Chế tạo vật liệu nano vàng dạng đa nhánh, nano bạc dạng tam giác với chất bảo vệ là các polymer sinh học và khảo sát đặc tính kháng khuẩn

Tổng hợp nano Ag dạng phiến tam giác bằng phương pháp tạo mầm trung gian với hỗn hợp chất bảo vệ gelatin - chitosan .... Luận án tập trung nghiên cứu, cải thiện, phát triển phương pháp k

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG

TP HCM

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS Nguyễn Thị Phương Phong

vào hồi 09 giờ 00 phút, ngày 23 tháng 07 năm 2020

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, có sự hỗ trợ của

cô hướng dẫn Các kết quả nghiên cứu trong đề tài này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào trước đây Những phần sử dụng tài liệu trong luận án được nêu rõ trong phần tài liệu tham khảo

Tác giả

Võ Quốc Khương

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thầy hướng dẫn PGS TS Nguyễn Thị Phương Phong đã tận tình hướng dẫn, động viên và cho tôi những kiến thức quý báu để hoàn thành luận án này

Tôi xin gửi lời cám ơn đến Ban Giám Hiệu và Phòng Đào Tạo Sau Đại Học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-TP HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện trong quá trình đào tạo để nghiên cứu sinh hoàn thành luận án của mình

Tôi xin chân thành cám ơn Quý thầy cô trong Khoa Hóa, Bộ môn Hóa lý và phòng Hóa lý Ứng dụng trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-TP HCM đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án

Xin cám ơn các bạn đồng nghiệp của nhóm Hóa học Nano và phòng Hóa lý Ứng dụng đã hỗ trợ và giúp tôi trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm

Tôi xin gửi đến các Quý đơn vị lời cám ơn chân thành trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án

Viện Khoa học Vật liệu và Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam;

Viện Công nghệ Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG-TP HCM;

Phòng Thí nghiệm Phân tích Trung tâm – Khoa Hóa - Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-TP HCM;

Cuối cùng, tôi xin cám ơn tất cả thành viên trong gia đình đã giúp đỡ, động viên, chia sẻ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận án

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC CÁC BẢNG xi

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ xiv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Vật liệu nano vàng dạng đa nhánh và nano bạc dạng phiến 4

1.1.1 Nano vàng dạng đa nhánh 4

1.1.1.1 Giới thiệu 4

1.1.1.2 Tính chất quang của nano vàng đa nhánh 5

1.1.2 Nano bạc dạng phiến tam giác 6

1.1.2.1 Giới thiệu 6

1.1.2.2 Tính chất quang của nano bạc dạng phiến tam giác 7

1.2 Tổng hợp vật liệu nano vàng theo phương pháp xanh hóa với các chất bảo vệ polymer sinh học 10

1.2.1 Chất bảo vệ collagen 10

1.2.2 Chất bảo vệ chitosan 12

1.2.3 Chất bảo vệ gelatin 15

1.3 Tổng hợp vật liệu nano bạc theo phương pháp xanh hóa với các chất bảo vệ polymer sinh học 16

1.3.1 Phương pháp sử dụng polysaccharide 16

1.3.2 Phương pháp Tollen cải tiến 21

1.3.3 Phương pháp chiếu xạ 23

1.3.4 Phương pháp sinh học 25

1.4 Tình hình nghiên cứu trong nước 26

1.5 Tính mới của đề tài 31

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 33

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 33

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất 33

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 33

2.2 Các phương pháp thực nghiệm tổng hợp vật liệu nano vàng, bạc 34

2.2.1 Đánh giá tính chất của chất bảo vệ 34

2.2.2 Tổng hợp nano vàng với chất bảo vệ collagen 35

2.2.3 Tổng hợp nano vàng với chất bảo vệ gelatin 36

2.2.4 Tổng hợp nano vàng với chất bảo vệ chitosan 38

2.2.5 Tổng hợp nano Ag dạng phiến tam giác bằng phương pháp tạo mầm trung gian với hỗn hợp chất bảo vệ gelatin - chitosan 40

