đánh giá hiệu quả ức chế của nano bạc và dịch chiết thực vật đối với vi khuẩn xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa

3.5.10 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của dịch chiết thực 3.5.11 Phương pháp đánh giá tác dụng của dịch chiết thực vật và nano bạc đối 4.1.2 Đánh giá tác dụng diệt

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN TRƯỜNG SƠN

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ỨC CHẾ CỦA NANO BẠC

VÀ DỊCH CHIẾT THỰC VẬT ĐỐI VỚI VI KHUẨN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2015

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN TRƯỜNG SƠN

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ỨC CHẾ CỦA NANO BẠC

VÀ DỊCH CHIẾT THỰC VẬT ĐỐI VỚI VI KHUẨN

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số : 60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học:

TS Nguyễn Thanh hải PGS.TS Phan Hữu Tôn

HÀ NỘI - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả

nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình

nghiên cứu nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ

nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Nguyễn Trường Sơn

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn của mình, tôi đã nhận được

sự chỉ bảo tận tình, sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô trong Khoa Công nghệ Sinh học, khoa Công nghệ thực phẩm, Phòng thí nghiệm JICA Khoa Nông học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Thầy TS Nguyễn Thanh Hải, phó trưởng bộ môn Công nghệ sinh học thực vật

và thầy PGS.TS Phan Hữu Tôn bộ môn Công nghệ Sinh học Ứng dụng, khoa Công nghệ sinh học, trường Học viện nông nghiệp Việt Nam, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn, đồng thời bồi dưỡng cho tôi những kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm quý báu

Để hoàn thành luận văn này, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các Thầy giáo, Cô giáo, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã ủng hộ, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành các thủ tục cần thiết để bảo vệ thành công luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể cán bộ, công nhân viên phòng thí nghiệm JICA – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, các thầy giáo, cô giáo khoa Công nghệ thực phẩm đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể gia đình, bạn bè, anh em, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn này!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Nguyễn Trường Sơn

2.1.4 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh bạc lá 5

2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng dịch chiết thực vật trong việc phòng trừ

2.2.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng dịch chiết thực vật trong việc phòng trừ

2.2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng dịch chiết thực vật trong việc phòng trừ

2.3.2 Cây huyền diệp 11

3.5.2 Phương pháp thu dịch chiết thực vật và đánh giá hiệu suất tách chiết 23 3.5.3 Phương pháp định tính xác định một số nhóm hợp chất có trong dịch

3.5.5 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường rắn và lỏng 26

3.5.7 Phương pháp đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết thực vật 26

3.5.9 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của nano bạc đối

3.5.10 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của dịch chiết thực

3.5.11 Phương pháp đánh giá tác dụng của dịch chiết thực vật và nano bạc đối

4.1.2 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của cao dịch chiết thực vật với vi

4.1.3 Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất trong cao khô dịch chiết lá

4.1.4 Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá trầu

không sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau đối với Xanthomonas

4.1.5 Đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá trầu

4.1.6 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của nano bạc đối với vi khuẩn

4.1.7 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro khi phối trộn cao khô dịch chiết lá

trầu không và nano bạc với vi khuẩn Xanthomonas oryzae 47 4.1.8 Đánh giá tác dụng của nano bạc và cao khô dịch chiết lá trầu không đối

4.2.1 Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất trong cao khô dịch chiết

4.2.2 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của cao dịch chiết thực vật với vi

4.2.3 Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất trong cao khô dịch chiết lá

4.2.4 Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá trầu

không sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau đối với Xanthomonas

4.2.5 Đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá trầu

4.2.6 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của nano bạc đối với vi khuẩn

4.2.7 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro khi phối trộn cao khô dịch chiết lá

trầu không và nano bạc với vi khuẩn Xanthomonas oryzae 56 4.2.8 Đánh giá tác dụng của nano bạc và cao khô dịch chiết lá trầu không đối

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CNSH

Cs

CT DMSO

nm ppm PGS

TS

Xo

µl

Công nghệ Sinh học Cộng sự

Công thức Dimethyl Sulphoxit Dịch chiết

Gam Kilogam Luria Bertani Milligam Millimet Milligram/minilit Nanomet

Part per million Phó Giáo sư

Tiến sĩ

Xanthomonas oryzae

Microlit

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hệ số pha loãng dịch chiết và nồng độ dịch chiết tương ứng 26

Bảng 4.1 Hiệu suất chiết của năm loại thực vật trong dung môi ethanol ( 70%) 32 Bảng 4.2 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học của loại các dịch chiết 33 Bảng 4.3 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thực vật ở nồng độ 100mg/ml

Bảng 4.4 Hiệu suất tách chiết lá trầu không trong các loại dung môi khác nhau 36 Bảng 4.5 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học của cao khô dịch chiết lá

Bảng 4.6 Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá trầu

Bảng 4.7 Tác dụng kháng khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá trầu không

Bảng 4.8 Kết quả đánh giá tác dụng diệt khuẩn của dung dịch nano bạc đối

Bảng 4.9 Kết quả đánh giá tác dụng diệt khuẩn của dung dịch nano bạc đối

Bảng 4.10 Kết quả đánh giá tác dụng diệt khuẩn của dung dịch nano bạc đối

Bảng 4.11 Khả năng diệt khuẩn in vitro khi phối trộn cao khô dịch chiết lá trầu

Bảng 4.12 Chiều dài vết bệnh sau lây nhiễm và đánh giá khả năng kháng nhiễm

DANH MỤC HÌNH

Hình 4.3 Một số hình ảnh định tính thành phần hóa học của các loại dịch chiết 34 Hình 4.4 Dịch chiết lá trầu không thu được từ các loại dung môi khác nhau 36 Hình 4.5 Hiệu suất tách chiết lá trầu không sử dụng các loại dung môi khác nhau 37 Hình 4.6 Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết khi pha

Hình 4.7 Khả năng diệt khuẩn in vitro của nano bạc khi pha loãng ở các nồng

Hình 4.8 Khả năng diệt khuẩn in vitro của nano bạc khi pha loãng ở các nồng

Hình 4.9 Khả năng diệt khuẩn in vitro khi phối trộn cao khô dịch chiết lá trầu

Hình 4.10 Chiều dài vết bệnh trên lá lúa khi sử dụng các công thức phun khác

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Nghiên cứu nhằm mục đích đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro của nano bạc và dịch chiết thực vật đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa

Thử nghiệm khả năng phòng trị bệnh bạc lá lúa của nano bạc và cao khô dịch chiết trên

giống lúa IR24 trong điều kiện thí nghiệm in vivo

Từ 5 loại thực vật nghiên cứu (trầu không, tỏi, đơn đỏ, huyền diệp, lược vàng) chúng tôi sử dụng các loại dung môi tách chiết khác nhau để tiến hành chiết xuất và đánh giá hiệu suất tách chiết Phương pháp hóa học được chúng tôi sử dụng nhằm định tính các nhóm hợp chất có trong cao dịch chiết thực vật từ đó xác định được các nhóm hợp chất chính có khả năng kháng khuẩn có trong thực vật nghiên cứu Để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc và dịch chiết thực vật trong các thí nghiệm chúng

tôi sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (theo Cavahol et al., 2011) Đánh giá

khả năng kháng nhiễm của giống bằng cách đo chiều dài vết bệnh sau 18 – 20 ngày lây nhiễm theo phương pháp của GS Satoru Taura (2003) được chúng tôi sử dụng để đánh giá tác dụng của nano bạc kết hợp với dịch chiết thực vật đối với cây lúa trong điều kiện

cao nhất đối với 2 chủng vi khuẩn lần lượt là 25,33±1,15 mm và 26,33 ± 0,57 mm

Nồng độ cao dịch chiết nhỏ nhất vẫn còn khả năng ức chế in vitro đối với 02 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae 01, 33 lần lượt là 0,78 mg/ml và 1,56 mg/ml

Nồng độ nano bạc nhỏ nhất vẫn còn khả năng ức chế vi khuẩn là 6,25 ppm

Khi thí nghiệm in vivo trên giống lúa IR24 sử dụng phối hợp nano bạc (3,13

ppm) và cao khô dịch chiết lá trầu không (1,56 mg/ml), thì chiều dài vết bệnh chỉ còn 9,55 cm, nằm ở mức độ nhiễm vừa do đó có thể khẳng định nano bạc đã có tác dụng

làm tăng tác dụng kháng khuẩn của cao khô dịch chiết không chỉ trong thí nghiệm in

vitro mà còn trong thí nghiệm in vivo

THESIS ABSTRACT

The present study aimed at evaluating the in vitro anti-bacterial effect of herbal extracts and silver nano to Xanthomonas oryzae Experimantal treatment rice blight

disease caused by bacteria Xanthomonas oryzae in rice variety IR24 by Piper siriboa

