Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm và đánh giá tác dụng diệt khuẩn của một số sản phẩm nano bạc

Gần đây, do hiện tượng các vi khuẩn ngày càng trở nên kháng thuốc, người ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn và các ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là dưới

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VÕ VIẾT HÙNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN CỦA MỘT SỐ SẢN PHẨM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VÕ VIẾT HÙNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN CỦA MỘT SỐ SẢN PHẨM

NANO BẠC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong nhiều lĩnh vực, các anh chị kỹ thuật viên, cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn chân

thành đến GS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu và TS Lê Thị Hường Hoa đã trực tiếp

hướng dẫn, dành nhiều thời gian và tâm huyết giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trần Việt Hùng đã cho tôi nh ng lời

khuyên quí báu và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị trong khoa Nghiên cứu & phát triển, khoa Mỹ phẩm, khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, phòng Sau đại học, bộ môn Hóa phân tích - Trường Đại học Dược Hà Nội, cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè - nh ng người luôn động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập!

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 25 tháng 3 năm 2017

Học viên

Võ Viết Hùng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT …

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ BẠC VÀ NANO BẠC 2

1.1.1 Tính chất của kim loại bạc 2

1.1.1.1 Tính chất vật lý 2

1.1.1.2 Tính chất hóa học 2

1.1.2 Công nghệ nano, đặc tính và phương pháp điều chế nano bạc 2

1.1.2.1 Công nghệ nano 2

1.1.2.2 Đặc tính của hạt nano bạc 3

1.1.2.3 Phương pháp điều chế nano bạc 4

 Phương pháp khử vật lý 4

 Phương pháp ăn mòn laze 4

 Phương pháp khử hóa học 5

 Phương pháp khử hóa lý 5

 Phương pháp khử sinh học 5

1.1.3 Tác dụng diệt khuẩn của nano bạc 6

1.1.4 Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc 8

1.1.5 Ứng dụng nano bạc 10

1.1.5.1 Lĩnh vực y tế 10

1.1.5.2 Công nghiệp mỹ phẩm 11

1.1.5.3 Công nghiệp thực phẩm, gia dụng 11

1.1.5.4 Lĩnh vực môi trường 11

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HẠT NANO BẠC 12

1.2.1 Phân tích phổ UV-VIS 12

1.2.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua 13

1.2.2.1 Giới thiệu 13

1.2.2.2 Nguyên lý hoạt động và sự tạo ảnh trong TEM 14

1.2.2.3 Ưu điểm và hạn chế của TEM 14

 Điểm mạnh của TEM 14

 Điểm yếu của TEM 15

1.2.3 Kính hiển vi điện tử quét 15

1.2.3.1 Giới thiệu 15

1.2.3.2 Nguyên lý hoạt động và sự tạo ảnh trong SEM 15

1.2.3.3 Ưu điểm của kính hiển vi điện tử quét 16

1.2.4 Phương pháp tán xạ ánh sáng động 16

1.2.5 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử 17

1.2.5.1 Nguyên tắc 17

1.2.5.2 Cấu tạo chính của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử 17

1.2.5.3 Phương pháp AAS với kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa 18

1.2.6 Các phương pháp định lượng bạc 19

1.3 TỔNG QUAN VỀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN CỦA NANO BẠC 20

1.3.1 Nguyên tắc……… 20

1.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và khả năng gây bệnh của một số loài VSV dùng trong nghiên cứu 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 23

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Chất chuẩn 24

2.2.2 Chủng chuẩn 24

2.2.3 Hóa chất, dung môi 24

2.2.4 Môi trường nuôi cấy VSV 24

2.2.5 Thiết bị, dụng cụ 25

2.2.5.1 Thiết bị 25

2.2.5.2 Dụng cụ 25

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.3.1 Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm 26

2.3.1.1 Kiểm nghiệm hình dạng và kích thước nano bạc bằng SEM 26

2.3.1.2 Định tính, định lượng nano bạc bằng AAS 26

 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho định tính, định lượng nano bạc bằng AAS 26