2.2.6 Tổng hợp nano bạc với saccharide bằng phương pháp khử một giai đoạn 43

2.3 Khảo sát độc tính của nano vàng dạng nhánh trên nguyên bào sợi 45

2.3.1 Quá trình nuôi cấy nguyên bào sợi 45

2.3.2 Phương pháp khảo sát độc tính tế bào SRB 45

2.4 Phương pháp kiểm tra khả năng kháng oxy hóa của nano vàng 46

2.4.1 Nguyên tắc 46

2.4.2 Phương pháp tiến hành 46

2.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc dạng phiến tam giác 47

2.6 Đánh giá đặc tính hóa lý của hệ nano vàng và bạc 48

2.6.1 Phương pháp UV-Vis 48

2.6.2 Phương pháp chụp ảnh TEM (Transmission Electron Microscopy) 48

2.6.3 Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) 48

2.6.4 Phương pháp chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét FE-SEM 49

2.6.5 Phương pháp FT-IR (Fourrier Transformation Infrared) 49

2.6.6 Phương pháp đo thế zeta 50

2.6.7 Phương pháp phân tích kích thước hạt (DLS) 50

2.6.8 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC 51

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

3.1 Đánh giá các tính chất của chất bảo vệ 52

3.1.1 Chất bảo vệ collagen 52

3.1.2 Chất bảo vệ gelatin 52

3.1.3 Chất bảo vệ chitosan 53

3.2 Tổng hợp nano vàng với chất bảo vệ collagen 54

3.2.1 Ảnh hưởng của HAuCl4 54

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 56

3.2.3 Ảnh hưởng của acid ascorbic 58

3.2.4 Ảnh hưởng của pH 62

3.2.5 Ảnh hưởng của collagen 65

3.2.6 Phổ FTIR của nano vàng với collagen 69

3.2.7 Giản đồ XRD của nano vàng với collagen 71

3.2.8 Cơ chế đề nghị cho quá trình tạo nano vàng dạng đa nhánh với collagen 72

3.3 Tổng hợp xanh hóa hạt nano vàng với chất bảo vệ gelatin 73

3.3.1 Ảnh hưởng của HAuCl4 73

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 76

3.3.3 Ảnh hưởng của acid ascorbic 78

3.3.4 Ảnh hưởng của gelatin 80

3.3.5 Ảnh hưởng của pH 83

3.3.6 Phổ FTIR của nano vàng với gelatin 87

3.3.7 Giản đồ XRD của nano vàng với gelatin 90

3.3.8 Cơ chế đề nghị cho quá trình phát triển hạt nano vàng với gelatin 91

3.4 Tổng hợp xanh hóa nano vàng sử dụng chất bảo vệ chitosan 94

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 94

3.4.2 Ảnh hưởng của chitosan 95

3.4.3 Ảnh hưởng của HAuCl4 97

3.4.4 Ảnh hưởng của pH 100

3.4.5 Ảnh hưởng của acid ascorbic 102

3.4.6 Giản đồ XRD của hệ nano vàng - chitosan 104

3.4.7 Cơ chế đề nghị cho quá trình tổng hợp nano vàng với chitosan 105

3.4.8 Phân bố kích thước hạt theo DLS và thế zeta của hệ nano vàng với các polymer sinh học 105

3.5 Tổng hợp nano bạc dạng phiến tam giác với hỗn hợp gelatin và chitosan 106

3.5.1 Quá trình tạo mầm 106

3.5.2 Ảnh hưởng của AgNO3 108

3.5.3 Ảnh hưởng của hỗn hợp gelatin-chitosan 111

3.5.4 Ảnh hưởng của lượng mầm 114

3.5.5 Ảnh hưởng của acid ascorbic 117

3.5.6 Ảnh hưởng của pH 119

3.5.7 Phổ FTIR của nano bạc với hỗn hợp gelatin và chitosan 122

3.5.8 Giản đồ XRD của nano bạc dạng phiến tam giác 124

3.5.9 Phân bố kích thước hạt theo DLS và thế zeta của hệ nano bạc với hỗn hợp gelatin - chitosan 124

3.5.10 Cơ chế đề nghị hình thành nano bạc dạng tam giác 126

3.6 Tổng hợp xanh hóa nano bạc với saccharide 129

3.6.1 Ảnh hưởng của saccharide 129

3.6.2 Ảnh hưởng của điều kiện pH 136

3.6.3 Giản đồ XRD nano bạc với các loại saccharide 141

3.6.4 Phổ FT-IR của nano bạc-collagen với các loại saccharide 142

3.6.5 Thế zeta của hệ nano bạc với các loại saccharide 145

3.7 Hoạt tính sinh học của dung dịch keo nano vàng, bạc 145

3.7.1 Khả năng tương thích sinh học của nano vàng dạng đa nhánh với tế bào nguyên bào sợi 145

3.7.2 Khả năng kháng oxy hóa của dung dịch nano vàng 146

3.7.3 Hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc phiến tam giác 147

3.7.4 Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc dạng phiến 149

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 152

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 154

TÀI LIỆU THAM KHẢO 156

PHỤ LỤC 175

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Eagle’s medium

acid

với cấu trúc xoắn ba

Fibril-associated collagens with interrupted triple helices

phát xạ trường

Field emmission scanning electron microscopy

biến đổi Fourier

Fourier transform infrared

chromatography

đổi tự nhiên từ da người

Keratinocyte cell line from human skin

(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethane sulfonic acid

qua độ phân giải cao

High-resolution transmission electron microscopy

bào với cấu trúc xoắn ba

Membrane associated collagen with interrupted triple helices

thiểu

Minimum bactercidal concentration

tâm xoắn ba

Multiple triple-helix domains and interruptions

resonance

Raman

Surface enhanced Raman spectroscopy

TSA Tryptone soya agar

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Dữ liệu thông số khảo sát của các mẫu nano Au-collagen 36

Bảng 2.2 Dữ liệu thông số khảo sát của các mẫu nano Au-gelatin 38

Bảng 2.3 Dữ liệu thông số khảo sát của các mẫu nano Au-chitosan 39

Bảng 2.4 Dữ liệu thông số khảo sát của các mẫu nano Ag-gelatin-chitosan 42

Bảng 2.5 Dữ liệu thông số khảo sát của các mẫu nano Ag-saccharide 44

Bảng 3.1 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của mẫu nano Au - collagen với thể tích HAuCl4 25 mM thay đổi từ 20 đến 90 μL 55

Bảng 3.2 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của mẫu nano Au – collagen được tổng hợp tại điều kiện nhiệt độ khác nhau thay đổi từ 20o đến 70oC 57

Bảng 3.3 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của mẫu nano Au - collagen với nồng độ acid ascorbic thay đổi từ 2,5 đến 15 mM 58

Bảng 3.4 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Au - collagen ở điều kiện pH từ 3 – 5 63

Bảng 3.5 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Au – collagen có nồng độ collagen thay đổi từ 0,01 đến 0,06 mM 66

Bảng 3.6 Dữ liệu phổ FT-IR của mẫu nano Au-collagen (80 μL HAuCl4 25 mM; 2,0 mL collagen 0,01 mM; 1,0 mL acid ascorbic nồng độ 5,0 mM; pH 4,0) 70

Bảng 3.7 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của mẫu nano Au - gelatin với thể tích HAuCl4 25 mM thay đổi từ 20 – 320 µL 74

Bảng 3.8 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của mẫu nano Au - gelatin với các nhiệt độ phản ứng khác nhau 77

Bảng 3.9 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu Au – gelatin với các tỉ lệ nHAuCl4:nAA khác nhau 79

Bảng 3.10 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Au - gelatin với nồng

độ gelatin thay đổi từ 0 đến 2,5 % (kl/tt) 81Bảng 3.11 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis các mẫu nano Au – gelatin tại những giá trị pH khác nhau thay đổi từ pH 3 đến pH 10 84Bảng 3.12 Dữ liệu phổ FT-IR của mẫu nano Au – gelatin (100 µL HAuCl4 25 mM; 1,0 mL gelatin 2,5 %; tỷ lệ mol nHAuCl4: nacid ascorbic 1: 6; tại pH 4 (kl/tt) 88Bảng 3.13 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Au - chitosan với nhiệt

độ khác nhau 95Bảng 3.14 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Au - chitosan với nồng

độ chitosan thay đổi từ 0,0075 đến 0,060 % (kl/tt) 96Bảng 3.15 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Au – chitosan với thể tích HAuCl4 nồng độ 10-3 M thay đổi 98Bảng 3.16 Đỉnh hấp thụ cực đại UV-Vis của các mẫu nano Au - chitosan với tỉ lệ mol nHAuCl4/nAA thay đổi từ 1:5 đến 11:5 103Bảng 3.17 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Ag-gelatin-chitosan với thể tích AgNO3 0,01 M thay đổi từ 50 đến 200 µL 110Bảng 3.18 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Ag-gelatin-chitosan với

tỉ lệ nồng độ gelatin-chitosan thay đổi 112Bảng 3.19 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Ag-gelatin-chitosan với thể tích mầm bạc thay đổi từ 0 đến 400 µL 115Bảng 3.20 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu Ag-gelatin-chitosan với thể tích acid ascorbic 0,1 M thay đổi từ 10 đến 70 µL 118Bảng 3.21 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Ag-gelatin-chitosan với điều kiện pH thay đổi từ 3 đến 9 120Bảng 3.22 Dữ liệu phổ FTIR của mẫu (a) chitosan nguyên chất; (b) gelatin nguyên chất và (c) nano Ag-gelatin-chitosan 123

Bảng 3.23 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Ag - collagen với thể tích dung dịch D-fructose (nồng độ 10,0 %; kl/tt) và D-glucose (nồng độ 10,0 %; kl/tt) thay đổi từ 10,0 đến 17,0 mL 131Bảng 3.24 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Ag-collagen với thể tích sucrose (nồng độ 10%, kl/tt) thay đổi từ 10 đến 17 mL 132Bảng 3.25 Đỉnh hấp thu cực đại UV-Vis của các mẫu nano Ag – collagen tại điều kiện pH thay đổi từ 3 đến 7 138Bảng 3.26 Dữ liệu phổ FT-IR của mẫu nano bạc được tổng hợp với các loại saccharide nồng độ 10,0 % (kl/tt) 144Bảng 3.27 Kết quả quá trình ức chế phát triển tế bào fibroblast khi ủ với các hạt nano vàng và nano vàng dạng đa nhánh 145Bảng 3.28 Tỉ lệ phần trăm bắt gốc tự do của dung dịch nano Au 147

DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Ảnh TEM hạt nano vàng dạng (a) cầu gai và (b) đa nhánh 4Hình 1.2 Phổ UV-Vis bước sóng hấp thu cực đại của (a) mầm nano bạc; (b), (c), và (d) nano vàng dạng đa nhánh 5Hình 1.3 Nano bạc với hình dạng phiến tam giác và các thông số hình dạng 6Hình 1.4 Sự phụ thuộc tính chất quang của nano bạc dạng phiến đối với hình dạng các đỉnh nhọn của tam giác 8Hình 1.5 Phổ UV-Vis-NIR của nano bạc dạng tam giác với chiều dài các cạnh khác nhau và màu sắc của dung dịch keo tổng hợp được 9Hình 1.6 Cơ chế đề nghị quá trình tạo nối ngang giữa các hạt nano vàng và phân tử collagen với tác nhân tạo nối ngang 11Hình 1.7 Quá trình hình thành liên kết giữa các hạt nano kim loại và phân tử collagen 11Hình 1.8 Hệ nano vàng - collagen sử dụng trong xác định nồng độ glucose và heparin 12Hình 1.9 Mô phỏng quá trình hình thành mạng lưới chất bảo vệ chitosan xung quanh hạt nano vàng 13Hình 1.10 Quá trình hình thành liên kết của ion Au3+ với các mạch chitosan quá trình khử tạo hạt nano vàng ở các pH khác nhau 14Hình 1.11 Quá trình thử nghiệm sinh học các hạt nano vàng@gelatin trên dòng tế bào Osteoblast 15Hình 1.12 Nano bạc được tổng hợp với (a) fructose, (b) mannose 17Hình 1.13 Ảnh HR-TEM của một số dạng nano bạc hình thành: (a) decahedron, (b)

và (c) dạng decahedron thông thường với các hướng phát triển khác (d) tetrahedron

và (e) dạng decahedron nối dài, khi tổng hợp các loại đường khác nhau 17

Hình 1.14 Ảnh TEM mô tả các cụm nano bạc được hình thành trong cấu trúc vật

nanocomposite bạc – tinh bột – glucose 19

Hình 1.15 Ảnh HR-TEM của cấu trúc nano Ag - chitosan core-shell ở các độ phóng đại khác nhau tương ứng (a) 10 nm, (b) 2nm và (c) 5 nm 19

