Biểu hiện gen tái tổ hợp trong

Vector biểu hiện là vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các mRNA của chúng trong Escherichia coli hay nấm men Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc Aspergillus niger…

Chương 7

Biểu hiện gen tái tổ hợp trong

Escherichia coli

Mở đầu

O Vector biểu hiện là vector có thể mang

các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các mRNA

của chúng trong Escherichia coli hay nấm men Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc

Aspergillus niger…

Các phương pháp và các

plasmid vector được sử dụng

protein) trong vi khuẩn

I Sản xuất các protein dung hợp

Gen dung hợp

Protein dung hợp

C N

Ưu điểm của protein dung hợp

phiên mã và dịch mã được điều khiển bởi các

trình tự tiêu chuẩn của E coli

protein ngoại lai nguyên thể.

 Khối lượng phân tử lớn hơn so với hầu hết các

protein của E coli  dễ nhận biết bằng điện di.

Có thể được tiết ra môi trường nhờ biểu hiện của

vi khuẩn

pUR278 TGTCAAAAAGG GGATCC GTCGAC TCTAGA AAGCTT ATCGAT G

BamHI Sal I XbaI HindIII ClaI

pUR288 TGTCGG GGATCC GTCGAC TCTAGA AAGCTT ATCGAT GAT

BamHI SalI XbaI HindIII ClaI

pUR289 TGTCAGG GGATCC GTCGAC TCTAGA AAGCTT ATCGAT GA

BamHI SalI XbaI HindIII ClaI

pUR290 TGTCAAAAAGG GGATCC GTCGAC CTGCAG CCAAGC TTATCGATGA BamHI SalI PstI HindIII ClaI

pUR291 TGTCGG GGATCC GTCGAC CTGCAG CCAAGC TTATCG ATG

BamHI SalI PstI HindIII Cla I

pUR292 TGTCAGG GGATCC GTCGAC CTGCAG CCAAGC TTATCG AT

BamHI SalI PstI HindIII ClaI

lacZ

3 Xây dựng plasmid biểu hiện và phát

hiện các protein dung hợp

- Tách chiết DNA plasmid vector, cắt hạn chế

- Điện di

chủng K12 71/18 hoặc JM 103 cho các vector pUR

chủng M5219 cho các vector pEX

Sàng lọc khuẩn lạc sản xuất protein dung hợp

R

40oC 37oC

Ly tâm

Tiểu thể

1mL Dịch nuôi cấy

phòng

Điện di SDS polyacrylamide gel 6%

Kết quả

4 Tách chiết các protein dung hợp để sản xuất

kháng thể

urea, sắc ký ái lực aminophenylthiogalactoside,

điện di SDS-polyacrylamide gel hoặc phối hợp giữa các cách này

Sau khi điện di (ở

mục 3)

Nhuộm gel và phát hiện băng protein mới

Cắt khỏi gel, đem đông khô khoảng 48h

Tiêm vào thỏ

Nghiền thành bột mịn Sản xuất

kháng thể

II Sản xuất các protein nguyên thể

DNA

Promoter Gen A

mRNA

AUG SD

 Các protein nguyên thể có thể được sản xuất trong E coli

bằng cách sử dụng promoter điều hòa mạnh và một trình tự liên kết ribosome hiệu quả

 Để biểu hiện gen prokaryote có trình tự liên kết ribosome mạnh chỉ cần cung cấp một promoter là đủ.

Các vector biểu hiện

mang promoter PL của

(lai) trp-lac và promoter

bacteriophage T7.

1 Promoter PL của bacteriophage λ

5000

1000

2000

3000 4000

Vector này được dùng để biểu hiện

protein cII của bacteriophage λ với một mức độ khoảng 4% protein hòa tan tổng

số của tế bào

mang gen 5S của E

coli và hai nhân tố kết

thúc phiên mã T1 và

T2.

Cho phép mức độ biểu hiện cao của

một vài gen không được biểu hiện

hiệu quả trong các hệ thống khác

Vector pET-3 mang promoter

(PФ10) của bacteriophage T7 Ф10

và yếu tố kết thúc phiên mã Ф (TФ)

Hiệu suất dịch mã của mRNA chịu sự chi phối của

một vài yếu tố:

- Mức độ bổ sung giữa chuỗi SD và đầu 3’ của 16S rRNA.