 Đánh giá phương pháp định tính, định lượng nano bạc bằng AAS 26

2.3.1.3 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn 27

2.3.1.4 Xây dựng quy trình thử cho một số chỉ tiêu kiểm nghiệm 28

2.3.2 Khảo sát một số ảnh hưởng tới hình dạng, kích thước hạt nano bạc 28

2.3.2.1 Tỷ lệ nồng độ AgNO 3 và PVP - K30 28

2.3.2.2 Tốc độ khuấy dung dịch AgNO 3 28

2.3.2.3 Tốc độ bơm NaBH 4 28

2.3.3 Áp dụng để kiểm nghiệm một số sản phẩm 28

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

3.1 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ TRONG QUÁ TRÌNH BÀO CHẾ TỚI HÌNH DẠNG, KÍCH THƯỚC TIỂU PHÂN BẠC 30

3.1.1 Tỷ lệ nồng độ AgNO 3 và PVP - K30 31

3.1.2 Tốc độ khuấy dung dịch AgNO 3 32

3.1.3 Tốc độ bơm NaBH 4 32

3.2 XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM 32

3.2.1 Kiểm nghiệm hình dạng và kích thước nano bạc bằng SEM 32

3.2.1.1 Chuẩn bị mẫu 33

3.2.1.2 Tiến hành đo 33

3.2.1.3 Đánh giá 34

3.2.1.4 Kết quả đo 34

3.2.1.5 Dự kiến chỉ tiêu về hình dạng và kích thước các tiểu phân bạc 37

3.2.2 Định tính, định lượng nano bạc bằng AAS 37

3.2.2.1 Khảo sát các điều kiện thích hợp cho phân tích bạc bằng AAS 37  Khảo sát lựa chọn nồng độ acid 37

 Khảo sát lựa chọn độ rộng khe 38

 Khảo sát lựa chọn tốc độ khí 39

 Khảo sát chiều cao đầu đốt 41

3.2.2.2 Quy trình thử 42

3.2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích bạc bằng AAS 43

 Tính thích hợp của hệ thống 43

 Độ đặc hiệu của phương pháp 44

 Khoảng tuyến tính 47

 Độ lặp lại 48

 Độ đúng 49

3.2.2.4 Định lượng bạc trong một số sản phẩm 52

3.2.3 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn của dung dịch nước súc miệng nano bạc 53

3.2.3.1 Chuẩn bị môi trường và dung dịch pha loãng 53

3.2.3.2 Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm 53

3.2.3.3 Tiến hành 54

3.2.3.4 Kết quả……… ……… 55

3.2.3.5 Dự kiến chỉ tiêu về tác dụng diệt khuẩn của dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm 57

3.2.4 Dự thảo một số chỉ tiêu kiểm nghiệm đối với các sản phẩm nghiên cứu 58

3.2.4.1 Hỗn dịch nano bạc 1000 ppm 58

3.2.4.2 Dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm 59

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 60

4.1 VỀ ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG BẠC BẰNG AAS 60

4.2 VỀ XÁC ĐỊNH HÌNH DẠNG VÀ KÍCH THƯỚC TIỂU PHÂN NANO

BẠC 61

4.3 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN………… ………62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AAS Quang phổ hấp thụ nguyên tử (Atomic absorption

spectroscopy)

DĐVN IV Dƣợc điển Việt Nam, lần xuất bản thứ 4

DLS Tán xạ ánh sáng động (Dynamic light scattering)

DNA 2’- deoxyribonucleic acid

GLP Thực hành tốt phòng thí nghiệm (Good Laboratory

Practice)