L extract and silver nano

From 5 different herbs (Piper siriboa L.; Allium sativum L.; Excoecaria

cochinchinensis Lour.; Polyalthia longifolia var pendula; Callisia fragrans Lind), we

tried to evaluate the anti-bacterial effect and efficiency of extraction method with some different solvent Chemical methods were used to determine the chemical group in plant extract Anti-bacterial effect of plant extract and silver nano were evaluated by agar

diffusion method To determine the effect of disease control in vivo, we measure the

disease mark in susceptible breed after 18 – 20 days post injection were various from

9,687 % (Allium sativum L.) to 16,357% (Excoecaria cochinchinensis Lour.) At the

concentration of 100 mg/ml, all the extracts showed good anti-bacterial effect with

Xanthomonas oryzae Diameter of the bacterial inhibition zones were from 15,67 mm

(Allium sativum L extract) to 24,33 mm (Piper siriboa L extract)

The results showed that, Piper siriboa L extract solution with ethanol 70%

showed the best anti-bacterial efficacy

Evaluating the extracted efficacy of Piper siriboa L with sevent different

solvents (distilled water, ethanol 35%, ethanol 70%, ethanol 96%, acid acetic 5%, aceton nitril 50% and aceton nitril 100%) showed that the highest efficiency was ethanol 96% which had the weight average of dry glue about 0,40 g and the extract efficiency was about 20% Reducing sugars, coumarin, polyphenols, flavonoids, tannins

present in Piper siriboa L extracts The highest clear zone against 2 Xanthomonas

oryzae strains were 25,33 ± 1,15 mm and 26,33 ± 0,57 mm, respectively The minimum inhibitor concentration of extract against 2 strains 01 and 33 were 0,78 mg/ml and 1.56 mg/ml

The minimum inhibitor concentration of silver nano were 6,26 ppm

In vivo trial with IR24 rice breed using the combination of silver nano (3,33

ppm) and Piper siriboa L extract (1,56 mg/ml) showed that the length of disease mark

were 9,55 cm that were average resistance So we concluded that silver nano increase

the anti-bacterial efficiency of plant extract not only in in vitro experiments but also under in vivo trials

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra là một trong

những bệnh nguy hiểm, gây thiệt hại nặng trên cây lúa, đặc biệt khi độ ẩm không

khí cao và trong mùa mưa bão (Nino-Liu et al., 2006) Ở Việt Nam, công tác

chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá chưa được coi trọng có thể do khả năng lây lan thành dịch không cao như các bệnh dịch hại khác như rầy nâu, đạo ôn Tuy nhiên, những bằng chứng cụ thể đã cho thấy dịch bệnh này không hề thua kém những dịch hại khác Một số nước trong khu vực, bệnh bạc lá lúa đã gây hại

nghiêm trọng cho ngành trồng lúa và đã làm giảm năng suất tới 50% (Khush et

al , 1989), thậm chí có thể lên tới 80% (Singh et al., 1977) Theo số liệu thống kê

của cục bảo vệ thực vật trong năm 2014 diện tích bị bệnh bạc lá lúa tăng 35% - 70% so với năm trước (năm 2013 tăng 49% so với năm 2012)

Để giảm thiểu thiệt hại của bệnh, người ta sử dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp như áp dụng các biện pháp canh tác thích hợp, áp dụng chế độ bón phân hợp lý, vệ sinh đồng ruộng, mật độ gieo trồng hợp lý, sử dụng giống kháng bệnh bạc lá, sử dụng thuốc bảo vệ thực vật phòng bệnh bạc lá Trong đó việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để phòng bệnh là một biện pháp quan trọng và chủ yếu Theo báo cáo của Tổng cục Môi trường, thuộc Bộ Tài nguyên và Môi trường cho thấy, trung bình mỗi năm nước ta sử dụng từ 15 ngàn - 25 ngàn tấn thuốc bảo vệ thực vật Gần 100% diện tích đất canh tác nông nghiệp đều có sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Trong khi đó, thuốc bảo vệ thực vật có chứa độc tố cao với hàng trăm tên thương mại và nguồn gốc xuất xứ khác nhau Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật gây ảnh hưởng rất lớn đến môi trường sinh thái và sức khỏe của con người, đồng thời làm xuất hiện các loài gây bệnh mới

có khả năng kháng thuốc

Ngày nay, việc áp dụng các hướng tiếp cận mới trong việc sản xuất thuốc bảo vệ thực vật an toàn và hiệu quả đang được đẩy mạnh nghiên cứu Trong đó, công nghệ nano bạc đã đạt được nhiều thành tựu trong nông nghiệp nói chung và

ngành bảo vệ thực vật nói riêng (Khot et al., 2012), tạo ra các sản phẩm hiệu quả,

an toàn và kinh tế Bên cạnh đó, hướng tiếp cận sử dụng các hợp chất có nguồn

gốc từ thiên nhiên cũng được đẩy mạnh nghiên cứu (Jabeen, 2011), trong đó nhiều loài đã được chứng minh có hiệu quả trong việc phòng chống một số loại sâu bệnh hại cây trồng

Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá

hiệu quả ức chế của Nano bạc và dịch chiết thực vật đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa”

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Thu được cao khô dịch chiết (DC) thực vật gồm (Trầu không, đơn đỏ, huyền diệp, lược vàng, tỏi) và đánh giá hiệu suất tách chiết khi sử dụng các loại dung môi tách chiết khác nhau Xác định một số nhóm hoạt chất có trong các loại dịch chiết thực vật

Đánh giá tác dụng ức chế của nano bạc và dịch chiết thực vật đối với vi

khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa (Oryza sativa L) trong điều kiện

nghiệm chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật sinh học

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu: Cây trầu không (Piper siriboa L.), cây tỏi (Allium

(Polyalthia longifolia var pendula), cây lược vàng (Callisia fragrans L.)

Vi khuẩn nghiên cứu: Vi khuẩn Xanthomonas oryzae chủng 1 và Vi

khuẩn Xanthomonas oryzae chủng 33

Nano bạc: Nano bạc có nồng độ gốc 100ppm

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1 năm 2015 đến tháng 10 năm 2015 Địa điểm nghiên cứu: Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông

Nghiệp Việt Nam

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 1.4.1 Ý nghĩa khoa học

- Đề tài giúp đánh giá được khả năng diệt khuẩn của nano bạc và DC thực

vật đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa Cung cấp những

số liệu ban đầu về tác động của chế phẩm đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae

gây bệnh bạc lá lúa

- Bước đầu xác định được nồng độ thích hợp của nano bạc và DC thực

vật Tạo tiền đề cho việc tạo ra những chế phẩm có khả năng ứng dụng cao vào thực tiễn sản xuất

- Kết quả từ đề tài là cơ sở cho việc nghiên cứu tạo ra các chế phẩm từ nano bạc kết hợp với các loại DC từ nhiều loại cây thực vật khác nhau để sử dụng trong phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Tận dụng các nguồn thực vật sẵn có, kết hợp với nano bạc tạo ra chế

phẩm để phòng trừ vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa

- Chế phẩm hoàn thiện sẽ là cơ sở để tạo ra các sản phẩm nhằm thay thế dần cho việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học trong phòng trừ sâu, bệnh trên cây lúa và các loại cây trồng khác qua đó góp phần tạo ra các sản phẩm nông sản an toàn cho người sử dụng và hạn chế ô nhiễm môi trường

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ NGHIÊN CỨU BỆNH BẠC LÁ

2.1.1 Bệnh bạc lá

Bệnh bạc lá lúa (Bacterial leaf blight of rice) được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka, Nhật Bản vào khoảng năm 1884 – 1885 Sau đó đã có báo cáo xuất hiện bệnh ở nhiều nước khác nhau, đặc biệt ở Châu Á (Nhật Bản, Trung Quốc, Philippin), Bắc Châu Úc, Mỹ Latin; Trung Mỹ và Caribê (1975); Pakistan (1976);

… Hiện nay, bệnh đã gây hại phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới

Ở nước ta, bệnh này đã gây hại từ lâu trên các giống lúa mùa cũ, nhưng đặc biệt từ năm 1965 – 1966 tới nay có năm bệnh phá hại một cách nghiêm trọng

ở các vùng đồng bằng trên các giống lúa mới nhập nội có năng suất cao ở vụ xuân và nhất là trong vụ mùa Theo số liệu thống kê của cục Bảo vệ thực vật, từ năm 1999-2003 diện tích lúa bị hại do bệnh bạc lá gây ra trong cả nước là 108.691,4

ha (miền Bắc là 86.429,2 ha; miền Nam là 22.262,2 ha), trong đó diện tích bị hại nặng nhất là 156,76 ha và diện tích mất trắng là 80 ha