Hình 1.16 Ảnh TEM nano Ag – tinh bột với chất khử acid ascorbic (a) cấu trúc phân nhánh (butterfly-shape) (b) nano hình thành trên mạch phân tử tinh bột 20

Hình 1.17 Nano bạc nằm trong cấu trúc tinh bột, thang đo 20 nm 21

Hình 1.18 Ảnh TEM các hạt nano bạc được tổng hợp xanh hóa (a) dạng lập phương; (b) dạng tam giác; (c) dạng dây và (d) dạng dây sắp xếp thẳng hàng 22

Hình 1.19 Quá trình tổng hợp nano bạc trong vật liệu nanocomposite với sợi nano cellulose và ứng dụng 23

Hình 1.20 Khả năng kháng tế bào ung thư Hela của nano Ag-glucose khi so sánh với mẫu chuẩn, ion Ag+ và glucose 24

Hình 1.21 Nano bạc được tổng hợp xanh với maltose trên nền chất bảo vệ gelatin (đường kính trung bình hạt khoảng 4,09 ± 1,83 nm) 25

Hình 1.22 Cơ chế chung tổng hợp nano bạc từ dịch chiết sinh học 26

Hình 1.23 Quá trình tổng hợp hệ nano bạc-gelatin-curcumin 27

Hình 1.24 Ảnh SEM các cành lá nano bạc được lắng đọng trên bề mặt Si 28

Hình 1.25 Ảnh SEM hoa nano bạc với hình dạng khác nhau được lắng đọng hóa học lên bề mặt Si 28

Hình 1.26 Nano bạc trong gel chitosan/PVA và thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp MTT 29

Hình 1.27 Quá trình hình thành hạt nano core Ag – shell DHPAC qua cơ chế bám dính 30

Hình 2.1 Qui trình tổng hợp nano Au với chất bảo vệ collagen 35

Hình 2.2 Qui trình tổng hợp nano Au với chất bảo vệ gelatin 37

Hình 2.3 Qui trình tổng hợp nano vàng với chất bảo vệ chitosan 39

Hình 2.4 Giai đoạn tổng hợp mầm nano Ag 40

Hình 2.5 Giai đoạn phát triển mầm nano bạc tạo phiến tam giác 42

Hình 2.6 Qui trình tổng hợp nano bạc với các loại saccharide 44

Hình 3.1 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Au – collagen với thể tích HAuCl4 25 mM thay đổi từ 20 đến 90 μL 55

Hình 3.2 Ảnh TEM của các mẫu nano Au-collagen với thể tích HAuCl4 25 mM tương ứng: (a) 80 μL (mẫu Au-80) và (b) 120 μL (Au-120) 56

Hình 3.3 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Au – collagen được tổng hợp tại điều kiện nhiệt độ khác nhau thay đổi từ 20o đến 70oC 57

Hình 3.4 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Au – collagen với nồng độ acid ascorbic thay đổi từ 2,5 đến 15 mM 58

Hình 3.5 Ảnh TEM của mẫu A2 (nồng độ acid ascorbic 5 mM) (a) thang đo 100 nm (b) một hạt nano Au-collagen thang đo 20 nm và (c) giản đồ phân bố kích thước hạt của mẫu A2 60

Hình 3.6 Quá trình biến đổi của phân tử collagen trong môi trường nước 61

Hình 3.7 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Au - collagen tại điều kiện pH khác nhau, thay đổi từ 3 đến 5 62

Hình 3.8 Ảnh TEM của hạt nano vàng được tổng hợp với chất bảo vệ collagen tại điều kiện (a) pH 3; (b) pH 3,5; (c) pH 4; (d) pH 4,5 và (e) pH 5 64

Hình 3.9 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Au - collagen có nồng độ collagen thay đổi từ 0,01 đến 0,06 mM 65

Hình 3.10 Ảnh TEM của mẫu nano vàng (C1) tổng hợp với collagen nồng độ 0,01 mM kích thước thang đo (a) 100nm, (b) 50nm, và (c) giản đồ phân bố kích thước hạt nano vàng tương ứng 67

Hình 3.11 Ảnh TEM của các mẫu C2-C5 với nồng độ (a) 0,02; (b) 0,03; (c) 0,04; (d) và 0,05 mM (thang đo 50 nm) 68Hình 3.12 Phổ FTIR của (a) mẫu nano Au-collagen (80 μL HAuCl4 25 mM; 2,0

mL collagen 0,01 mM; 1,0 mL acid ascorbic nồng độ 5,0 mM; pH 4,0) và (b) mẫu collagen nguyên chất 69Hình 3.13 Giản đồ XRD của mẫu nano vàng – collagen dạng đa nhánh (80 μL HAuCl4 25 mM; 2,0 mL collagen 0,01 mM; 1,0 mL acid ascorbic nồng độ 5mM;

pH 4,0) 71Hình 3.14 Cơ chế đề nghị quá trình hình thành nano vàng đa nhánh với chất bảo vệ collagen 72Hình 3.15 Phổ UV-Vis của mẫu nano vàng – gelatin với thể tích HAuCl4 25 mM thay đổi từ 20 đến 320 µL 73Hình 3.16 Ảnh TEM các hạt nano Au của mẫu Au-4 (100 μL HAuCl4 25 mM) (a) thang đo 50 nm (b) thang đo 20 (nm) và (c) giản đồ phân bố kích thước hạt 75Hình 3.17 Ảnh TEM của mẫu Au5 (160 μl HAuCl4 25 mM) ở (a) thang đo 100 nm; (b) thang đo 20 nm; và (c) giản đồ phân bố kích thước hạt tương ứng 76Hình 3.18 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Au – gelatin tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau thay đổi từ 40 đến 80oC 77Hình 3.19 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Au – gelatin với các tỉ lệ nHAuCl4:nAA

khác nhau thay đổi từ 1:1 đến 1:20 79Hình 3.20 Ảnh TEM của mẫu nHAuCl4 : nacid ascorbic (1:6) (a) thang đo 20 nm; (b) thang đo 50 nm và; (c) giản đồ phân bố kích thước hạt tương ứng 80Hình 3.21 Phổ UV – Vis của các mẫu nano Au - gelatin với nồng độ gelatin thay đổi từ 0 đến 2,5 % (kl/tt) 81Hình 3.22 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Au - gelatin tại những giá trị pH khác nhau thay đổi từ pH 3 đến pH 10 83

Hình 3.23 Ảnh TEM của mẫu nano vàng-gelatin ở pH 4,0 (a) thang đo 200 nm; (b) thang đo 100 nm và (c) thang đo 50 nm 86Hình 3.24 Ảnh TEM của mẫu nano vàng - gelatin ở điều kiện pH 3; (a), (b) thang

đo 200 nm và (c) thang đo 100 nm 86Hình 3.25 Ảnh TEM nano vàng-gelatin ở điều kiện pH 8 (a) thang đo 50 nm; (b) thang đo 20 nm và giản đồ phân bố kích thước hạt 87Hình 3.26 Phổ FTIR của mẫu nano Au-gelatin (a) (thể tích HAuCl4 25 mM là 100

µL, gelatin nồng độ 2,5 % (kl/tt) ; tỷ lệ mol nHAuCl4: nacid ascorbic 1: 6; tại pH 4); và (b) gelatin nguyên chất 88Hình 3.27 Các nhóm chức trên phân tử gelatin tương tác với các hạt nano vàng 90Hình 3.28 Giản đồ XRD của mẫu nano vàng với gelatin (thể tích HAuCl4 25 mM là

100 µL, gelatin nồng độ 2,5 % (kl/tt); 150 µL chất khử acid ascorbic 0,1 M tại điều kiện pH 4) 90Hình 3.29 Cơ chế đề nghị quá trình phát triển nano vàng dạng đa nhánh với chất bảo vệ gelatin 93Hình 3.30 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Au - chitosan với nhiệt độ thay đổi từ 30-

