSX-500, TOMY), tủ sấy (EYELA WFO-700), tủ ấm 25P

o P

C (EYELA Soft incubator SLI-450N), tủ ấm 37P

o P

C (TVA 460DA, ADVANTEC), máy nuôi lắc với

dải nhiệt độ 4P

o PC~ 80P o P

- Bể ổn nhiệt (Thermal Robo TR-2A, AS ONE), máy ổn nhiệt (CTU-Mini, TAITEC),

- Máy lọc nước Mili Q, Ultrapure Water System (Aquarious ADVANTEC), máy làm đá (HOSHIZAKI)

- Máy giải trình tự CEQ 2000XL DNA Analys system (BECKMAN COULTER)

- Máy đo quang Multi-Detection Microplate Reader POWERSCANⓇHT (Bradford microplate)

- Các thiết bị nghiên cứu khác: cân điện tử, máy đo pH, pipetman eppendoft (pipette, thermo scientific), eppendoff (Trefflab), Pipette tip 100μl và 1000μl (QSP), Centrifure tube (IWAKI), máy hút chân không,

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Phần lỏng bên trên chuyến sang ống ependoff mới + 0,6V1 isopropanol

 Lắc đến khi nhìn thấy DNA ↓ trắng

 Li tâm 5 phút ở 10000 rpm  Loại lỏng

 DNA pellet + 500 µl ethanol 70%

 Li tâm 10 phút ở 10000 rpm

 Pellet  làm khô  hòa tan = 50 µl 1xTE Bảo quản ở -20°C

Phương pháp tách DNA tổng số đựợc thay đổi bởi Ausubel và cộng sự

được trộn với 0,5 ml nước cất đã tiệt trùng chuyển vào ống effendoff rồi li tâm trong 5 phút ở 10000 rpm Lấy phần pellet hòa trong 567 µl đệm 1×TE [C.4] Sau

đó, cho 30 µl SDS 10% và 3 µl proteinase K 20 mg/ml trộn đều và ủ 1 h ở 37°C

tiếp theo cho 0,1 ml NaCl 5M vào và trộn đều Sau đó bổ sung 80 µl CTAB/NaCl [C.5], các ống được trộn đều và ủ 10 phút ở 65°C

Sau đó bổ sung 0,7 ml chloroform/isoamyl alcohol [CI- C.2] trộn đều và li tâm 5 phút ở 10000 rpm Phần lỏng bên trên đựơc chuyển sang ống li tâm mới Tiếp theo cho một lượng CI bằng lượng lỏng vừa chuyển vào trộn đều và li tâm 5 phút ở

10000 rpm

Phần lỏng bên trên được chuyển sang ống li tâm mới Bổ sung isopropanol (lạnh) bằng 0,6 thể tích phần lỏng để kết tủa nucleic acid Ống được lắc đến khi DNA trắng kết tủa nhìn thấy được Li tâm tiếp trong 5 phút, loại bỏ phần lỏng bên trên, phần pellet phía dưới được rửa với 500 µl ethanol 70% (lạnh) Li tâm trong 10 phút, sau đó loại hết ethanol bằng micropipette, pellet được làm khô hoàn toàn và hòa tan trong 1×TE (50 µl) Bảo quản ở -20°C

2.2 1.2 Thiết kế mồi

Mồi chạy PCR phải đảm bảo các điều kiện sau:

- Chiều dài mồi từ 19 đến 30 nu, tối ưu là 20 đến 22 nu

- Nhiệt độ biến tính TR m R= 55-65P

o P

C tối ưu là 60P

o P

C Tm xuôi xấp xỉ bằng TR m Rngược để không gây hiện tượng bắt cặp cạnh tranh

- Dimer và hairloop càng ít càng tốt và mồi xuôi và mồi ngược không bắt

cặp với nhau nhất là ở đầu 3’, dG> 0

Công thức đơn giản tính nhiệt độ nóng chảy của mồi [48]:

TR m R= 4 x (số nu G và C trong mồi) + 2 x (số nu A và T trong mồi)

Công thức tính TR m R trong phản ứng PCR chứa muối [30,47,48]:

TR m R= 81,5 + 16,6 x (log 10[NaP

+ P] + [KP + P]) + 0,41 x (%GC) – 675 : N

Trong đó N là số lượng nucleotid trong mồi PCR thường được thực hiện ở

nồng độ cation hoá trị 1 là 50 mM

Công cụ hỗ trợ: phần mềm vecto NTI, fast PCR, biomath caculator, blast NCBI,

2.2 1.3 Khuếch đại gene

Thành ph ần và chu kì nhiệt của phản ứng PCR thực hiện theo khuyến

cáo của nhà sản xuất [26]

Bảng 2.1: Thành phần và chu kì nhiệt của phản ứng PCR Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng

o PC; 50 giây ở

72P

o P

C Tổng số chu kỳ: 30

- Kéo dài cuối cùng: 5 phút ở 72P

o P

C

Sản phẩm PCR có thể được nhận biết bằng kích thước của chúng qua việc

sử dụng điện di gel agarose

2.2 1.4 Tinh sạch sản phẩm PCR

Các bước tiến hành thực hiện theo Sambrook (2003) [49]

Hỗn hợp phản ứng PCR 50 μl

 Bổ sung 50 μl phenol- CHCl3 trộn đều

 Li tâm 12000 rpm, 5 phút, ở nhiệt độ phòng hoặc 4°C

 Chuyển phần dịch nổi lớp trên cùng sang ống tube mới (tránh hút phải

lớp phenol)

 Thêm 1/10 thể tích Sodium acetat pH 5,2

 Thêm 10 μl TE-RNase, giữ ở -20°C

 Kiểm tra kết quả bằng điện di gel Agarose

2.2 1.5 Kiểm tra sản phẩm bằng điện di gel agarose

Các bước tiến hành thực hiện theo Sambrook (2003) [49]

Cách ti ến hành:

Các phần khuếch đại được tách bằng gel 1% agarose (1g agarose hòa tan trong 100 ml 1xTAE [C.1, C.3] bằng cách đun sôi) bổ sung EtBr Để nguội dịch agarose tầm 50P

o P

C đến 60P

o P

C thì đổ vào khuôn ngang và cài lược tạo giếng gel, 2 µl

sản phẩm được lấy ra và trộn với 10 µl MiliQ HR 2 RO và 1 µl đệm 10x gel loading Sau đó mẫu sẽ được tra vào từng giếng gel, thêm 5 µl marker 1 kb hoặc 6 µl marker

100 bp vào giếng đầu tiên hoặc giếng giữa, sau đó chạy ở điện thế 100V hoặc 50V đến khi bromophenol blue chạm tới vạch thứ 3 hoặc thứ 4 từ dưới lên của khuôn

nhựa đựng gel chạy tầm 45 hoặc 90 phút Đoạn DNA được quan sát trong hệ thống soi gel của phòng thí nghiệm

2.2.1.6 Phản ứng nối gốc phosphate ở đầu 5’ gene xynA đã khuếch đại

Sử dụng kít Blunting kination, Các bước thưc hiện tiến hành theo khuyến cáo của nhà sản xuất [24] và theo Sambrook (2003) [49]:

Thành ph ần phản ứng (Blunting Kination Ligation reaction):

- Sản phẩm PCR tinh sạch 0,2 ~ 20 pmol

- Đệm 10X Blunting kination 2 μl

- Hỗn hợp blunting kination enzyme 1 μl

- dd HR 2 RO x μl

- Tổng thể tích phản ứng 20 μl

Các bước tiến hành:

 Trộn đều, ủ 37P

o P

C trong 10 phút

 Thêm 80 μl dd HR 2 RO, bổ sung 100 μl Phenol-CHCl3

 Li tâm 12000 rpm, 5 phút, ở 4P

o P

C

 Chuyển phần dịch nổi phia trên sang ống tube mới

 Thêm 1/10 thể tích Sodium acetat pH 5,2

 Thêm 2,5 thể tích 100% EtOH

 Để 20 phút ở -80P

o P

C

 Li tâm 12000 ~14000 rpm, 10~30 phút, ở 4P

o P

C

 Làm khô 3 phút ở nhiệt độ phòng

 Thêm 10μl TE-RNase, giữ ở -20P

o P

C

2.2.1.7 Cắt sản phẩm PCR, pET22b(+) bằng enzyme giới hạn

Phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn MscI và XhoI

Mục đích để tạo 2 đầu dính ở sản phẩm PCR giúp tăng hiệu quả phản ứng

nối khi nối với vector pET22b(+) cũng được cắt bằng cặp enzyme giới hạn tương ứng

Ti ến hành:

Ở đây sản phẩm PCR và vector pET22b(+) cùng được cắt bởi 2 enzyme

giới hạn MscI và XhoI Thành phần của phản ứng được mô tả cụ thể trong 2 bảng

sau:

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn của pET22b(+)

Thành phần phản ứng Thể tích phản ứng (μl) Nồng độ ban đầu Nồng độ cuối DNA plasmid (pET) 3,4 5,9 μg/μl 20 μg

C, trong 4 h hoặc qua đêm (12 h đến 16 h) Sau đó kiểm tra phản ứng bằng chạy điện di gel agarose 1%

2.2.1.8 Loại bỏ nhóm phosphat ở đầu 5’ của vector tách dòng

Loại bỏ nhóm phosphat ở đầu 5’của vector tách dòng pET22b(+), PUC118

đã cắt bằng enzyme giới hạn alkaline phosphatase [19] Mục đích nhằm tăng hiệu

quả chèn đoạn gene đích bằng cách giảm sự tự nối của chính các đầu dính của vector trước khi thực hiện phản ứng gắn đoạn gene muốn chèn vào vector tạo plasmid tái tổ hợp [21] Sử dụng kit rAPid alkaline phosphatase của hãng Roche Applied Science (USA) số hiệu 04898133001

C ác bước tiến hành thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất [28]:

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng loại bỏ nhóm phosphat của vector

Thành phần Thể tích(μl) Nồng độ cuối

Đệm rAPid alkaline phosphatase (10X) 2 1 X

Enzyme rAPid alkaline phosphatase 1 1 U

Nước khử ion đã tiệt trùng X

C trong 10 phút (PUC118 cắt bằng HincII), nếu DNA đầu dính (pET22b(+) cắt

bằng 2 enzyme MscI và XhoI) thì ủ ở 37P

o P

C trong 30 phút

Bất hoạt phosphatase ở 75P

o P

C trong 2 phút Có thể sử dụng trực tiếp hỗn hợp

phản ứng này cho phản ứng nối hoặc giữ ở -15P

o P

C hoặc -20P

o P

C đến khi sử dụng

2.2.1.9 Phản ứng nối

Nguyên tắc: T4 DNA ligase là một enzyme được mã hoá bởi bateriophase T4 Nó xúc tác hình thành liên kết phosphodiester giữa juxtapose 5' phosphate và đầu 3' hydroxyl trong mạch đôi của DNA hoặc RNA Enzyme này có thể nối các đầu bằng và các đầu dính cũng như sửa chữa các lỗ hổng đứt gãy trên mạch đơn trong mạch đôi của DNA, RNA hoặc các mạch lai DNA/RNA [11,31]

Hình 2.1: Ph ản ứng nối vector pUC118 và gene xynA

Ti ến hành:

Nối sản phẩm PCR sau khi gắn nhóm phosphate vào đầu 5’ của đoạn gene

với vector pUC118 sau khi loại bỏ nhóm phosphate Sử dụng bộ kit ligation mix và