2.1.2 Nguyên nhân gây bệnh bạc lá

2.1.2.1 Nguồn gốc của bệnh bạc lá

Khi mới xuất hiện ở Nhật Bản, người ta cho rằng bệnh có nguồn gốc sinh

lý, do đất chua gây nên Năm 1908, Takaishi tìm thấy vi khuẩn trong giọt sương của lá lúa, nhưng ông không nêu rõ tên sinh vật Bokura năm 1911 sau một nghiên cứu về hình thái và sinh lý học của nó đã phân lập được một loại vi khuẩn, sau đó vi khuẩn được đặt tên là Bacillus oryzae Hori và Bokura Năm

1922 Ishiyama đã nghiên cứu sâu hơn về vi khuẩn gây bệnh và đổi tên các loại vi

khuẩn Pseudomonas oryzae Iyeda và Ishiyama theo hệ thống của Migula Vi

khuẩn gây bệnh bạc lá đã được nhiều tác giả nghiên cứu và đã từng được đặt

nhiều cái tên khác nhau:

- Pseudomonas oryzae Iyeda et Ishiyama hoặc Phytomanas oryzae Magrou

- Xanthomonas campeitris p.v oryzae

- Xanthomonas kresek Schure

- Xanthomonas oryzae (Ishiyama) Dowson

Hiện nay vi khuẩn này được biết đến với cái tên Xanthomonas oryzae

Pv.oryzae (Ishiyama)

2.1.2.2 Nguyên nhân gây bệnh

Về nguồn gây bệnh bạc lá, các tác giả Nhật Bản cho rằng nguồn bệnh tồn tại chủ yếu trên một số cỏ dại họ Hoà thảo, nói cách khác một số cỏ dại là ký chủ

phụ của vi khuẩn Xanthomonas oryzae

Ở nước ta phát hiện thấy vi khuẩn hại trên lúa và trên các ký chủ cỏ dại, tàn dư rơm rạ của cây bệnh, lúa chết, cỏ môi, cỏ lồng vực, cỏ gừng bò (Lê Lương Tề, 1980)

Mỗi vùng khác nhau thì cũng có sự khác nhau về thành phần và số lượng

chủng Xanthomonas oryzae: Nhật Bản đã xác định được 5 chủng, Philippine đã

xác định được 6 chủng, Indonesia đã xác định được 9 chủng, miền Bắc Việt Nam

đã xác định được 10 chủng (Phan Hữu Tôn, 2002)

Về nguyên nhân gây bệnh có thể kể đến một số nguyên nhân chính sau:

- Một số giống mẫn cảm với bệnh bạc lá như một số giống tạp giao và một

- Bệnh thường mẫn cảm với lượng đạm dư trong lá, những ruộng bón đạm nhiều, bón muộn, bón lai rai, bón không cân đối giữ đạm, lân và kaly, những ruộng trũng hẩu dồn đạm cuối vụ, do biện pháp thâm canh gieo cấy, chăm bón không đúng kỹ thuật

2.1.3 Tác hại của bệnh bạc lá

- Giảm diện tích quang hợp của lá; Giảm khối lượng 1000 hạt; Tăng tỷ lệ hạt lép; Giảm 20 - 50% năng suất

2.1.4 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh bạc lá

2.1.4.1 Quy luật phát sinh, phát triển

Bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh ở vụ mùa các tỉnh phía Bắc Bệnh phát triển, lây lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ 26-29°C, ẩm độ 90%, đặc biệt

khi có mưa to và gió lớn làm dập nát lá lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan (Phan Hữu Tôn, 2004) Vì thế vụ mùa bệnh thường gây tác hại nặng hơn vụ xuân Vụ chiêm xuân bệnh phát triển mạnh vào tháng 5 - 6, còn vụ mùa là tháng

8 - 9 khi có nhiều mưa bão gây tổn thương cho lá lúa

Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh nhất vào giai đoạn lúa làm đòng đến chín sữa vì đây là giai đoạn lúa mẫn cảm nhất với bệnh bạc lá

2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh

Có nhiều yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh Ẩm độ và lượng mưa là hai yếu tố quyết định cho sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá, lượng mưa lớn và nhiều kèm theo gió bão không những làm tổn thương đến lá khiến vi khuẩn dễ dàng xâm nhập mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sản nhanh, tạo nhiều giọt dịch vi khuẩn và lây lan nhanh chóng

Phân bón và thời kỳ bón cũng là yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh phát triển của bệnh Lượng đạm bón lớn làm thân lá phát triển mạnh, cây mềm yếu và dễ bị tổn thương nên dễ bị nhiễm bệnh Bón sớm, tập trung sẽ giảm khả năng bị bệnh hơn so với bón muộn, rải rác Bón đạm cân đối với lân và kali cũng làm giảm khả năng nhiễm bệnh Tuy nhiên, nếu bón quá nhiều đạm (>120 kg N/ ha) thì bón thêm lân và kali cũng không còn tác dụng

Đất màu mỡ nhiều chất hữu cơ thì bệnh phát triển hơn ở chân đất cằn cỗi Những nơi đất chua, ngập úng, nhiều mùn, lúa bị che bóng bệnh cũng phát triển mạnh hơn

Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá Các giống lúa cũ, lúa địa phương nhiễm bệnh nhẹ hơn so với các giống lúa nhập nội có thời gian sinh trưởng ngắn, phàm ăn Theo điều tra của Viện bảo

vệ thực vật thì các giống lúa lai Trung Quốc nhập nội từ năm 1993 – 1997 hầu hết đều bị nhiễm bệnh bạc lá với mức tỷ lệ bệnh 50-80%, cấp phổ biến là 5-7, nếu bệnh nặng năng suất giảm 20-50%

2.1.5 Vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas oryzae pv oryzae

2.1.5.1 Phân loại khoa học

Giới : Bacteria; Ngành: Proteobacteria; Lớp: Gamma Proteobacteria; Bộ:

Xanthomonadales; Họ: Xanthomonadaceae; Chi: Xanthomonas Loài: X oryzae

2.1.5.2 Đặc điểm của vi khuẩn bạc lá

Vi khuẩn hình gậy hai đầu hơi tròn, có một lông roi ở một đầu, kích thước

1- 2 x 0,5-0,9 µm, sống trên môi trường có khuẩn lạc hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, vi khuẩn nhuộm gram âm, không có khả năng khử NO3, không có dịch hoá gelatin, không tạo ra NH3, indol, có khả năng tạo H2S

Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trưởng 26 – 30oC, nhiệt độ tối thiểu 0 - 5oC, tối đa 40oC Nhiệt độ gây chết là 53oC trong 10 phút, có thể sống trong phạm vi pH 5,7 - 8,5, thích hợp nhất ở pH 6,8 - 7,2 Vi khuẩn xâm nhiễm qua thuỷ khổng, lỗ khí ở trên mút lá và đặc biệt qua vết thương xây xát trên lá Khi đã tiếp xúc với bề mặt có màng nước ướt, vi khuẩn dễ dàng di động tiến vào bên trong các lỗ khí, qua vết thương mà sinh sản nhân lên về số lượng qua các bó mạch dẫn lan rộng đi (Nguyễn Công Khoái, 2002)

Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho việc phát triển của vi khuẩn, trên mặt lá bệnh tiết ra những giọt keo vi khuẩn thông qua sự va chạm giữa các lá lúa nhờ mưa gió mà truyền lan tới các lá, các cây khác để tiến hành lây nhiễm lặp lại trong nhiều đợt sinh trưởng Cho nên tuy là một loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan hẹp, song nó còn tùy thuộc vào mưa gió, giông bão xảy ra trong vụ mùa

mà bệnh có thể truyền lan với phạm vi không gian khá rộng, giọt keo vi khuẩn với số lượng nhiều, đó chính là một nguyên nhân quan trọng làm bệnh lây lan sau những đợt mưa gió vào cuối vụ lúa xuân và trong suốt vụ mùa ở nước ta (Phan Hữu Tôn, 2004)

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SỬ DỤNG DỊCH CHIẾT THỰC VẬT TRONG VIỆC PHÒNG TRỪ SÂU, BỆNH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2.2.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng dịch chiết thực vật trong việc phòng trừ sâu, bệnh trên thế giới

Trong nhiều năm gần đây việc nghiên cứu đánh giá tác dụng kháng khuẩn của các loại dịch chiết thực vật trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật đã được quan tâm và phát triển, một số loài thực vật đã chiết xuất được các chất ức chế

hiệu quả đối với các vi khuẩn gây bệnh trên thực vật (Leksomboon et al., 1998) Dịch chiết từ cây xoan chịu hạn (Azadirachta Indica A.Juss) được tăng hiệu quả diệt sâu hại khi phối chế với vi khuẩn diệt côn trùng Bacillus thuringiensis

(Bt) tạo ra một loại thuốc diệt sâu hại đa tác dụng (Dennis Dearth, 1992)

Tinh dầu rau mùi (Coriandrum sativum L.) có tác dụng ức chế vi khuẩn đối với 12 loại vi khuẩn như vi khuẩn E coli, Salmonella, khuẩn que ở nồng độ