90oC 94Hình 3.31 Phổ UV-Vis các mẫu nano Au - chitosan với nồng độ chitosan thay đổi

từ 0,0075 đến 0,060 % (kl/tt) 95Hình 3.32 Ảnh TEM của (a) nồng độ chitosan 0,060 %; (b) nồng độ chitosan 0,045% và giản đồ phân bố kích thước hạt của mẫu sử dụng 4,0 mL dung dịch chitosan 0,045% (kl/tt) 96Hình 3.33 Phổ hấp thu UV-Vis của các mẫu nano Au – chitosan với thể tích dung dịch HAuCl4 nồng độ 10-3 M thay đổi từ 1,0 đến 6,0 mL 97

Hình 3.34 Ảnh TEM của mẫu nano vàng-chitosan CA7, nồng độ chitosan 0,045 % (kl/tt) HAuCl4 10-3 M (5,0 mL): (a) thang đo 20 nm, (b) thang đo 50 nm; và (c) giản

đồ phân bố kích thước hạt 99Hình 3.35 (a) Ảnh TEM của mẫu nano vàng - chitosan CA8, nồng độ chitosan 0,045% : HAuCl4 10-3 M (6,0 mL); và (b) giản đồ phân bố kích thước của hạt nano 99Hình 3.36 Ảnh TEM của hạt nano vàng tại điều kiện pH 6 (a) thang đo 200 nm; (b) thang đo 20 nm (c) thang đo 100 nm; và (d) giản đồ phân bố kích thước hạt tương ứng 100Hình 3.37 (a) Ảnh TEM của hạt nano vàng tại điều kiện pH 4 (thang đo 200 nm) và (b) giản đồ phân bố kích thước hạt tương ứng 100Hình 3.38 Mô hình đề nghị của nhóm amin và hydroxyl (1) tạo liên kết đơn (2) tạo vòng 5 cạnh với ion AuCl4- 101Hình 3.39 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Au - chitosan với tỉ lệ mol nHAuCl4/nAA từ 1: 5 đến 11:5 102Hình 3.40 Ảnh TEM của mẫu nano Au - chitosan (a) tỉ lệ mol nHAuCl4/nacid ascorbic

10:5 (thang đo 200 nm); (b) tỉ lệ 11:5 (thang đo 200 nm) 103Hình 3.41 Ảnh TEM mẫu nano Au - chitosan có tỉ lệ mol nHAuCl4/nacid ascorbic 10:5 (thang đo 50 nm) và (b) giản đồ phân bố kích thước hạt nano vàng tương ứng 104Hình 3.42 Giản đồ XRD của mẫu nano vàng-chitosan (6,0 mL HAuCl4 10-3 M, nồng độ chất bảo vệ chitosan 0,045%; tỉ lệ nHAuCl4: nacid ascorbic 10:5; tại pH 6) 104Hình 3.43 Phổ hấp thu UV-Vis của mẫu mầm nano bạc (20 mL AgNO3 0,3 mM;

20 mL TSC nồng độ 0,5 mM và 60 μL NaBH4 0,1 M) 107Hình 3.44 Ảnh TEM mầm nano Ag (20 mL AgNO3 0,3 mM; 20 mL TSC nồng độ 0,5 mM và 60 μL NaBH4 0,1 M) (a) thang đo 200 nm; (b) thang đo 20 nm; và (c) giản đồ phân bố kích thước hạt tương ứng 107

Hình 3.45 Màu sắc của các mẫu nano bạc với thể tích AgNO3 0,01 M thay đổi khác nhau 108Hình 3.46 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Ag-gelatin-chitosan với thể tích AgNO3

nồng độ 0,01 M thay đổi từ 50 đến 200 µL 109Hình 3.47 Ảnh TEM của mẫu (a) A-100 (thang đo 500 nm); (b) A-175 (thang đo

500 nm); và (c) A-200 (thang đo 200 nm) 111Hình 3.48 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Ag-gelatin-chitosan với tỉ lệ nồng độ gelatin-chitosan khác nhau 112Hình 3.49 Ảnh TEM các mẫu nano Ag- gelatin-chitosan (a) dạng nano hình đĩa (disk-liked) (thang đo 50 nm); (b) dạng phiến lục giác (tỉ lệ 30%), phiến tam giác (50%) (thang đo 50 nm); và (c) dạng phiến tam giác (70%) (thang đo 100 nm) 113Hình 3.50 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Ag-gelatin-chitosan với thể tích mầm bạc thay đổi từ 0 đến 400 µL 115Hình 3.51 Ảnh TEM của các mẫu nano Ag-gelatin-chitosan với thể tích mầm (a) 0 μL; (b) 200 μL (thang đo 100 nm) và (c) 400 μL (thang đo 200 nm) 116Hình 3.52 Ảnh TEM sự phát triển mầm nano bạc dạng (a) phiến tam giác cụt (thang đo 50 nm); và (b) phiến lục giác (thang đo 20 nm) 117Hình 3.53 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Ag-gelatin-chitosan với thể tích acid ascorbic nồng độ 0,1 M thay đổi từ 10 đến 70 µL 118Hình 3.54 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Ag-gelatin-chitosan với pH thay đổi từ

pH 3,0 đến pH 9,0 120Hình 3.55 Ảnh TEM các mẫu nano Ag-gelatin-chitosan tại (a) pH 6,0 (thang đo

200 nm) (b) pH 8,0 (thang đo 100 nm) và (c) pH 9,0 (thang đo 200 nm) 121Hình 3.56 Phổ FTIR của mẫu (a) chitosan nguyên chất; (b) gelatin nguyên chất và (c) nano Ag-gelatin-chitosan 122

Hình 3.57 Giản đồ XRD của mẫu nano Ag-gelatin-chitosan (gelatin 0,2 % – chitosan 0,06 % (kl/tt); thể tích mầm 200 µL; 40 µL acid ascorbic 0,1 M; 200 µL AgNO3 0,01 M tại pH 6) 124Hình 3.58 Kết quả DLS của nano bạc dạng phiến tam giác tổng hợp với hỗn hợp gelatin (0,2 %; kl/tt) – chitosan (0,06%; kl/tt) tại (a) pH 4,0;(b) pH 6,0 và (c) pH 8,0 125Hình 3.59 Mô hình đề nghị sự phát triển tinh thể đối với bề mặt đôi (twinned - plane), mặt loại A và loại B sắp xếp luân phiên 127Hình 3.60 Cơ chế đề nghị sự hình thành nano bạc dạng phiến tam giác với hỗn hợp chất bảo vệ gelatin-chitosan 128Hình 3.61 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Ag-collagen với thể tích của (a) D-fructose 10 % (kl/tt) và (b) D-glucose 10 % (kl/tt) thay đổi từ 10 đến 17 mL 130Hình 3.62 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Ag-collagen với thể tích sucrose 10,0 % (kl/tt) thay đổi từ 10,0 đến 17,0 mL 132Hình 3.63 Ảnh TEM của mẫu nano Ag-collagen được tổng hợp với 13,0 mL D-fructose (10,0 %; kl/tt) (a) thang đo 50 nm; (b) thang đo 20 nm và (c) giản đồ phân

bố kích thước hạt tương ứng 134Hình 3.64 Ảnh TEM của mẫu nano Ag-collagen được tổng hợp với 15,0 mL D-glucose (10,0 %; kl/tt) (a) thang đo 50 nm; (b) thang đo 20 nm và (c) giản đồ phân

bố kích thước hạt tương ứng 134Hình 3.65 Ảnh TEM của mẫu nano Ag-collagen được tổng hợp với 17,0 mL sucrose (10,0 %; kl/tt) (a) thang đo 50 nm; (b) thang đo 100 nm và (c) giản đồ phân

bố kích thước hạt tương ứng 134Hình 3.66 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Ag – collagen được tổng hợp với (a) D-fructose nồng độ 10,0 % (kl/tt) và (b) D-glucose nồng độ 10,0 % (kl/tt) ở điều kiện