ISO International Organization for Standardization

MRSA Staphylococcus aureus kháng Methicillin

MRSE Staphylococcus epidermidis kháng Methicillin

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 2.3 Công thức cho 3 lít hỗn dịch nano bạc 1000 ppm 23 Bảng 2.4 Công thức cho 1 lít nước súc miệng nano bạc 5 ppm 23 Bảng 3.5 Kết quả kiểm nghiệm hình dạng và kích thước nano bạc

của 04 mẫu thử bằng SEM

36

Bảng 3.6 Độ hấp thụ của dung dịch bạc chuẩn 2 ppm, pha trong

dung dịch acid nitric có nồng độ khác nhau

Bảng 3.9 Độ hấp thụ của dung dịch bạc chuẩn 2 ppm với các chiều

cao đầu đốt khác nhau

41

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ lặp lại của hỗn dịch nano bạc 1000

Bảng 3.20 Số lượng vi sinh vật sau khi tiếp xúc 30 giây với mẫu thử 56

Bảng 3.21 Phần trăm vi sinh vật bị tiêu diệt sau khi tiếp xúc 30 giây

với mẫu thử

57

Bảng 3.22 Dự thảo một số chỉ tiêu đối với hỗn dịch nano bạc 1000 58

ppm Bảng 3.23 Dự thảo một số chỉ tiêu đối với dung dịch nước súc miệng

nano bạc 5 ppm

59

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Ion bạc vô hiệu hóa enzyme chuyển hóa oxy của vi khuẩn 9

ppm

31

Hình 3.8 Ảnh SEM của hỗn dịch nano bạc 1000 ppm, (mẫu HD1) 34 Hình 3.9 Ảnh SEM của hỗn dịch nano bạc 1000 ppm, (mẫu HD2) 35 Hình 3.10 Ảnh SEM của nước súc miệng nano bạc 5 ppm, (mẫu NSM1) 35 Hình 3.11 Ảnh SEM của nước súc miệng nano bạc 5 ppm, (mẫu NSM2) 36 Hình 3.12 Biến thiên độ hấp thụ của dung dịch bạc chuẩn 2 ppm pha

trong các nồng độ acid khác nhau

Hình 3.15 Biến thiên độ hấp thụ của dung dịch bạc chuẩn 2 ppm với

chiều cao đầu đốt khác nhau

41

Hình 3.16 Độ hấp thụ của mẫu nền hỗn dịch nano bạc 1000 ppm theo thời

gian

45

Hình 3.17 Độ hấp thụ của mẫu nền dung dịch nước súc miệng nano bạc 5

ppm theo thời gian

45

Hình 3.18 Độ hấp thụ của mẫu thử hỗn dịch nano bạc 1000 ppm (mẫu 46

HD1) Hình 3.19 Độ hấp thụ của mẫu thử dung dịch nước súc miệng nano bạc 5

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính kháng khuẩn mạnh Khác với các kim loại nặng (chì, thủy ngân, arsen…) bạc không thể hiện độc tính với con người

dù ở liều lượng tương đối cao Từ xa xưa, con người đã sử dụng bạc làm các dụng

cụ chứa đồ ăn, nước uống để phòng bệnh Từ đầu thế kỷ XIX đến gi a thế kỷ XX, bạc và các muối bạc đã được sử dụng rộng rãi để điều trị các vết bỏng và khử trùng Tuy nhiên, sau khi thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả cao người ta ít còn quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc n a Gần đây,

do hiện tượng các vi khuẩn ngày càng trở nên kháng thuốc, người ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn và các ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano

Trong lĩnh vực y tế, thị trường ngày càng xuất hiện nhiều sản phẩm có chứa nano bạc như: gel rửa tay nano bạc, dung dịch rửa xoang, dung dịch rửa vết thương, nước súc miệng, khẩu trang chứa nano bạc… Các sản phẩm này đã góp vai trò tích cực trong công tác phòng chống một số dịch bệnh nguy hiểm như: dịch tay chân miệng, dịch tiêu chảy, dịch cúm gia cầm, dịch sởi Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn đối với gel rửa tay nano bạc [9] [12] Tuy nhiên, đối với một số sản phẩm nano bạc khác như dạng: hỗn dịch nano bạc, dung dịch nước súc miệng thì trong nước hiện nay chưa có phương pháp kiểm tra chất lượng cũng như chưa có phương pháp đánh giá tác dụng diệt khuẩn của chúng Để góp

phần đánh giá chất lượng của nh ng sản phẩm này, đề tài: “Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm và đánh giá tác dụng diệt khuẩn của một số sản phẩm nano bạc” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định một số chỉ tiêu kiểm nghiệm của một số sản phẩm

có chứa nano bạc (hỗn dịch nano bạc 1000 ppm và dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm)

2 Áp dụng để kiểm nghiệm các sản phẩm có chứa nano bạc trên

3 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn của các sản phẩm có chứa nano bạc

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1.2 Công nghệ nano, đặc tính và phương pháp điều chế nano bạc

1.1.2.1 Công nghệ nano

Thuật ng công nghệ nano (nanotechnology) xuất hiện từ nh ng năm 70 của thế kỷ XX, chỉ việc thiết kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và

hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước cỡ nanomet (1 – 100 nm), tức

là chính xác đến từng lớp nguyên tử, phân tử Theo cơ quan Hàng không Vũ trụ Hoa Kỳ (NASA), công nghệ nano là công nghệ chế tạo ra các cấu trúc, vật liệu, thiết bị và hệ thống chức năng với kích thước đo khoảng từ 1 đến 100nm và khai thác ứng dụng các đặc tính độc đáo của nh ng sản phẩm này Công nghệ nano cũng

có thể hiểu là ngành công nghệ dựa trên các hiểu biết về các quy luật, hiện tượng, tính chất của cấu trúc vật lý có kích thước đặc trưng ở thang nano [12]

1.1.2.2 Đặc tính của hạt nano bạc

Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm Do có diện tích bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu khối do khả năng giải phóng nhiều Ag hơn Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt Hiện tượng này tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano

Bảng 1.1 Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích

Kích thước của hạt nano Ag (nm)

Số nguyên tử Ag có trong hạt

- Có khả năng phát xạ tia hồng ngoại đi xa

- Không có hại cho sức khỏe con người với liều lượng tương đối cao, không

có phụ gia hóa chất

- Có khả năng phân tán ổn định trong các loại dung môi khác nhau (cả trong các dung môi phân cực như nước lẫn trong các dung môi không phân cực như benzen, toluen)

- Độ bền hóa học cao, ít bị biến đổi dưới tác dụng của ánh sáng và các tác nhân oxy hóa khử thông thường

- Chi phí cho quá trình sản xuất thấp

- Ổn định ở nhiệt độ cao

1.1.2.3 Phương pháp điều chế nano bạc

Có 2 phương pháp để điều chế hạt nano kim loại: phương pháp từ dưới lên

và phương pháp từ trên xuống Phương pháp từ dưới lên “bottom-up” là phương pháp tạo hạt nano từ các nguyên tử hoặc ion kết hợp lại với nhau Phương pháp từ trên xuống “top-down” là phương pháp tạo các hạt nano từ vật liệu khối ban đầu Đối với hạt nano bạc, người ta thường điều chế bằng phương pháp từ dưới lên Nguyên tắc là khử ion Ag+ thành Ag Các hạt Ag mới hình thành sẽ được bọc bởi các chất ổn định như PVP, chitosan Các phương pháp từ trên xuống ít được sử dụng vì nano bạc chế tạo bằng phương pháp này thường có kích thước hạt lớn và không đồng đều Hiện nay các vật liệu kim loại nano như vàng (Au), Sắt (Fe), đồng (Cu), bạc (Ag) dưới dạng bột hay dung dịch keo được chế tạo chủ yếu bằng các phương pháp sau:

 Phương pháp ăn mòn laze

Đây là phương pháp từ trên xuống Vật liệu ban đầu là một tấm bạc được đặt trong một dung dịch có chứa chất hoạt hóa bề mặt Một chùm laser dạng xung có buớc sóng 532 nm, độ rộng xung là 10 ns, tần số 10 Hz, năng lượng mỗi xung là 90mJ, đường kính vùng kim loại bị tác dụng từ 1 nm – 3 nm Dưới tác dụng của chùm laser xung, các hạt nano có kích thước khoảng 10 nm được hình thành và

được bao phủ bởi chất hoạt hóa bề mặt CnH2n+1SO4Na (với n = 8, 10, 12, 14) nồng

Thông thường, nguồn cung cấp ion Ag+ là các muối của bạc như AgNO3 Các tác nhân khử thường dùng là: formandehyd, NaBH4, ethanol,… Gần đây có một số công trình nghiên cứu chế tạo keo nano bạc và bột nano bạc từ bạc nitrat nhưng sản phẩm trung gian là oxid bạc (Ag2O) rồi từ Ag2O tiếp tục khử về Ag0

nhằm thu được keo bạc có nồng độ cao Để các hạt nano bạc phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người ta bao phủ hạt nano bạc bằng một lớp polyme, điều này giúp cho các hạt được bảo vệ tốt hơn tránh hiện tượng kết tủa, hơn n a phương pháp này có thể làm cho bề mặt hạt nano có tính chất cần thiết [37]

 Phương pháp khử hóa lý

Đây là phương pháp trung gian gi a hóa học và vật lí Nguyên lý là dùng phương pháp điện phân kết hợp với siêu âm để tạo hạt nano Phương pháp điện phân thông thường chỉ có thể tạo được màng mỏng kim loại Trước khi xảy ra sự hình thành màng, các nguyên tử kim loại sau khi được điện hóa sẽ tạo các hạt nano bám lên điện cực âm Lúc này người ta tác dụng một xung siêu âm đồng bộ với xung điện phân thì hạt nano kim loại sẽ rời khỏi điện cực và đi vào dung dịch [59]

 Phương pháp khử sinh học

Dùng vi khuẩn là tác nhân khử ion kim loại Người ta cấy vi khuẩn chuyển hóa nitrat hay phân giải NADPH vào trong dung dịch có chứa ion bạc để thu được hạt nano bạc Phương pháp này đơn giản, thân thiện với môi trường và có thể tạo

hạt với số lượng lớn [36]

1.1.3 Tác dụng diệt khuẩn của nano bạc

Từ xa xưa, người ta đã sử dụng đặc tính này của bạc để phòng bệnh Người

cổ đại sử dụng các bình bằng bạc để lưu tr nước, rượu dấm Bạc và các hợp chất của bạc được sử dụng rộng rãi từ đầu thế kỷ XIX đến gi a thế kỷ XX để điều trị các vết bỏng và khử trùng Trong thế kỷ XX, người ta thường đặt một đồng bạc trong chai s a để kéo dài độ tươi của s a

Sau khi thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả cao người ta ít quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc Tuy nhiên, từ nh ng năm gần đây, do hiện tượng các chủng vi sinh ngày càng trở nên kháng thuốc, người ta quan tâm trở lại việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn và các ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano

Các nghiên cứu đã khẳng định bạc có khả năng tiêu diệt hơn 650 chủng vi sinh vật gây bệnh cho người Mặt khác, nguyên tố bạc không có hại với cơ thể con người với liều lượng tương đối cao Vì vậy, ngày nay bạc ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực khoa học sản xuất Người ta cũng chứng minh được trong thiên nhiên bạc không tạo ra nh ng hợp chất tổn hại đến môi trường và

hệ sinh thái Mặt khác, đặc tính quý với vai trò là chất sát trùng là bạc không bị các chủng vi sinh vật thích nghi như nhiều hóa chất sát trùng khác Gần đây các kết quả nghiên cứu mới nhất về tính sát trùng của bạc đã khẳng định bạc ở kích thước nano

có hiệu quả sát khuẩn cao hơn bạc ở kích thước macro nhiều lần Điều này đã thúc đẩy nhiều hướng nghiên cứu chế tạo và sử dụng nano bạc khử trùng trong y tế và đời sống trên thế giới