1.6% tinh dầu rau mùi (Fernanda Domingues, 2014)

Cavallito and Bailey (1944) đã phân tích được hợp chất allicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh Allicin chỉ có trong tỏi chưa nấu hay chế hóa Kháng sinh này mạnh bằng 1/5 thuốc penicillin, 1/10 thuốc tetraciline, có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn, xua đuổi hoặc tiêu diệt nhiều loại sâu bọ, kí sinh trùng, nấm độc

Leksomboon et al (2001) đánh giá hiệu quả của DC thực vật để kiểm soát bệnh thối mục trên cây chanh do Xanthomonas axonopodis pv citri (XC) gây ra

trong điều kiện nhà kính và điều kiện thường

Mothana and Lindequist (2005) Đã lựa chọn hai mươi lăm loài thực vật thuộc 19 họ khác nhau được thu thập từ các địa phương khác nhau của đảo Soqotra, sấy khô và chiết xuất với các dung môi chloroform, methanol và nước nóng để mang lại 80 chiết xuất Các chất chiết xuất đã được thử nghiệm cho hoạt động kháng khuẩn chống lại một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm và chống lại một loài nấm men, nghiên cứu đã sử dụng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Hoạt tính kháng khuẩn đã được chứng minh đặc biệt là chống lại vi khuẩn

gram dương bao gồm các chủng Staphylococcus đa kháng

Okigbo and Nmeka (2005) Nghiên cứu khả năng kiểm soát bệnh thối củ

khoai mỡ từ DC lá và hạt cây Xylopia aethiopica and Zingiber officinale

Lalitha et al (2010) sử dụng dịch chiết từ cây Solanum torvum bằng dung

môi ethanol và methanol cho kết quả kháng tốt với nhiều loại bệnh gây hại trên hạt lúa

Govindappa (2011) Dịch chiết từ lá cây Adathoda vasica không chỉ kháng lại

vi khuẩn X oryzae mà còn kích thích tính kháng tập nhiễm hệ thống trên cây lúa Tinh dầu cây cam ba lá (Poncirus trifoliata) có khả năng ức chế vi khuẩn

µg/ml (Rahman et al., 2014)

Ahameethunisa and Hopper (2010) đã tìm ra sự hiện diện của các chất dẫn

xuất phytochemical trong các chất chiết xuất từ A nilagirica Do đó, sự cô lập và tinh chế hợp chất tiềm năng điều trị từ A nilagirica có thể được sử dụng như một

nguồn hiệu quả chống lại bệnh do vi khuẩn trên con người và thực vật

2.2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng dịch chiết thực vật trong việc phòng trừ sâu, bệnh ở Việt Nam

Theo Phạm Bình Quyền (1988), khi nghiên cứu phòng trừ côn trùng gây

hại bằng các yếu tố sinh học, đã đánh giá các chế phẩm sinh học và thảo mộc có hiệu lực đối một số loại sâu hại trên cây đậu ăn quả Chế phẩm thảo mộc Artoxid (dạng dịch chiết cây thanh hao) có hiệu lực cao với rệp đậu màu đen

Theo Nguyễn Duy Trang (1995), hạt na kết hợp với các loại dung môi (cồn 96º, Acetone, Methanol) có hiệu quả phòng trừ sâu tơ và sâu khoang đạt 66,25 – 79,84% sau phun 72 giờ; nhưng hiệu quả phòng trừ bọ nhảy không cao (đạt 21,27 – 49,23% sau phun 72 giờ)

Theo Quách Thị Ngọ (2000), dịch chiết một số thực vật (hạt củ đậu với liều lượng 15 kg/ha; rễ cây Derris với lượng 20 kg/ha và bột lá xoan ta với lượng

28 kg/ha) có hiệu lực phòng trừ rệp muội hại rau cải bắp khá cao (đạt 20,5 - 52,6% sau phun 1 ngày và 31,7 - 65,4% sau phun 3 ngày)

Theo Võ Văn Kim (2005), Trung tâm nghiên cứu hóa sinh ứng dụng

thành phố Hồ Chí Minh kết hợp với Nông trường trồng Neem Ninh Thuận và

Trung tâm Nông dược thành phố Hồ Chí Minh đã hợp tác nghiên cứu sản xuất thuốc Limo 3000BR Chế phẩm này có hiệu quả phòng trừ mọt cao (đạt 80 - 90% sau xử lý 21 ngày); có khả năng ức chế 100% sự nẩy mầm của hạch nấm

sâu tơ hại rau

Theo Phạm Văn Lầm (2009), thuốc trừ sâu thảo mộc trừ côn trùng bằng con đường tiếp xúc vị độc hoặc xông hơi Phổ tác động thường không rộng, một

số loại còn có khả năng diệt cả nhện hại cây Sau khi xâm nhập thuốc nhanh chóng tác động đến hệ thần kinh, gây tê liệt và làm chết côn trùng Thuốc thảo mộc rất an toàn đối với thực vật, ít độc, nhanh bị phân hủy, nên chúng không tích lũy trong cơ thể sinh vật, trong môi trường và không gây hiện tượng sâu, bệnh kháng thuốc

Theo Lê Đình Hường (2010), trong các loại quả như: ớt, tỏi, hành, gừng

có chứa hàm lượng axit có tác động đến cơ thể của những loài sâu bọ hại cây trồng như da, làm chúng chết Nếu chiết xuất thảo mộc này được pha chế với nồng độ phù hợp sẽ xua đuổi, tiêu diệt được các loài sâu bọ

Theo Trần Đình Phả (2011), hạt chè và bã sau ép dầu (sản phẩm sau ép dầu ăn của Viện Môi trường Nông nghiệp) có hiệu lực trừ ốc bươu vàng, tuyến trùng và sâu hại trong đất cao (đạt 76 - 93%)

Theo Bùi Lan Anh và cs (2011), dung dịch ngâm hạt, lá xoan Neem và

chế phẩm Vineeem 1500EC có hiệu quả phòng trừ cao đối với rệp hại rau họ hoa thập tự (đạt 61,3 - 88,3% sau phun 7 ngày)

Theo Lê Thị Nga (2012), dung dịch ngâm hỗn hợp lá đu đủ và cỏ Siam

có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu xanh bướm trắng cao (đạt 73,56% sau phun 10 ngày)

Theo Đặng Thị Phương Lan (2012), Matrine được chiết xuất từ cây khổ sâm và chất Azadirachtin được chiết xuất từ cây xoan có hiệu quả phòng trừ cao đối với sâu tơ, sâu khoang hại rau họ hoa thập tự; bị trĩ hại bầu bí, cà chua, dưa chuột; ruồi đục lá đậu đỗ (đạt 60,3 - 89,73% sau phun 5 - 7 ngày); nhưng có hiệu quả thấp đối với bọ nhảy (đạt 31,13 - 33,76% sau phun 5 - 7 ngày) Chế phẩm Azadirachtin đạt hiệu quả cao đối với sâu tơ và sâu khoang hại rau họ hoa thập tự (đạt 70,71 - 79,92% sau phun 5 - 7 ngày); đạt hiệu quả trung bình đối với rồi đục

lá đậu đỗ (đạt 57,41 - 53,78% sau phun 5 - 7 ngày) và đạt hiệu quả thấp đối với sâu đục quả và bọ nhảy (đạt 48,25 - 51,14% sau phun 5 - 7 ngày)

2.3 THỰC VẬT

2.3.1 Cây Đơn đỏ

2.3.1.1 Nguồn gốc, phân loại

Tên khoa học: Excoecaria cochinchinensis Lour.Tên đồng nghĩa:

L Họ: Thầu dầu – Euphorbiaceae

Chi Excoecaria L có 5 loài ở Việt Nam Loài đơn đỏ tồn tại ở 2 dưới loài:

Cây đơn đỏ (còn có những tên gọi khác như: đơn tía, đơn mặt trời, đơn tướng quân, cây lá liễu, hồng bối quế hoa, cây mặt quỷ ) là loài bản địa Đông Nam Á và Trung Quốc Cây cũng có ở Lào và Campuchia Tại Việt Nam, cây mọc hoang hay được trồng ở nhiều nơi như Long An, Tiền Giang, Hậu Giang, Đồng Tháp, An Giang, Thái Bình, Nam Định Cây được trồng nhiều ở làng hoa Ngọc Hà - Hà Nội

để làm thuốc

Đơn mặt trời là cây ưa sáng, ưa ẩm, thường được trồng ở vườn gia đình hay các vườn thuốc của các cơ sở y tế để làm cảnh và làm thuốc Cây xanh tốt quanh năm Những cây không bị thu hái thường xuyên mới có quả