pH thay đổi từ 3 đến 7 137

Hình 3.67 Phổ UV-Vis của các mẫu nano Ag-collagen được tổng hợp với sucrose nồng độ 10% (kl/tt) ở điều kiện pH thay đổi từ 3 đến 7 138Hình 3.68 Ảnh TEM các mẫu nano Ag-collagen được tổng hợp với (a) D-fructose (10 %, kl/tt) ở pH 4,0; (b) giản đồ phân bố kích thước hạt mẫu pH-Fruc-4; (c) D-glucose (10 %, kl/tt) ở pH 7,0 (thang đo 100 nm) và (d) giản đồ phân bố kích thước hạt mẫu pH-Gluc-7 139Hình 3.69 Ảnh TEM các mẫu nano Ag-collagen được tổng hợp với sucrose (10 %, kl/tt) ở pH 4,0 (thang đo 50 nm) 140Hình 3.70 Giản đồ nhiễu xạ tia X của các mẫu nano Ag-collagen được tổng hợp với (a) fructose nồng độ 10,0 % (kl/tt) tại pH 4; (b) sucrose nồng độ 10,0 % (kl/tt) tại pH 4 và (c) glucose nồng độ 10,0 % (kl/tt) tại pH 7 141Hình 3.71 Phổ FT-IR của các mẫu nano Ag-collagen được tổng hợp với (a) D-fructose 10,0 % (kl/tt) và (b) D-glucose 10,0 % (kl/tt) 143Hình 3.72 Phổ FT-IR của mẫu nano Ag-collagen được tổng hợp với (a) sucrose 10,0 % (kl/tt) 144Hình 3.73 Đồ thị khả năng sống của tế bào khi xử lý với dung dịch keo nano vàng

và nano vàng gelatin (dạng đa nhánh) sau 48 giờ ủ 146Hình 3.74 Đường kính ức chế của các mẫu nano bạc với các chủng vi khuẩn 147Hình 3.75 Đồ thị ức chế phát triển của nano bạc với các loại vi khuẩn S aureus, E coli, P aeruginosa, and V cholera với các nồng độ nano bạc dạng phiến khác nhau (từ 2 đến 12 μg/mL) 148

MỞ ĐẦU Hiện nay, vật liệu nano vàng, bạc với nhiều hình dạng khác nhau đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như: y sinh học [28], xúc tác [32][115], đánh dấu tế bào [34], cảm biến sinh học [137][139] và dẫn truyền thuốc [136] Trong đó, nano vàng dạng đa nhánh, dendrite hay nano bạc dạng phiến tam giác thu hút được rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học Với cấu trúc hình thái và tính chất quang-điện đặc trưng, các vật liệu này được ưu tiên phát triển nhằm tăng hiệu quả ứng dụng trong tán xạ bề mặt Raman (SERS) [131], gắn kết phân tử sinh học [132] hay kháng khuẩn [79]

Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới gần đây tập trung vào chế tạo có kiểm soát hình dạng và kích thước vật liệu nano vàng, bạc [80] bằng các phương pháp tổng hợp khác nhau [2][36][149] Tuy nhiên, quá trình tổng hợp có kiểm soát thường được thực hiện với các chất hoạt động bề mặt hay chất định hướng không thân thiện với môi trường, một số có khả năng gây độc cho người sử dụng, dẫn đến hạn chế khả năng ứng dụng của vật liệu nano vàng, bạc trong lĩnh vực y sinh Do

đó, quá trình chế tạo vật liệu nano cần phải được thực hiện với các tác chất thân thiện với môi trường [67] và sản phẩm tạo thành tương thích với môi trường sinh học [52][117]

Việc đồng thời đạt được hiệu quả sử dụng và giảm thiểu sự ảnh hưởng đến

hệ thống sinh học của vật liệu nano đang trở thành một trong những định hướng quan trọng trong phát triển các phương pháp tổng hợp mới Vì vậy, đề tài “Chế tạo vật liệu nano vàng dạng đa nhánh, nano bạc dạng tam giác với chất bảo vệ là các polymer sinh học và khảo sát đặc tính kháng khuẩn” là thực sự cần thiết

Các polymer tự nhiên như collagen, gelatin, chitosan được biết đến với vai trò là chất bảo vệ trong chế tạo vật liệu nano vàng, bạc [50][52][72], do sở hữu những tính chất đặc trưng như: có khả năng ổn định trong nhiều thử nghiệm sinh học [73][88], ít tạo ra chất trung gian gây độc [97] và làm tăng độ tương thích của vật liệu nano trong y sinh [111][123] Ngoài ra, với đặc tính thay đổi cấu trúc phân

tử tùy theo điều kiện môi trường phản ứng [119], các polymer sinh học này có thể được sử dụng như những tác nhân định hướng mới trong tổng hợp có kiểm soát hình dạng và kích thước của hạt nano vàng, bạc

Trong nghiên cứu này, với mục tiêu chế tạo vật liệu nano vàng, bạc có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau sử dụng các chất bảo vệ polymer sinh học Luận

án tập trung nghiên cứu, cải thiện, phát triển phương pháp khử một giai đoạn, phương pháp khử qua mầm trung gian nhằm tổng hợp hạt nano dạng cầu, đa nhánh, dendrite và phiến tam giác, cụ thể bao gồm:

- Tổng hợp có kiểm soát nano vàng dạng đa nhánh bằng phương pháp khử một giai đoạn, đồng thời đề nghị cơ chế phát triển hạt với chất bảo vệ collagen

- Tổng hợp có kiểm soát nano vàng dạng cầu, đa nhánh và dendrite với chất bảo vệ gelatin bằng phương pháp khử một giai đoạn Đề nghị cơ chế chuyển đổi các hình dạng của hạt nano tạo thành

- Tổng hợp có kiểm soát nano vàng dạng giả cầu, đa nhánh với chất bảo vệ chitosan bằng phương pháp khử một giai đoạn Đề nghị cơ chế phát triển hạt dựa trên kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố phản ứng

- Tổng hợp có kiểm soát nano bạc dạng đĩa, phiến lục giác và phiến tam giác với hỗn hợp chất bảo vệ gelatin-chitosan bằng phương pháp tạo mầm trung gian Đề nghị cơ chế phát triển của phiến nano bạc và khả năng định hướng phát triển hạt của hỗn hợp chất bảo vệ gelatin-chitosan

- Tổng hợp có kiểm soát kích thước nano bạc dạng cầu với các loại saccharide trên nền collagen bằng phương pháp khử một giai đoạn

- Khảo sát khả năng tương thích sinh học của vật liệu nano vàng trên dòng tế bào nguyên bào sợi (fibroblast cell) và hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc

Điểm mới của luận án:

Luận án nghiên cứu, khảo sát chi tiết và có hệ thống các yếu tố phản ứng ảnh hưởng đến sự hình thành những hình thái đặc trưng của vật liệu nano vàng, bạc với chất bảo vệ polymer sinh học, lần đầu tiên bao gồm: (i) tổng hợp nano vàng dạng dendrite bằng phương pháp một giai đoạn với chất bảo vệ gelatin ở điều kiện nhiệt

độ phòng, nghiên cứu sự chuyển đổi hình thái khi thay đổi pH môi trường; (ii) sử dụng collagen với vai trò là tác nhân định hướng kiểm soát sự phát triển nano vàng dạng đa nhánh trực tiếp bằng phương pháp khử một giai đoạn; (iii) sử dụng hỗn hợp hai polymer chitosan-gelatin trong tổng hợp nano bạc dạng phiến tam giác Chiều dài cạnh, độ nhọn đỉnh và hình dạng phiến được kiểm soát dựa trên quá trình thay đổi các yếu tố phản ứng (iv) Cải thiện hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc trên chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh khi chế tạo dạng phiến tam giác với khả năng phóng thích ion Ag+ ở các đỉnh của phiến tốt hơn so với dạng hình cầu

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Luận án tạo tiền đề cho sự phát triển định hướng nghiên cứu mới, cải thiện những phương pháp tổng hợp có kiểm soát nano vàng, bạc trước đây; thay thế các chất hoạt động bề mặt bằng polymer sinh học Kết quả của luận án về ý nghĩa khoa học làm sáng tỏ sự liên quan giữa vai trò của chất định hướng polymer sinh học và kiểm soát hình dạng, kích thước của nano vàng, bạc qua các phương pháp phân tích hóa lý như: quang phổ hấp thu tử ngoại khả kiến (UV-Vis), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), phổ hấp thu hồng ngoại (FT-IR), thế zeta, động học tán xạ ánh sáng (DLS) và giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD)…