- Khoảng cách giữa chuỗi SD và codon AUG để chuỗi DNA của eukaryote định vị

- Nucleotide theo sau AUG ảnh hưởng sự liên kết ribosome.

III Xác định mức độ biểu hiện của

gen được tạo dòng

di SDS-PAGE

Nếu mức độ biểu hiện thấp thì

nên đặt gen lacZ cùng hướng

với gen được biểu hiện

Như vậy, nếu sự phiên mã hoặc dịch mã hạn chế biểu hiện của gen thì những thay đổi trong hệ thống biểu hiện có thể được kiểm soát bằng những thay đổi trong hoạt tính của β-

galactosidase.

Protein gel (điện di SDS)

Kháng thể 1 đặc hiệu

Bổ sung cơ chất

Thẩm tích protein lên màng nitrocellulose

Gắn kháng thể 1 với protein kháng nguyên

Kháng thể 2 có đánh dấu enzyme

Gắn kháng thể 2 với kháng thể 1

Phát triển màu

Hình 9 Sơ

đồ kỹ thuật

Western blot

AP AP

Protein kháng nguyên Kháng thể 1 (thỏ/chuột)

Kháng thể 2 (thỏ/chuột) liên kết alkaline phosphatase

Hình 10 Sơ đồ mô tả liên kết protein (kháng nguyên) với kháng thể thứ nhất đặc hiệu và kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme trong Western blot

Một giếng trong đĩa ELISA

Đĩa ELISA (microtiter plate ) có 96 giếng

Hình 7.11 Sơ đồ kỹ thuật ELISA

Cho DNA ngoại lai được dung hợp với đoạn tương ứng của

gen lacZ

Plasmid được dùng là

pLG mang gen lacZ

mã hóa đầu tận cùng carboxyl có hoạt tính β- galactosidase

Các plasmid có các đoạn promoter được đặt tối ưu có thể nhận biết bằng cách biến nạp

vi khuẩn Lac- và thu được hoạt tính β-

galactosidase trên các đĩa chỉ thị lactose

Mức độ biểu hiện thấp:

do RNA không ổn định, sự kết thúc chưa hoàn chỉnh, sự dịch mã không hiệu quả, hoặc chính protein không ổn định

IV Tăng mức độ biểu hiện của gen được

1 Thể vùi và phương pháp hòa tan thể vùi

Protein có mức độ biểu hiện cao trong E coli

thường tạo ra các hạt nhỏ không hòa tan ở trong

tế bào chất

Thể vùi

Tiểu

thể

Ly tâmRửa với Triston X-100 và EDTA hoặc urea+

Quan sát bằng kính hiển vi ngược pha và tách

khỏi dịch tan của tế bào sống bằng phương

pháp ly tâm

Phương pháp hòa tan thể vùi

Bổ sung deoxycholic

acidPMSF và lysozymeRT, 20 phút 37oC và khuấy

Bổ sung DNase I

30 phút ở RT

Phương pháp hòa tan thể vùi

Tinh sạch và rửa thể vùi

Phương

pháp 1

Phương pháp 2

Ly tâm

tái huyền phù

Ly tâm

đệm 2xSDS gel-loading dye điện di

RT, 5 phút

Trong nước,15’

tái huyền phù

Tinh sạch và rửa thể vùi

Phương

pháp 1

Phương pháp 2

Phương pháp hòa tan thể vùi

đệm 2xSDS gel-loading dye

Ly tâm tái huyền phù nước Tris.HCl + urea nước

điện diX3 lần

Phương pháp hòa tan thể vùi

Hòa tan các thể vùi

Rửa trong đệm dung ly

KH2PO4, EDTA và NaCl

ly tâm tái huyền phù1xSDS gel-loading dye

điện di

• Đuôi ái lực xuất hiện khi thiết kế di truyền với mục đích giúp cho sự tinh sạch protein hoặc enzyme hiệu quả hơn

• Gen của protein quan tâm được dung hợp với chuỗi DNA mã hóa cho một số trình tự amino acid

• Tinh sạch protein đích bằng sắc ký ái lực Cho hỗn hợp protein tái tổ hợp đi qua cột sắc ký có chứa một phối tử liên kết đặc hiệu với các

protein mang một đuôi ái lực

2 Các đuôi ái lực

2