Các hạt nano siêu nhỏ thể hiện các tính chất khác biệt hoặc nổi bật hơn so với nguyên liệu dạng macro Các hạt nano siêu nhỏ làm cho các hạt có diện tích bề mặt lớn, cân đối với khối lượng của chúng Trường hợp bạc ở dạng hạt nano, cho phép chúng tương tác dễ dàng với các hạt khác và tăng hiệu quả kháng khuẩn Hiệu quả này lớn tới mức 1 gam hạt nano bạc có thể tạo tính chất kháng khuẩn tới hàng trăm mét vuông chất nền

Bản thân kim loại bạc dạng khối khả năng kháng khuẩn không cao, nhưng khi chịu một tác động hóa học như sự oxy hóa nó sẽ tạo ra ion bạc có hoạt tính kháng khuẩn Phản ứng hóa học này diễn ra trên bề mặt khối bạc khi tiếp xúc với độ

ẩm và mồ hôi người, nhưng với tốc độ diễn ra rất chậm [32] Vì vậy để có tốc độ oxy hóa lớn đòi hỏi bạc phải có kích thước nano với diện tích bề mặt lớn Với 1g bạc khối hình cầu có diện tích là 1,06 cm2 trong khi 1 gam bạc kích thước 10 nm có diện tích bề mặt là 600000 cm2 Với diện tích bề mặt lớn như vậy phản ứng oxy hóa của các hạt nano bạc diễn ra dễ dàng cho phép liên tục giải phóng ra các ion bạc

Nhiều tài liệu cho thấy bạc nano có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus:

- Nghiên cứu so sánh hiệu quả kháng khuẩn của bạc nano với đồng nano cho thấy bạc nano cho hiệu quả kháng khuẩn cao hơn [46]

- Nghiên cứu so sánh hoạt tính kháng khuẩn của nano bạc, nano platin và

nano vàng trên chủng Staphylococcus aureus (S aureus) và Escherichia coli (E coli), kết quả cho thấy chỉ có nano bạc cho hoạt tính kháng khuẩn với 2 chủng này,

trong khi platin và vàng dạng nano không có hiệu quả [27]

- Boe cement là vật liệu tạo hình mô xương dùng trong phẫu thuật tạo hình, được ưa chuộng và dùng rất nhiều ở Mỹ Việt Nam bắt đầu được sử dụng vào năm

2003 ở bệnh viện Chợ Rẫy Một nghiên cứu cho thấy boe cement có kết hợp bạc

nano có độ kháng khuẩn cao, kháng cả nh ng chủng Staphylococcus epidermidis (MRSE), Staphylococcus aureus (MRSA) kháng methicillin (in vitro), trong khi đó

cement có chứa getamicin cũng không kháng được 2 chủng này và cetment không chứa kháng sinh thì hoàn toàn không có khả năng diệt bất kỳ chủng nào Nghiên cứu này cũng cho thấy độ an toàn của nhóm bone cement có chứa bạc nano tương đương với nhóm chứng [22]

- Bạc nano với kích thước tiểu phân rất nhỏ nên làm tăng diện tích tiếp xúc với môi trường bên ngoài Do đó, bạc nano cho hiệu quả diệt khuẩn cao chỉ với một lượng nhỏ [42]

- Nhóm nghiên cứu Viện Bỏng Quốc gia và Viện Công nghệ Môi trường [14] đã nghiên cứu tác dụng của nano bạc đối với trực khuẩn mủ xanh

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (P aeruginosa), Escherichia coli ATCC