2.3.1.2 Mô tả thực vật

Cây gỗ nhỏ, mọc đứng, cao 1-1,5 m, không lông, có nhựa mủ màu trắng đục Thân non màu tía hơi ngả xanh, thân già màu xám đen; tiết diện tròn Lá đơn, mọc đối ở gần ngọn, mọc cách phía dưới Phiến lá hình bầu dục thuôn, gốc nhọn đôi khi không đối xứng, ngọn có đuôi, mặt trên màu xanh đậm, mặt dưới màu đỏ tía, nhẵn, dài 10-13 cm, rộng 4-5 cm; bìa lá có răng cưa nhọn rất cạn Gân lá hình lông chim nổi rõ ở 2 mặt, 12-14 cặp gân phụ Cuống lá màu xanh, dài 0,5-1 cm, tiết diện gần tròn mặt trên phẳng Lá kèm là 2 vẩy hình tam giác rất nhỏ, màu xanh đậm, đỉnh màu tía có ít lông, rụng rất sớm, dài 1,5-1,7 mm, rộng 1,5 mm

Cụm hoa cái là chùm mang 3 - 5 hoa cái ở nách lá hay ngọn cành Hoa đều, đơn tính khác gốc Hoa cái: Cuống hoa dài 2-3 mm, hình trụ, nhẵn, màu xanh Lá bắc dạng vẩy tam giác màu vàng xanh, đỉnh màu tía, bìa có lông màu nâu, dài 0,8-

1 mm; 2 lá bắc con tương tự lá bắc, dài 0,5 mm; có 2 tuyến nhỏ dạng hạt màu vàng

ở 2 bên lá bắc và lá bắc con Lá đài 3, đều, hơi dính ở gốc, dạng tam giác màu vàng tía, đỉnh nhọn, có một gân màu xanh; nổi rõ, rìa có lông màu nâu, dài 1-1,2

mm, tiền khai van Hoa vô cánh Bầu hình cầu, màu vàng, mặt ngoài nhẵn, đường kính 1-1,2 mm; lá noãn 3, dính, bầu trên 3 ô, mỗi ô 1 noãn, đính noãn trung trụ Vòi nhụy 3 ít khi là 4 hoặc 5, màu vàng đính trên đỉnh bầu, dài 1,5-2 mm, tỏa ra 3 hướng tận cùng là đầu nhụy uốn cong có nhiều gai thịt

Bột lá đơn đỏ có màu xanh nâu, mùi hắc nhẹ Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy có: mảnh mô mềm, mạch xoắn đứng riêng lẻ hay nằm trong các mô, bó sợi, mảnh mô mềm chứa chất màu, tinh thể calci oxalat có thể nằm riêng lẻ hay nằm trong biểu bì

2.3.1.3 Một số thành phần hóa học của cây Đơn đỏ

Lá đơn đỏ chứa flavonoid (15%), tanin, saponin, anthranoid, coumarin

Từ lá khô của cây đơn đỏ, Nguyễn Thái An (2010) đã chiết và phân lập được 2 acid polyphenol là acid gallic và acid ellagic, 2 flavonol là kaempferol 7-O-glucosid và kaempferol Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012) cũng đã chiết xuất và tinh chế được hợp chất kaempferol

2.3.2 Cây huyền diệp (Polyalthia longifolia var pendula)

2.3.2.1 Phân loại

Tên khoa học: Polyathia longifolia var pendula Tên thông thường: Huyền Diệp, Hoàng Nam Thuộc họ Na: Annonaceae Thuộc chi Nhọc: Polyalthia

2.3.2.2 Nguồn gốc

Chi Nhọc (Polyalthia) là một chi lớn trong họ Na (Annonaceae), có

khoảng 150 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Phi, châu Á và miền bắc nước Úc, số lớn các loài tập trung ở Đông Nam Á Ở Việt Nam có 27 loài, phân

bố khắp các vùng

Huyền diệp còn được gọi là Hoàng nam, là một loài cây gỗ thường xanh

thuộc họ Mãng Cầu (Na) – Annonaceae, phân bố tự nhiên ở Sri-Lanka, được trồng

phổ biến ở Ấn Độ Ở Ấn Độ cây Ashoka (huyền diệp) được biết phổ biến qua truyền thuyết Đức Phật Thích Ca ra đời nên nó cũng có tên là Sorrowless Tree, mà người Việt còn gọi là cây Vô Ưu Các nhà phân loại học thực vật trên thế giới biết cây

huyền diệp với tên khoa học là Polyalthia longifolia (dịch nghĩa: Nhọc lá dài), hoặc

2.3.2.3 Mô tả thực vật

Cây gỗ nhỡ, cao 5-15m, phân cành sớm từ gốc, dài, cong, rũ xuống, tán hẹp, dạng tháp, che kín gần hết thân, xanh quanh năm Lá đơn mọc cách, dạng thuôn dài hẹp, đầu nhọn, gốc tù, dài 8-20cm, rộng 2-4cm, màu xanh bóng nhẵn

cả hai mặt, mép lá nhăn nheo Gân bên không rõ Cuống lá dài 0,5-0,8cm cây xanh phổ biến Hoa đơn độc màu xanh xám, cánh hoa nhăn nheo, thơm Nhị đực nhiều Bầu có nhiều lá noãn Quả kép gồm nhiều quả nhỏ, dạng bầu dục dài 2cm, màu đen

2.3.2.4 Thành phần hóa học

Từ dịch chiết methanol của cây huyền diệp đã phân lập được một haliman diterpen mới, 3β,5β,16α - trihydroxyhalima - 13(14) - en - 15,16 - olit, và oxoprotoberberine alkaloid, (-) - 8 - oxopolyathiain trong đó có một số hợp chất

có hoạt tính kháng một số dòng ung thư

Dịch chiết n-hexan của vỏ cây huyền diệp (Polyathia longifoia) đã phân

lập được 9 hợp chất clerodan và ent - haliman diterpen mới là: 16 - hydroxycleroda - 4(18), 13 - dien - 16,15 - olit; axit 16 - oxocleroda - 4(18), 13E

- dien - 15 - oic; cleroda - 4(18), - 13 - dien - 16,15 - olit; 16 - hydroxyl - ent - Halima - 5(10), 13 - dien - 16,15 - olit; axit 16 - oxo - ent - Halima - 5(10), 13E - dien - 15 - oic; ent - Halima - 1(10),13E - dien - 16,15 - olit; axit 16 - oxo - ent - halima - 5(10),13E - dien - 15 - oic; ent - Halima - 5(10),13 - dien - 16,15 - olit và ent - Halima - 5(10),13E - dien - 16,15 - olit cùng với 5 clerodan diterpen đã biết

Từ cây Polyathia longifolia, Chen et al (2000) đã phân lập được 1 hợp

chất A haliman diterpen mới, 3β,5β,16α - trihydroxyhaliman - 13(14) - en - 15,16

- olide, và oxoprotoberberin alkaloid, (-) - 8 - oxopolyalthiain, cùng với 20 hợp chất đã biết, 16α - hydroxycleroda - 3,13 - dien - 15,16 - olit; axit 16 - hydroxycleroda - 3,13 - dien - 15 - oic; axit cleroda - 3,13E - dien - 15 - oic; axit 3,12E - lolavadien - 15 - oic - 16 - al; (4→2)- abeo - 16 (R và S)- 2,13Z - kolavadien

- 15,16 - olit - 3 - al; axit labd - 13E - en - 8 - ol - 15 - oic; (-)- stepholidin, 1 - aza - 4

- methyl - 2 - oxo - 1,2 - dihydro - 9,10 - anthracenedion; 5 - hydroxyl - 6 - methoxyonychin; 6 - hydroxyl - 7 - methoxyonychin; liriodenin; oxoxylopin; (-) - anonain; (-) - asimilobin; (-) - norboldin; (+) - norboldin; (-) - norpallidin; axit ρ - hydroxybenzoic; β - sitosterol và stigmasterol

Một clerodan diterpenoit là 16 - hydroxycleroda - 13 - en - 15,16 – olit - 3

- on được phân lập từ vỏ cây Polythia longifolia var pendula cùng với 23 hợp

2.3.3 Cây lược vàng

2.3.3.1 Nguồn gốc

Cây lược vàng có xuất xứ từ Trung và Nam Mỹ có tên khoa học Callisia

2.3.3.2 Mô tả thực vật

Cây thảo sống lâu năm Thân đứng cao từ 15-40cm, có thân bò ngang trên mặt đất Thân chia đốt và có nhánh Đốt ở phía thân dài từ 1-2cm, ở nhánh có thể dài tới 10cm

Lá đơn, mọc so le, phiến lá thuôn hình ngọn giáo (15-20cm x4-6 cm), bề mặt nhẵn, mặt trên xanh đậm hơn mặt dưới, mọng nước Bẹ lá ôm khít lấy thân Mép lá nguyên, thường có màu vàng khi lá già Gân lá song song, lá thường có màu tím ở những cây có nhiều ánh sáng