Kết quả luận án về khả năng tương thích sinh học của vật liệu nano vàng đa nhánh, dendrite trên tế bào fibroblast và hoạt tính kháng khuẩn cao của nano bạc dạng phiến tam giác tạo cơ sở cho các thử nghiệm tiếp theo trên hệ thống sinh học

có tiềm năng ứng dụng trong y sinh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vật liệu nano vàng dạng đa nhánh và nano bạc dạng phiến

1.1.1 Nano vàng dạng đa nhánh

1.1.1.1 Giới thiệu

Các vật liệu nano vàng dạng đa nhánh đang thu hút rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây do tính chất cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) đặc trưng Tuy nhiên, cấu trúc đa nhánh của nano vàng thường khó tổng hợp và khả năng thu hồi thấp [80] Đối với nano vàng dạng đa nhánh, đặc biệt tại vị trí đầu nhọn và góc cạnh, là nơi tương tác với ánh sáng nhiều hơn dẫn đến làm thay đổi tính chất quang tại các vị trí này [23][64] Các đỉnh nhọn cũng cho thấy khả năng gắn kết sinh học tốt hơn, mở ra nhiều ứng dụng đầy tiềm năng trong các vật liệu y sinh [27] với khả năng tương thích sinh học cao [67]

Vào năm 2008, Lehui Lu cùng cộng sự đã tổng hợp hạt nano vàng dạng cầu gai (Hình 1.1) có độ đơn phân tán cao sử dụng tác chất thân thiện môi trường [67] Phương pháp phát triển mầm là một quy trình thông dụng gồm nhiều bước để tổng hợp nano vàng dạng đa nhánh từ những hạt mầm có kích thước nhỏ được phát triển bởi nhóm nghiên cứu của Sihai Chen và cộng sự [124] Trong phương pháp này, tác giả đã sử dụng chất hoạt động bề mặt là cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) Các hạt nano vàng tạo thành có nhiều cấu trúc: hai nhánh (bipod), ba nhánh (tripod), bốn nhánh (tetrapod) và năm nhánh (pentapod) Kết quả chế tạo cũng cho thấy những tinh thể nano có nhánh được ổn định trong thời gian dài [124]

Hình 1.1 Ảnh TEM hạt nano vàng dạng (a) cầu gai và (b) đa nhánh [67][124]

1.1.1.2 Tính chất quang của nano vàng đa nhánh

Hiện tượng plasmon bề mặt là sự dao động của điện tử tự do trên bề mặt của hạt nano khi có sự kích thích của ánh sáng tới Tần số dao động chịu ảnh hưởng bởi

4 yếu tố: mật độ của electron, khối lượng hiệu dụng của electron, kích thước và hình dạng của hạt nano [64] Tập hợp các dao động của electron được gọi là cộng hưởng plasmon lưỡng cực (dipole plasmon resonances) của hạt nano Trạng thái cao hơn của kích thích plasmon như cộng hưởng tứ cực xuất hiện khi một nửa đám mây electron di chuyển song song đến vùng cộng hưởng và một nửa còn lại dịch chuyển theo chiều đối song Tính chất quang phụ thuộc rất nhiều vào kích thước và hình dạng của hạt nano vàng [64] Hạt nano vàng dạng đa nhánh, cầu gai, và hình sao có cực đại hấp thu trong khoảng từ 600-700 nm [80][64], tùy theo kích thước và độ dài của nhánh tạo thành, số lượng các nhánh hình thành trên bề mặt hạt [36][23][67]

Hình 1.2 Phổ UV-Vis bước sóng hấp thu cực đại của (a) mầm nano bạc; (b), (c), và

(d) nano vàng dạng đa nhánh [67]

Vị trí đỉnh cực đại hấp thu nằm trong khoảng bước sóng 650-700 nm (Hình 1.2) đặc trưng cho cộng hưởng plasmon lưỡng cực trên bề mặt (in-plane dipole resonance) xuất hiện nhiều ở các nhánh, đỉnh và vị trí đỉnh hấp thu cực đại tại 540

nm đặc trưng cho cộng hưởng plasmon tứ cực ngoài bề mặt (out-of-plane quarupole resonance) tập trung trên cấu trúc lõi ở hạt nano dạng đa nhánh [36] Phổ UV-Vis của vật liệu nano vàng bất đẳng hướng dạng dendrite thường thể hiện hai đỉnh hấp

thu cộng hưởng plasmon bề mặt tại chiều dài và chiều ngang của nhánh Cộng hưởng plasmon lưỡng cực trên bề mặt dọc theo chiều dài cho bước sóng hấp thu cực đại khoảng 680-695 nm, các tính toán lý thuyết cho rằng cộng hưởng plasmon lưỡng cực tại khoảng bước sóng này quyết định tính chất quang của nano vàng dạng

đa nhánh [36] Ngoài ra, độ dày của lớp bảo vệ cũng ảnh hưởng đến sự chuyển dịch bước sóng của đỉnh cực đại hấp thu của nano vàng dạng đa nhánh [64][67]

1.1.2 Nano bạc dạng phiến tam giác

Hình 1.3 Nano bạc với hình dạng phiến tam giác và các thông số hình dạng [85]

Độ dài cạnh ký hiệu (l) và độ dày của phiến ký hiệu (t), trong cấu trúc nano dạng phiến có ba đỉnh nhọn (tip), ba đỉnh này ảnh hưởng rất nhiều đến tính chất quang và điện của hạt nano bạc (Hình 1.3) Tuy nhiên trong thực tế quá trình tổng hợp, độ nhọn hình thành ở các phiến nano bạc dạng tam giác này hoàn toàn khác nhau, có thể bo tròn một phần Khi quá trình bo tròn đỉnh xảy ra quá nhiều sẽ có sự chuyển hình dạng từ nano bạc tam giác dạng phiến chuyển thành dạng đĩa (nanodisk), dạng tam giác cụt (truncate) hoặc dạng phiến sáu cạnh Những dạng này

thường hình thành với các tỉ lệ khác nhau và dạng phiến tam giác thường không chiếm tỉ lệ tuyệt đối trong dung dịch keo [85]

Trong một số trường hợp cụ thể, cấu trúc không gian của nano bạc dạng phiến có thể được kiểm soát ngay trong môi trường phản ứng bằng cách thay đổi các thông số phản ứng như ion kim loại và tỉ lệ chất khử [55], nồng độ chất hoạt động bề mặt, pH, quá trình chiếu xạ [85], nồng độ mầm tinh thể [74] Thông số tỉ lệ chiều dài của cạnh và độ dày của phiến tam giác (l/t) có thể được sử dụng để định lượng mức độ bất đẳng hướng, ví dụ trong trường hợp các hạt nano hình thành ở dạng giả cầu (pseudosphere) thì tỉ lệ này gần bằng 1 vì hình dạng gần tròn đều hết

về mọi hướng, trong trường hợp đối với các hạt nano dạng phiến tam giác thì thông

số tỉ lệ này có giá trị từ 5 đến gần 40

Sự kết tinh của các phiến tam giác nano bạc trong dung dịch keo tạo đơn tinh thể với cấu trúc lập phương tâm diện (fcc) Sự kết tinh trong dung dịch keo khác với trong phương pháp quang khắc (lithographic) hay phương pháp điện hóa, thường tồn tại ở cấu trúc đa tinh thể Các mặt của phiến tam giác hình thành trong dung dịch keo thông thường là mặt {111}[24] [84] Các cạnh của phiến tam giác thường hình thành bởi các bề mặt {110}, {111} hay {100} [83], và các kết quả nghiên cứu với kỹ thuật HR-TEM cho rằng nano tam giác dạng phiến gồm bề mặt đôi (twin) được kết hợp từ hai bề mặt {111} đóng vai trò quan trọng trong cơ chế phát triển phiến [85] [74]

1.1.2.2 Tính chất quang của nano bạc dạng phiến tam giác

Cộng hưởng plasmon bề mặt được hình thành bởi dao động kết hợp của electron dẫn trên bề mặt hạt nano khi chúng tương tác với dao động điện trường của ánh sáng tới Cường độ của dao động này không chỉ phụ thuộc vào mật độ và khối lượng hiệu quả của electron mà còn phụ thuộc vào kích thước và hình dạng của phiến nano tam giác (Hình 1.4) [64]