Hoa hợp thành xim, sắp xếp ở ngọn một trụ dài và cong thành chùm

Cụm hoa không cuống, gồm 6-12 bông Hoa màu trắng, cuống hoa dài 1mm Lá bắc ngoài cụm hoa hình vỏ trấu (1cmx1cm), màu vàng Lá bắc của hoa hình lòng thuyền, kích thước 1,5mmx3mm, phần dưới trắng, phần trên xanh, mép nguyên Đài 3, hình trứng, rời nhau (3cmx1,5cm) Phần dưới xanh, phần trên có màu tím, mép nguyên, có lông mịn phía dưới Tràng 3, hình trứng, kích thước khoảng 1mmx2,5mm, màu trắng, mép nguyên Nhị 6, rời, chỉ nhị dài khoảng 5mm, phần dưới dính với cánh hoa, bao phấn hình hạt đậu, kích thước khoảng 1/3x 1/4mm, đính vào hai bên trung đới Bầu trên, 3 ô, cao khoảng 0,5mm, vòi nhụy hình trụ dài khoảng 1,5mm, núm nhụy hình chổi

Sang Việt Nam dưới hình thức là cây cảnh, lúc đầu ở Thanh Hóa, giờ đây cây lược vàng đã nhanh chóng lan ra các tỉnh thành trong cả nước Ở nước ta

lược vàng còn được gọi bằng cái tên khác nhau như: “Lan vòi”, “địa lan vòi”,

2.3.3.3 Một số thành phần hóa học của cây lược vàng

Theo một số tài liệu, các nhà khoa học Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện hàn lâm khoa học nước cộng hòa Uzbekistan ở Tashkent, cũng như Viện thực vật Việt Nam đã nghiên cứu, cây Lược vàng có thành phần hóa học như sau:

- Lipid gồm các nhóm glycolipid và phospholipid trung hòa: triacylglyceride, sulfolipid, digalactosyglycerides,…; Các thành phần của axit béo: paraffinic, olefinic; Axit hữu cơ; Các sắc tố caroten, chlorophyl; Phytosterol; Đường tự do, polisaccharic; Các vitamin: vitamin PP, vitamin B2, và các nguyên tố vi lượng: Fe, Cr, Ni, Cu,…; Các flavonoid: quercetin, kaempferol

2.3.4 Cây tỏi

2.3.4.1 Nguồn gốc

Cây tỏi xuất xứ từ các nước Trung cận đông: Afganixtan, Iran, đó là những vùng có nắng nhiều, độ ẩm không khí thấp, biên độ nhiệt ngày và đêm giữa các mùa trong năm chệnh lệch rõ rệt

2.3.4.2 Mô tả thực vật

- Thân: Thân thật của tỏi rất ngắn đã thoái hóa chúng là dạng dỏ nằm sát ngay dưới chân giả (thân củ) Trên thân thật có mầm sinh dưỡng và sinh thực, những mầm này được che phủ bởi những bẹ lá dày mọng nước; Thân củ tỏi bao gồm một số nhánh (ánh và tép ) được liên kết với nhau bởi màng mỏng

- Lá: Lá thật đầu tiên của tỏi là một lá mầm, sau khi nảy mẩm tùy theo

điều kiện thời tiết mà lá có hình dạng hình bản bằng phẳng, trên lá có phủ một lớp sáp Thời kì đầu lá tỏi sinh trưởng rất chậm sau khi nảy mầm chỉ dài vài cm Tuổi thọ của lá phụ thuộc vào sự sinh trưởng và phát triển của cây, khi lá bắt đầu chết cũng là quá trình tạo củ bắt đầu

- Hoa: hoa tỏi thuộc hoa đầu trạng, hoa có 6 lá đài, 6 nhị và nhụy Hoa thụ phấn chéo (phấn hoa thường chín trước vì vậy phải thụ phấn với cây bên cạnh hoặc cây khác ) Hoa có màu trắng xám đôi khi phớt tím hoặc hồng Vòi nhụy rất bé, bầu thượng có 3 ngăn nếu được thụ phấn đủ sẽ cho 6 hạt Cành hoa dài 60-100mm hình ống màu xanh, một chùm hoa có từ 250-600 hoa phân bố theo 3 tầng

- Củ: Loài tỏi trắng củ to đường kính 3,5-4 cm, củ chắc và cay, dọc thân gần củ có màu tía

- Rễ: rễ tỏi thuộc loại rễ chùm, phát triển kém tập trung chủ yếu ở lớp đất mặt, khả năng chịu hạn kém Rễ tỏi có nhiều sợi dài phân nhánh yếu, chúng được bao phủ một số lượng lớn lông hút

2.3.4.3 Một số thành phần hóa học của tỏi

Tỏi là một loại rau có giá trị dinh dưỡng cao, trong tỏi có các thành phần hóa học như: protein 3%, đường 9%, vitamin 30%- 35% các vitamin A, B1, B2, và các chất khoáng Na, Ca, Mg, P, Fe… Do vậy tỏi đóng vai trò rất quan trọng trong việc cung cấp các chất cần thiết cho cơ thể con người

2.3.5 Cây trầu không (Piper betle L.)

2.3.5.1 Nguồn gốc

Thuộc họ: Hồ tiêu Piperaceae

Trầu không hay trầu là một loài cây gia vị hay cây thuốc, lá của nó có các tính chất dược học Đây là loài cây thường xanh, loại dây leo và sống lâu năm, với các lá hình trái tim có mặt bóng và các hoa đuôi sóc màu trắng, có thể cao tới

1 mét Loài này có nguồn gốc ở vùng Đông Nam Á và được trồng ở Ấn

Độ, Indonesia, Sri Lanka, Việt Nam, Malaysia Lá trầu không loại tốt nhất thuộc

về giống "Magahi" (từ vùng Magadha) sinh trưởng ở gần Patna tại Bihar, Ấn Độ

Ở Việt Nam có hai loại trầu chính: trầu mỡ và trầu quế Lá trầu mỡ to bản, dễ trồng Trầu quế có vị cay, lá nhỏ, được ưa chuộng hơn trong tục ăn trầu

2.3.5.2 Mô tả thực vật

Lá có cuống có bẹ, dài 1,5-3,5mm; phiến hình trái xoan, dài 10-13cm, rộng 4,5-9cm, có gốc hơi không cân, hình tim nhiều hay ít ở những lá dưới, có

mũi nhọn ở chóp, có dạng màng và cứng, có các điểm tuyến trong suốt rất mịn; gân gốc thường là 5 Hoa khác gốc, mọc thành bông Quả mọng lồi, tròn, có những lông mềm ở đỉnh

2.3.5.3 Một số thành phần hoá học

Lá chứa 0,8-1,8% (-2,4%) tinh dầu thơm, có vị nồng, gồm chủ yếu là 2 phenol: betel-phenol là đồng phân của eugenol và chavicol kèm theo nhiều hợp chất phenolic khác Chúng có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với các loại vi khuẩn, tụ cầu khuẩn, liên cầu khẩu, song cầu khuẩn, vi khuẩn subtillis và trực trùng coli

Hình 2.1 Cây thảo dược nghiên cứu 2.4 NANO BẠC

2.4.1 Tổng quan về nano bạc

Cách đây hàng trăm năm, các nhà khoa học thế giới sau rất nhiều nghiên cứu

đã chứng minh được bạc có tính năng diệt khuẩn và dụng cụ đồ ăn bằng bạc đã được

sử dụng trong giới hoàng tộc, vua chúa để khử độc và chống bệnh ung thư

Tuy nhiên mãi đến tháng 12 năm 1959 ý tưởng cơ bản về công nghệ

nano mới được đưa ra bởi nhà vật lý học người Mỹ Feynman, ông cho rằng khoa học đã đi vào chiều sâu của cấu trúc vật chất đến từng phân tử, nguyên tử vào sâu hơn nữa (Feynman, 1960) Nhưng thuật ngữ “công nghệ nano” mới bắt đầu được sử dụng vào năm 1974 do Nario Taniguchi một nhà nghiên cứu tại trường đại học Tokyo sử dụng để đề cập khả năng chế tạo cấu trúc vi hình của mạch vi điện tử

* Hạt nano bạc

Giới thiệu về bạc kim loại

- Cấu hình electron của bạc: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1

Hình 2.2 Cấu trúc tinh thể của bạc khối (Lê Thị Thu Hiền và cs, 2004)

- Độ bền hóa học cao, không bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác nhân oxy hóa khử thông thường

- Chi phí cho quá trình sản xuất thấp

- Ổn định ở nhiệt độ cao

2.4.2 Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc

Hiện nay tồn tại một số quan điểm giải thích cơ chế diệt khuẩn của bạc được nhiều người ủng hộ Các quan điểm đó chủ yếu dựa trên sự tương tác tĩnh điện giữa ion bạc mang điện tích dương và bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện tích

âm và trên sự vô hiệu hóa nhóm thiol trong enzym vận chuyển ôxy, hoặc trên sự tương tác của ion bạc với DNA dẫn đến sự đime hóa pyridin và cản trở quá trình sao chép DNA của tế bào vi khuẩn

Do kích thước nhỏ nên khả năng tác động và thâm nhập của hạt nano bạc qua lớp màng của vi khuẩn là rất tốt, thể hiện tác động rất mạnh đối với vi khuẩn Đồng thời, ở kích thước nano diện tích bề mặt của hạt nano là lớn hơn rất nhiều so với khối hạt của nó cho nên khả năng tương tác với vi khuẩn thông qua việc tiếp xúc bề mặt tăng lên Nếu kích thước của hạt nano bạc càng nhỏ thì càng tốt Bởi vì, kích thước càng nhỏ thì đặc tính ức chế vi khuẩn đã nêu trên là rất lớn

Hình 2.3 Bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn

Bạc ở kích thước nano có khả năng gây nên các biến đổi trong cấu trúc điện

tử của bề mặt, làm tăng cường khả năng hoạt động trên bề mặt của nano bạc Kích thước hạt nano bạc càng bé thì diện tích bề mặt tiếp xúc của các phân tử tương tác càng tăng lên Sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sunfuahydrin – SH của phân tử enzym chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình

hô hấp của tế bào vi khuẩn, làm cho vi khuẩn không phát triển (Nguyễn Ngọc Tú, 2009) Các hạt nano bạc thường có dạng hình khối, số lượng các mặt hình khối cho thấy khả năng tác dụng với vi khuẩn ở mức độ cao hay thấp Số lượng hạt nano có mặt càng nhiều thì khả năng ức chế vi khuẩn càng cao

2.4.3 Tình hình nghiên cứu nano bạc trên thế giới

Krishnaraj et al (2010), tiến hành tổng hợp các hạt nano bạc và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc đối với vi khuẩn Escherichia coli và Vibrio

cholerae Kết quả thu được từ kính hiển vi điện tử cho thấy kích thước của các

hạt nano bạc tổng hợp được từ 20-30nm có hiệu quả ức chế đối với các vi khuẩn

nhận là nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn Escherichia coli và

Yongqiang Zhang et al (2013), nghiên cứu tổng hợp các hạt nano bạc và

đánh giá tính chất kháng khuẩn của nano bạc khi phối hợp với dịch chiết từ lá

cây lô hội đối với 02 vi khuẩn thử nhiệm là Escherichia coli và Staphylococcus

nhiệt độ phòng trong 20 phút thì các hạt nano bạc cho kết quả kháng khuẩn rất

tốt đối với 2 vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus

Abdel-Megeed et al (2015), nghiên cứu tính chất diệt nấm của các hạt

nano bạc, nghiên cứu này đã chứng minh rằng AgNPs biosynthesized có thể được sử dụng làm thuốc diệt nấm đầy hứa hẹn đối với các loại nấm điều trị Kết

quả nghiên cứu cho thấy các hạt nano bạc có hiệu quả ức chế cao nhất đối với F

thấy một sự khác biệt đáng kể trong tỷ lệ ức chế ở mức 10 và 20 µg ml, trong khi

ở mức 40, 80 và 160 µg/ml, không có tác dụng ức chế

Theo nhận định của nhiều chuyên gia, công nghệ nano sẽ tạo nên một cuộc cách mạng đột phá trong nhiều ngành khoa học và đời sống, tạo tiền đề cho

một “thế giới nhỏ hơn và thông minh hơn” (Uldrich and Newberry, 2003)

2.4.4 Tình hình nghiên cứu nano bạc ở Việt Nam

Nghiên cứu về nano bạc có nhóm tác giả: Nguyễn Đức Nghĩa, Hoàng Mai

Hà công bố trên Tạp chí hóa học (2001) đã chế tạo được hạt nano bạc bằng phương pháp khử các ion bạc sử dụng tác nhân oleate trong polyme ổn định, thu

được các hạt bạc có kích thước từ 4 - 7 nm

Chế tạo nano bạc bằng phương pháp hóa ướt ứng dụng ức chế vi khuẩn

Nội (2008)

Nhóm nghiên cứu do Nguyễn Lâm Xuân Hương và cộng sự của Trường đại học Khoa học Tự Nhiên - Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh thực hiện đề tài tổng hợp hạt nano bạc sử dụng dịch chiết lá trà và ứng dụng diệt khuẩn Với nội dung, tổng hợp hạt nano bạc với tiền chất là bạc nitrat và tác nhân

khử là dịch chiết lá trà; sản phẩm tổng hợp được đem thử nghiệm khả năng diệt

khuẩn trên hai dòng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus Kết

quả thu được, tổng hợp thành công hạt nano bạc với chất khử là dịch chiết lá trà, kích thước hạt nano tổng hợp được nhỏ, hình cầu (5-7nm), tương đối đều; khả

năng kháng hai dòng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus của

nano bạc cho kết quả rất tốt trong thời gian tiếp xúc ngắn khoảng 3 phút (Nguyễn Lâm Xuân Hương và cs, 2014)

Nguyễn Thị Kim Cúc và cs (2014) tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của phức hệ nano chitosan – tinh dầu nghệ và nano bạc đối với hai chủng

vi khuẩn Bacillus cereus, Listonella damsela Kết quả của bước đầu cho thấy

phức hệ nano chitosan - tinh dầu nghệ và nano bạc, không những có hoạt tính ức

chế sinh trưởng của hai chủng vi khuẩn Bacillus cereus và Listonella damsela mà

còn có khả năng diệt khuẩn Việc kết hợp nano chitosan, tinh dầu nghệ và nano bạc với nhau làm tăng đáng kể khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp

Nhóm nghiên cứu về công nghệ nano bạc của Đại học Quốc gia Hà Nội đã

đi sâu nghiên cứu và ứng dụng các sản phẩm nano bạc trong lĩnh vực chăm sóc

và bảo vệ cây trồng, vệ sinh khử trùng, làm sạch môi trường và chuồng trại chăn nuôi, ao hồ, nuôi trồng thủy sản… Một số chế phẩm đã được đưa vào ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp: NaSil 200 (sát khuẩn gia dụng), N 200 (xử lý môi trường nuôi thủy sản) và một số sản phẩm nano bạc N200Pro trồng trọt đang được ứng dụng bảo vệ cây trồng, đặc biệt là với sản xuất rau, thực phẩm an toàn

và trên một số vườn thuốc ở một số nơi như cây ba kích, cây cỏ ngọt, long nhãn, long vải, hạt sen, giúp cho những sản phẩm dùng trong ngành đông y an toàn rất cao

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Các nội dung nghiên cứu được thực hiện tại Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Thời gian nghiên cứu từ tháng 01/2015 đến tháng 10/2015

3.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.3.1 Thực vật nghiên cứu

- Cây trầu không (Piper siriboa L.) thu hái ở huyện Yên Dũng, tỉnh Bắc Giang

- Cây tỏi (Allium sativum L.) thu hái ở huyện Yên Dũng, tỉnh Bắc Giang

- Cây Đơn đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.) thu hái tại Vườn thực

vật Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Cây huyền diệp (Polyalthia longifolia var pendula) thu hái tại Vườn

thực vật Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Cây lược vàng (Callisia fragrans L.) thu hái tại Vườn thực vật Khoa Thú

y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.3.2 Vi khuẩn nghiên cứu

- Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae chủng 01 và chủng 33 gây

bệnh bạc lá trên cây lúa do bộ môn CNSH ứng dụng cung cấp

3.3.3 Nano bạc

- Nano bạc có nồng độ gốc 100ppm, 90% các hạt nano bạc có kích thước

20 - 25 nm do bộ môn Sinh học khoa Công nghệ sinh học cung cấp

3.3.4 Giống lúa kí chủ

- Giống lúa IR24 là giống chuẩn nhiễm (giống không mang gen kháng) 3.3.5 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường

3.3.5.1 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị sử dụng trong quá trình thí nghiệm gồm có: tủ sấy, lò vi sóng;

tủ ấm nuôi vi khuẩn, tủ nuôi vi khuẩn lỏng lắc; cân phân tích; nồi hấp khử trùng

autoclave; box cấy vô trùng; máy đo pH, máy li tâm, máy đo quang phổ, máy cô

quay chân không

Một số dụng cụ cần thiết như: Bình ống nghiệm, pipet man, đĩa petri, ống nghiệm, eppendof, đèn cồn, cốc thủy tinh, giá ống nghiệm, bình định mức, ống nghiệm

3.3.5.2 Hóa chất - môi trường

+ Hóa chất

Các dung môi chiết: axit acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70%, ethanol 96%, nước cất, aceton nitril 50%, aceton nitril 100%

Dung môi pha chất tan : Dimethyl sulphoxit (DMSO)

Các hóa chất định tính một số thành phần hóa học trong dịch chiết

+ Môi trường

Môi trường sử dụng để phân lập và nuôi cấy các mẫu vi khuẩn là môi trường Wakimoto Tiến hành thí nghiệm, chúng tôi sử dụng môi trường LB (Luria Bertani) ở dạng lỏng và đặc trong quá trình tiến hành thí nghiệm