Hình 1.4 Sự phụ thuộc tính chất quang của nano bạc dạng phiến đối với hình dạng

các đỉnh nhọn của tam giác [64]

Các phiến nano tam giác đủ rộng và mỏng (hệ số tỉ lệ l/t > 10) sẽ xuất hiện các cộng hưởng lưỡng cực và tứ cực, có thể dễ dàng nhận thấy sự chuyển dịch cường độ hấp thu và bước sóng trên kết quả UV-Vis Những vị trí hấp thu cực đại tại bước sóng khoảng 330, 410, 700 nm tương ứng với cộng hưởng lưỡng cực trên

bề mặt (in-plane dipole resonance), cộng hưởng lưỡng cực ngoài bề mặt plane dipole resonance) và cộng hưởng tứ cực ngoài bề mặt (out-of-plane resonace) [65] Hai loại cộng hưởng lưỡng cực và tứ cực này hoàn toàn không thể phân biệt được khi các hạt nano dạng cầu (đường kính nhỏ hơn 100 nm) Kiểu dao động này bắt nguồn từ mức độ và hướng phân cực của đám mây electron liên quan đến điện trường Theo cách này, một cộng hưởng plasmon lưỡng cực có thể được mô tả như một đám mây electron xung quanh hạt nano chuyển dịch theo hướng song song hoặc đối song với hướng của từ trường Các cộng hưởng plasmon bề mặt bậc cao có thể thu được thông qua sự phân cực phức tạp hơn, có thể được quan sát thấy trong cấu trúc nano có hệ số tỉ lệ cao như nano dạng thanh

(out-of-Hình 1.5 Phổ UV-Vis-NIR của nano bạc dạng tam giác với chiều dài các cạnh khác

nhau và màu sắc của dung dịch keo tổng hợp được [17]

Kích thước, hình dạng và độ phân bố của các hạt nano trong dung dịch keo ảnh hưởng rất nhiều đến tính chất quang Khi các đỉnh của nano tam giác bo tròn hay cắt ngắn, sẽ xuất hiện quá trình chuyển dịch xanh (về phía bước sóng ngắn hơn) (Hình 1.4-1.5), khi đó mật độ đám mây electron thay đổi trên bề mặt của hạt nano [64] Độ dày, chiều dài và môi trường phân cực của nano bạc dạng tam giác cũng ảnh hưởng đến sự chuyển dịch bước sóng hấp thu cực đại [17] Kiểu cộng hưởng tứ cực chỉ có thể xác định được trong hệ keo phân tán khi nồng độ của hạt nano trong dung dịch keo đủ cao và độ phân bố kích thước hạt khá đồng đều Do vậy có thể nhận dạng được hình thái và độ đơn phân tán của hạt nano phiến tam giác thông qua

độ rộng đỉnh, vị trí đặc trưng của cộng hưởng lưỡng cực và tứ cực bề mặt trên kết quả phổ của dung dịch keo

1.2 Tổng hợp vật liệu nano vàng theo phương pháp xanh hóa với các chất bảo

vệ polymer sinh học

1.2.1 Chất bảo vệ collagen

Hiện nay, có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng nano vàng trong các lĩnh vực như y sinh học, mỹ phẩm và sản phẩm chăm sóc cá nhân Nano vàng được tổng hợp trên nền collagen sử dụng các tác nhân tạo nối ngang kết hợp với các phân tử hữu cơ như (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES), polysaccharides (pectin và chitosan) và poly(amino amine) PAMAM dendrimer (G0) Tương tác giữa phân tử hữu cơ với hạt nano vàng cũng được xác định thông qua các phương pháp phân tích hóa lý Khả năng tương thích sinh học của hạt nano vàng khi liên kết với phân tử hữu cơ được đánh giá qua thử nghiệm độc tính tế bào với tế bào keratinocytes (HaCaT) sử dụng phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) [87]

Nghiên cứu chế tạo hệ nano vàng tạo nối ngang với collagen nhằm ứng dụng trong tái tạo cấu trúc của mô tế bào thông qua tác nhân tạo nối ngang 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide) (EDC) Collagen đóng vai trò thành phần chính trong quá trình tái tạo mô và là một chất nền thích hợp cho quá trình tổng hợp các hạt nano vàng, tuy nhiên các phân tử collagen lại dễ bị phân hủy khi ứng dụng trong

hệ thống sinh học, do đó để tăng độ bền của hệ collagen và tăng khả năng gắn kết nano vàng, nghiên cứu thực hiện kết hợp với tác nhân tạo nối ngang đồng thời đánh giá độ bền của hệ nano tạo thành thông qua các phương pháp thủy phân với enzyme collagenase, gốc tự do và các thử nghiệm đánh giá tương thích sinh học [75]

Luciano Castaneda và cộng sự [75] đã tổng hợp hạt nano vàng tạo liên kết ngang với các collagen thông qua chất trung gian hoạt hóa tiopronin (N-(2-mercaptopropionyl)glycine) (TP) và chất tạo nối ngang EDC, các hạt TPAu hình thành liên kết amide với lysine trên phân tử collagen (Hình 1.6) Hạt nano đã hoạt hóa nằm trong cấu trúc xốp của collagen, độ bền của hệ nano vàng-tiopronin-collagen được đánh giá bằng phương pháp enzyme cắt collagenase, khảo sát độc tính của hệ nano tạo thành với phương pháp thử trên dòng tế bào CellTiter96 Quá

trình hình thành liên kết ngang của collagen và TPAu thông qua phản ứng với carbodiimide

Hình 1.6 Cơ chế đề nghị quá trình tạo nối ngang giữa các hạt nano vàng và phân tử

collagen với tác nhân tạo nối ngang [75]

Bên cạnh cung cấp không gian phát triển cho hạt nano, collagen còn có khả năng lưu trữ các phân tử thuốc thông qua liên kết tạo nối ngang trực tiếp hoặc gián tiếp qua trung gian các hạt nano kim loại liên kết vào những vị trí đặc biệt trên chuỗi phân tử collagen (Hình 1.7) [73] Nhiều nghiên cứu gần đây sử dụng tinh bột như một chất hoạt động bề mặt để ổn định cấu trúc và ngăn hạt nano tự keo tụ với nhau, trong qui trình cũng dần thay thế các chất hoạt động bề mặt truyền thống để làm giảm độc tính và cung cấp môi trường tổng hợp xanh

Hình 1.7 Quá trình hình thành liên kết giữa các hạt nano kim loại và

phân tử collagen [73]

Khi hạt nano kim loại tạo nối với phân tử collagen tại các tâm hoạt động, những hạt này sẽ tạo hiệu ứng che chắn ngăn tác nhân enzyme cắt như collagenase không cho tiếp xúc với các trung tâm này Do đó, làm giảm đáng kể quá trình phân

hủy sinh học đối với phân tử collagen và đồng thời giữ cho khung colllagen được bền vững Một đặc tính khác của nano vàng – collagen là tính chất quang trên bề mặt hạt nano vàng thay đổi rõ rệt khi liên kết với phân tử sinh học, do đó có thể ứng dụng trong phát hiện một số phân tử sinh học [139] Sarah và cộng sự đã tích hợp cấu trúc protein của collagen với hạt nano vàng kích thước 10 nm để phát triển vật liệu có khả năng xác định nồng độ glucose và heparin (Hình 1.8)

Hình 1.8 Hệ nano vàng - collagen sử dụng trong xác định nồng độ

glucose và heparin [139]

1.2.2 Chất bảo vệ chitosan

Chitosan là polymer sinh học được sử dụng rộng rãi với vai trò chất bảo vệ trong tổng hợp hạt nano, tuy nhiên tương tác của chitosan với hạt nano kim loại vẫn còn đang được nghiên cứu rất nhiều Khi sử dụng kỹ thuật FTIR và UV-Vis có thể

dự đoán được các tương tác giữa chitosan-ligand-vàng (Hình 1.9) [60] Nghiên cứu

sự tương tác của phân tử chitosan với hạt nano vàng được thực hiện dựa trên hóa học tính toán mô phỏng các hạt nano tạo thành nằm trong các mạch phân tử chitosan, số lượng các mạch chitosan bao phủ trên một hạt nano vàng hình thành và ảnh hưởng của pH đến quá trình bao phủ hạt nano vàng của chitosan [60]