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất có trong cao dịch chiết 05

loại thực vật

- Đánh giá tác dụng diệt khuẩn in vitro của nano bạc và dịch chiết thực vật đối với 2 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa

- Đánh giá tác dụng của nano bạc và dịch chiết thực vật với cây lúa trong

điều kiện thí nghiệm in vivo

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp thu hái và xử lý thực vật

Mẫu lá cây thực vật được thu hái là những lá lành lặn, bánh tẻ, không bị sâu Lá tươi thu hái về rửa dưới vòi nước sạch (2-3 lần), phơi khô trong bóng râm đến khi ráo nước, sấy khô ở 40oC đến khối lượng không đổi, sau đó nghiền thành bột mịn Lá đơn đỏ có màu đỏ, không mùi Lá huyền diệp có màu vàng xanh, lá trầu không có màu xanh đen, mùi hắc, lược vàng có màu nâu Tỏi được dùng là tỏi ta, củ nhỏ, mùi hắc hơn so với tỏi lai, tỏi ta có chứa nhiều chất kháng sinh Củ tỏi được bóc bỏ vỏ, rửa sạch, để ráo nước, cho vào cối nghiền nhỏ

3.5.2 Phương pháp thu dịch chiết thực vật và đánh giá hiệu suất tách chiết

*Nguyên lý chiết suất

Các loại thực vật khác nhau được thu dịch chiết trong các loại dung môi bằng phương pháp ngâm lạnh

Ngâm lạnh là ngâm thực vật trong dung môi ở nhiệt độ phòng Các hợp chất thứ cấp có trong thực vật sẽ được khuyếch tán và hòa tan trong dung môi Trong quá trình ngâm có thể khuấy trộn để tăng hiệu suất chiết, dụng cụ cần đậy kín tránh bay hơi dung môi, thời gian ngâm lạnh thường kéo dài nhiều ngày

* Lựa chọn dung môi chiết xuất: Dung môi cần chọn có khả năng hòa tan

tối đa các chất có tác dụng điều trị và tối thiểu tạp chất trong điều trị

* Tiến hành chiết xuất:

Chúng tôi tiến hành ngâm chiết bằng cách cho 2g bột của năm loại thực vật vào 5 ống fancol (mỗi ống có chứa 20ml dung môi ethanol 70%), tiến hành ngâm chiết lạnh ở nhiệt độ phòng Mỗi ngày lắc đảo 3 lần, sau 72h đưa đi li tâm

để loại bỏ cặn, hút dịch chiết cho vào ống eppendof Dịch chiết thu được mang đi

cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi tới khi khối lượng không đổi đem cân lượng cao khô thu được để tính hiệu suất tách chiết (Mỗi thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần)

*Đánh giá hiệu suất chiết:

Hiệu suất chiết được tính theo công thức: h (%) = m c /m M x 100

Trong đó: h(%) là hiệu suất chiết

m c là khối lượng cặn khô (sau khi cô quay) tính theo gam

m M là khối lượng mẫu thực vật khô tính theo gam

3.5.3 Phương pháp định tính xác định một số nhóm hợp chất có trong dịch chiết thực vật

Phần lớn các dược liệu đều có các thành phần hoạt chất xác định Các hoạt chất này có thể cho các phản ứng màu đặc trưng, dựa vào đó dược liệu có thể được định tính và định lượng Đôi khi người ta lại dựa vào thành phần hóa học không phải là hoạt chất nhưng lại đặc trưng cho dược liệu đó để đánh giá

Vì vậy chúng tôi tiến hành định tính một số hợp chất bằng phương pháp hóa học để xác định sự có mặt của chúng trong dịch chiết thực vật thu được từ các loại dung môi khác nhau Đây là phương pháp định tính xác định đơn giản,

nhanh chóng, dễ dàng thực hiện ngay trong phòng thí nghiệm Các thuốc thử cũng

dễ kiếm, ít độc cho người thí nghiệm, cho kết quả nhanh, tương đối chính xác

3.5.3.1 Định tính saponin trong thực vật

Tính tạo bọt là tính chất đặc trưng của saponin Chúng tôi dựa vào hiện tượng tạo bọt để định tính sự có mặt của Saponin trong dịch chiết

- Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm lớn 5 giọt dịch chiết ở

mỗi loại, thêm 5ml nước Lắc mạnh trong 5 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận thực vật có chứa saponin

3.5.3.2 Định tính flavonoid

- Phản ứng với kiềm: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ khô rồi để

lên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết

được tăng lên Nhỏ một giọt khác làm chứng

giọt dung dịch FeCl3 5% Sẽ xuất hiện tủa xanh đen

3.5.3.3 Định tính tanin

FeCl3 5% sẽ thấy kết tủa xanh đen

- Tác dụng với dung dịch gelatin 1%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung

dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện tủa bông trắng

3.5.3.4 Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung

Lấy một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 -

3 giọt thuốc thử Mayer, nếu có alkaloid sẽ cho tủa màu từ trắng đến vàng

một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3

giọt thuốc thử Bouchardat, nếu có alkaloid sẽ cho tủa nâu đến đỏ nâu

3.5.3.5 Định tính carotenoid

Thêm vào dịch chiết vài giọt H2SO4 đậm đặc Nếu có carotenoid, dung

dịch có màu xanh dương

Tác dụng với chì acetat 10%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% sẽ

xuất hiện tủa bông

3.5.3.9 Định tính coumarin

Dựa vào độ tan khác nhau khi đóng và mở vòng lacton: cho vào ống nghiệm

mỗi ống 1 - 2 ml dịch chiết Ống thứ nhất cho thêm 0.5 ml NaOH 10%, đun cách thủy

cả 2 ống (ống có coumarin thường có màu vàng xuất hiện) Để nguội, thêm vào mỗi ống 4ml nước cất Nếu ống 1 đục hơn ống 2 nhưng sau đó acid hóa mà độ đục hoặc kết

tủa như ống 2 thì sơ bộ xác định có coumarin

3.5.4 Phương pháp pha loãng dịch chiết

Chuẩn bị 10 ống nghiệm vô trùng, cho vào mỗi ống 5 ml DMSO

Lấy 5 ml mẫu dịch chiết (100 mg/ml), đưa sang ống nghiệm thứ nhất làm đồng đều ta được độ pha loãng 2 lần (2-1)

Lấy 5ml dung dịch ở ống nghiệm 2-1 cho vào ống nghiệm thứ 2, ta được độ pha loãng 4 lần (2-2) Tiếp tục làm như vậy đối với các ống nghiệm tiếp theo ta được độ pha loãng tiếp theo: 2-3, 2-4…2-n

Lấy 100 µl dịch chiết được pha loãng ở các nồng độ khác nhau nhỏ lên các lỗ trên đĩa thạch đã được chang khuẩn để đánh giá tính kháng khuẩn của dịch chiết

Pha loãng theo sơ đồ sau:

Hình 3.1 Sơ đồ pha loãng dịch chiết

Sau khi tiến hành pha loãng dịch chiết thực vật nồng độ 100mg/ml, với hệ

số pha loãng 1/2 thành 10 nồng độ pha loãng khác nhau Kết quả pha loãng dịch chiết thực vật được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.1 Hệ số pha loãng dịch chiết và nồng độ dịch chiết tương ứng

chiết tương ứng

(mg/ml)

50 25 12,5 6,25 3,13 1,56 0,78 0,39 0,20 0,10

3.5.5 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường rắn và lỏng

Vi khuẩn được cấy vạch trong môi trường LB đặc, trên đĩa petri ủ 370C/24 giờ, chọn khuẩn lạc đơn điển hình Khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trong bình tam giác với môi trường LB lỏng, ủ ở 370C, với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 12 - 14h; thu dịch khuẩn (mật độ vi khuẩn phải đạt 108 tế bào/ml là đạt chuẩn)

3.5.6 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn

Các mẫu vi khuẩn được nuôi cấy vạch trên môi trường LB đặc ở nhiệt độ

300C-370C, sau 24 giờ để lấy khuẩn lạc đơn

Chọn khuẩn lạc đơn mang đi nuôi trên môi trường LB lỏng ở 300C - 370C, lắc

200 vòng/phút Sau 12-14 giờ mang dịch khuẩn nuôi đi xác định mật độ vi khuẩn

Mật độ vi khuẩn được xác định theo phương pháp đo quang phổ ở bước sóng λ=600 nm

Mật độ vi khuẩn được xác định theo công thức:

[Số tế bào/ml] = OD 600 x (Hệ số chuyển đổi) x (Hệ số pha loãng)

Trong đó: OD 600 là giá trị đo được ở bước sóng: λ = 600 nm

Hệ số chuyển đổi được mặc định là: 5 x 108

3.5.7 Phương pháp đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết

thực vật

Tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thực vật trên các vi