Hình 1.9 Mô phỏng quá trình hình thành mạng lưới chất bảo vệ chitosan xung

quanh hạt nano vàng [60]

Giá trị pH ảnh hưởng rất lớn đến tương tác tĩnh điện của chitosan Nếu pH nhỏ hơn giá trị pKa, sẽ hình thành tương tác tĩnh điện giữa khung polymer với các hạt nano vàng, do có sự proton hóa nhóm amino Khi pH lớn hơn giá trị pKa, các phần tương tác tĩnh điện không còn tác dụng, chitosan bảo vệ hạt nano vàng theo cơ chế hiệu ứng không gian Nghiên cứu này chứng minh sự tương tác trực tiếp của chitosan đến các hạt nano vàng tùy theo các điều kiện tổng hợp khác nhau [112]

Hemalatha và cộng sự [136] đã nghiên cứu tổng hợp và xác định tính chất của vật liệu oleyl chitosan kết hợp với oxid sắt từ/vàng trong phương pháp chẩn đoán hình ảnh MRI và CT, nghiên cứu hướng đến thiết kế vật liệu nanocompsite đa chức năng kết hợp sắt và nano vàng được phủ bên ngoài bởi oleyl chitosan gắn kết với phân tử methotrexate Kết quả HR-TEM cho thấy cấu trúc dạng hình cầu tự nhiên của composite không gây độc và có tính tương thích sinh học cao được chứng minh bởi các thử nghiệm MTT với tế bào NIH 3T3 Ngoài ra, vật liệu này còn đang được nghiên cứu như một liệu pháp dẫn thuốc đến tế bào mục tiêu, vật liệu kết hợp của oxid sắt từ và vàng nano được tổng hợp với DMSA (meso-2,3-dimercaptosuccinic acid), sau đó gắn kết với phân tử oleyl chitosan trong điều kiện

pH 7, và cuối cùng được thu hồi lại bằng từ trường [136] Động học của quá trình tổng hợp nano vàng với chất bảo vệ chitosan đã được Simeonova nghiên cứu với chất khử citric acid, tác giả đã chứng minh nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng tổng hợp nano vàng và tạo thành nhiều hình dạng hạt khác nhau [125]

Cơ chế khử của ion Au+3 tạo hạt nano Au trên nền chất bảo vệ chitosan đã được Alexander và cộng sự nghiên cứu với phương pháp 13C và 1H NMR Động học của quá trình khử Au3+ và sự phân hủy chitosan được nghiên cứu với phương pháp quang phổ UV-Vis và đo độ nhớt, sản phẩm được xác định bằng phương pháp chuẩn độ hệ keo và kết hợp với phổ 13C, 1H-NMR Kích thước hạt nano tạo thành trong khoảng từ 6,9 nm đến 16,2 nm [7]

Nghiên cứu về tương tác của hạt nano vàng với chất bảo vệ chitosan của nhóm tác giả Khoa Dang và cộng sự [60] sử dụng các phương pháp như chuẩn độ điện thế, phổ electron và hấp phụ tia X (XAS) để theo dõi các quá trình hình thành phức giữa AuCl4- và các dẫn xuất của glucosamine trong phân tử chitosan (Hình 1.10) Đồng thời, khảo sát sự thay đổi pH ảnh hưởng đến quá trình hình thành các liên kết và sử dụng kết quả XAS để chứng minh quá trình tạo nối của ion Au3+ với mạch polymer của phân tử chitosan [60]

Hình 1.10 Quá trình hình thành liên kết của ion Au3+ với các mạch chitosan quá

trình khử tạo hạt nano vàng ở các pH khác nhau [60]

1.2.3 Chất bảo vệ gelatin

Canpean và cộng sự đã tổng hợp thành công thanh nano vàng với chất bảo vệ gelatin, đồng thời cho thấy sự tăng cường độ bền nhiệt của các thanh nano phủ gelatin so với thanh không phủ [18] Bên cạnh đó, tính chất quang và kích thước của thanh nano trong lớp gelatin cũng thay đổi theo nhiệt độ, nghiên cứu này mở ra nhiều ứng dụng quan trọng trong y sinh học

Suarasan và cộng sự đã tổng hợp thành công nano vàng với chất bảo vệ gelatin

sử dụng phương pháp khử một giai đoạn, tác nhân khử là sodium citrate ứng dụng trong đánh dấu tế bào và tăng cường bề mặt tán xạ Raman Các hạt nano Au@gelatin có khả năng gắn kết phân tử sinh học và độ bền của hạt nano được khảo sát với dung dịch NaCl 1,0 M ở nhiệt độ phòng và ở 37oC [131]

Ngoài ra, Suarasan và cộng sự đã tổng hợp xanh hạt nano vàng với phương pháp một giai đoạn và ứng dụng trên dòng tế bào tạo xương Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng các tác nhân khử và chất hoạt động bề mặt thân thiện với môi trường nhưng vẫn kiểm soát được hình dạng và kích thước của các hạt nano tạo thành Sử dụng phương pháp kính hiển vi trường tối, tán xạ Rayleigh để xác định sự hiện diện trong tế bào của hạt nano vàng phủ gelatin so với hạt nano vàng phủ citrate và phương pháp MTT đánh giá độc tính tế bào (Hình 1.11) [132]

Hình 1.11 Quá trình thử nghiệm sinh học các hạt nano vàng@gelatin trên dòng tế

bào Osteoblast [132]

1.3 Tổng hợp vật liệu nano bạc theo phương pháp xanh hóa với các chất bảo

vệ polymer sinh học

1.3.1 Phương pháp sử dụng polysaccharide

Hiện nay, tổng hợp nano bạc theo hướng xanh hóa ngày càng thu hút nhiều

sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, đặc biệt sử dụng các chất khử thân thiện với môi trường và ít sinh ra sản phẩm phụ trong quá trình phản ứng, và sản phẩm được ứng dụng trong sinh học hay các thử nghiệm trong lĩnh vực y sinh Raveendran đã

sử dụng phương pháp tổng hợp xanh nano bạc, nano vàng và nano hợp kim bạc với chất khử D-glucose trên nền chất bảo vệ là tinh bột [106], nano hợp kim được chế tạo theo phương pháp này có kích thước hạt nhỏ hơn 10 nm, các hạt tạo thành có độ đơn phân tán cao Ưu điểm của phương pháp vi sóng sử dụng trong công trình này là cung cấp nhiệt đều cho hệ phản ứng và có thể hỗ trợ quá trình tiếp xúc của các ion với chất khử, làm tăng nhanh tốc độ phản ứng, hạt nano bạc tạo thành có dạng hình cầu

vàng-Nhóm nghiên cứu Hong Peng và cộng sự đã tổng hợp xanh hóa hạt nano bạc trên nền chất bảo vệ hemicellulose chiết xuất từ bột tre và chất khử là glucose trong môi trường nước với sự hỗ trợ của nhiệt vi sóng [46] Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng thời gian thực hiện phản ứng trong vi sóng, nồng độ ban đầu của hemicellulose, glucose và AgNO3 trên quá trình hình thành của nano bạc

Vigneshwaran và cộng sự đã đề xuất phương pháp tổng hợp xanh một giai đoạn và ổn định với tinh bột hòa tan [143] Hạt nano tạo thành có kích thước 10 –

34 nm, bền trong môi trường nước với khoảng thời gian 3 tháng ở nhiệt độ 25oC Tác giả sử dụng phương pháp chuẩn độ iod để xác định nồng độ nano bạc được giữ bên trong cấu trúc xoắn của amylose Những hạt nano tạo thành này nằm sâu trong cấu trúc hòa tan của tinh bột [143]

Nghiên cứu của Alena và cộng sự về đặc tính của nano bạc được tổng hợp với phương pháp Tollen cải tiến khi sử dụng nhiều loại saccharide khác nhau [5] Nano bạc được hình thành từ phản ứng khử của fructose, glucose, galactose, mannose, maltose, lactose và saccharose (Hình 1.12) Kết quả nghiên cứu cho thấy