25922 (E.coli) và tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ATCC 25923 (S aureus) Kết

quả cho thấy với nồng độ 0,781 mg/l dung dịch nano bạc có khả năng tiêu diệt hoàn

toàn vi khuẩn P aeruginosa sau 24h tiếp xúc Nghiên cứu cho thấy với nồng độ 1,563 mg/l dung dịch nano bạc có tác dụng diệt khuẩn hoàn toàn đối với vi khuẩn E coli sau 2h tiếp xúc, còn ở nồng độ 0,195 mg/l nano bạc có tác dụng diệt khuẩn hoàn toàn đối với vi khuẩn E coli sau 24h tiếp xúc Đối với tụ cầu vàng S aureus,

nồng độ 6,25 mg/l của dung dịch nano bạc có tác dụng diệt hoàn toàn vi khuẩn sau 6h tiếp xúc, với nồng độ 0,781 mg/l của dung dịch nano bạc thì phải sau 24h tiếp xúc, vi khuẩn mới bị diệt hoàn toàn

- Đánh giá khả năng diệt khuẩn của dung dịch nano bạc do Viện Công nghệ Môi trường đối với 3 chủng phẩy khuẩn tả được phân lập từ bệnh phẩm của các bệnh nhân đang điều trị tại Viện Các bệnh truyền nhiễm và nhiệt đới Quốc gia [7]

Kết quả cho thấy tất cả ba chủng vi khuẩn Vibrio cholerae 3184, 3214 và 3252 đã bị

tiêu diệt sau 15 phút tiếp xúc với dung dịch nano bạc nồng độ 1 mg/l Nhưng nếu thời gian tiếp xúc kéo dài tới 60 phút thì chỉ cần 0,25mg/l nano bạc là đã có thể tiêu diệt hoàn toàn số vi khuẩn này

- Trần Việt Hùng, Đoàn Cao Sơn và cộng sự [13] cũng đã thử tác dụng diệt khuẩn của gel rửa tay nano bạc không dùng nước có chứa 10 ppm nano bạc và 70% ethanol, sản phẩm của dự án cấp Thành phố Kết quả cho thấy sản phẩm có tác dụng diệt khuẩn lên đến 99,99%

1.1.4 Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc

- Trước hết, độ bám dính của các tiểu phân nano bạc lên màng tế bào VSV làm thay đổi tính chất màng, làm thay đổi quá trình vận chuyển các chất qua màng

tế bào VSV Sự bám dính này phụ thuộc vào nồng độ, hình dạng, kích thước của các tiểu phân nano Kích thước nhỏ cùng diện tích bề mặt lớn làm tăng khả năng bám dính trên bề mặt các tế bào VSV [39] [49]

- Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion Ag+ Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau

đó, khả năng hoặt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi Do động vật không

có thành tế bào nên không bị tổn thương khi tiếp xúc với ion này [26]

- Có một cơ chế tác động của ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý được mô tả như sau: Sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó

sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm – SH của phân tử enzym chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa enzym này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn [38]

Hình 1.1 Ion bạc vô hiệu hóa enzyme chuyển hóa oxy của vi khuẩn

- Ion bạc còn ức chế hoạt động của chu trình nitơ, phosphor, lưu huỳnh của các vi khuẩn nitrat [41]

- Ion bạc còn bất hoạt các enzym chuyển hóa khác có chứa nhóm thiol, sulfur [21] [45]

- Ngoài ra, ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung hòa điện tích của gốc phosphat do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA [28]

Hình 1.2 Ion bạc liên kết với các base của DNA

Như vậy, so với các thuốc kháng sinh thì nano bạc có nh ng ưu điểm như sau:

- Nano bạc tiêu diệt vi khuẩn bằng nhiều cơ chế, tác động nhiều quá trình, từ cấu trúc màng tế bào, khả năng vận chuyển qua màng cũng như quá trình trao đổi chất của VSV Vì vậy, vi khuẩn hầu như không có khả năng kháng lại bạc Các tế bào của người có lớp màng bảo vệ hoàn toàn khác so với tế bào VSV, vì vậy không

bị tổn thương khi tiếp xúc với ion bạc Khả năng VSV chống lại tác động của bạc là cực kỳ hiếm bởi vì VSV phải có nhiều đột biến đồng thời đối với mỗi chức năng của tế bào Sự đột biến đồng thời này xảy ra rất hạn h u với tần suất 1/100.000 [32] Đồng thời, các kháng sinh bị hấp thụ trong quá trình diệt khuẩn, còn bạc tác dụng như một chất xúc tác nên ít bị tiêu hao trong quá trình sử dụng

- Dựa trên nh ng kết quả nghiên cứu khoa học thực tiễn về độ an toàn của bạc trong nước uống, Tổ chức Y tế thế giới đã công bố rằng: “Không cần thiết để quy định giới hạn của bạc trong công nghệ xử lý nước và sự có mặt của ion bạc trong nước uống không gây nguy hiểm gì cho sức khỏe con người” Nhờ nh ng tính năng này, nano bạc được xem là chất kháng khuẩn tự nhiên an toàn và hiệu quả Hơn n a, nh ng sản phẩm được ứng dụng công nghệ nano bạc không gây bất kỳ một kích ứng nào cho người dùng

và băng gạc ch a vết thương, vết bỏng [9]

- Điều trị viêm loét nướu răng, ngâm răng giả

- Khử trùng trong phụ khoa như viêm cổ tử cung, viêm âm đạo, bệnh hoa liễu (giang mai, bệnh lậu)

- Vệ sinh khử trùng vật liệu: Bông, băng, ống thông, khẩu trang, áo khoác và

mũ phẫu thuật

- Khử trùng dụng cụ y tế, thiết bị phẫu thuật, nội soi

- Khử trùng nhà vệ sinh, băng, tã vệ sinh, khăn

1.1.5.2 Công nghiệp mỹ phẩm

- Sử dụng làm chất phụ gia trong dầu gội đầu kháng nấm và các sản phẩm

mỹ phẩm khác (kem đánh răng, nước súc miệng, s a rửa mặt, kem nền, lăn khử mùi)

1.1.5.3 Công nghiệp thực phẩm, gia dụng

- Khử trùng môi trường sản xuất, khử trùng thực phẩm đóng gói, khử trùng phương tiện vận chuyển, bảo quản sản phẩm

- Vệ sinh trong gia đình: khử trùng cho bệ xí, sàn gạch, bồn rửa, tay nắm cửa, thêm vào nước rửa tay, rửa chén, nước làm sạch; gi cho quần áo và khăn tắm hoặc khăn lau mặt không chua hoặc nấm mốc; khử mùi

- Đồ may mặc: hạt nano bạc được tẩm vào các loại sợi để diệt khuẩn và khử mùi

- Khử trùng tủ lạnh, tủ đông, tủ chứa thực phẩm, máy giặt hoặc kháng khuẩn cho đồ chơi Có thể phun vào các bộ lọc của điều hòa không khí sau khi làm sạch Nhóm nghiên cứu Viện Công nghệ Môi trường đã nghiên cứu chế tạo màng lọc phủ nano bạc có thể ứng dụng cho các thiết bị xử lý không khí như điều hòa không khí [17]

- Chăn nuôi: để làm sạch môi trường chăn nuôi, đảm bảo nước uống chăn nuôi đạt tiêu chuẩn, ch a lành vết thương động vật, thủy sản, bệnh da liễu, bệnh của

hệ thống sinh dục, bệnh về mắt, mũi khử mùi cho lò mổ hoặc trang trại, các thiết bị sinh sản

1.1.5.4 Lĩnh vực môi trường

- Khử trùng các không gian khác nhau: Bệnh viện, siêu thị, trường học, quán café, rạp chiếu phim, sân vận động, trong hộ gia đình

- Các công cụ khử trùng trong giao thông vận tải: xe hơi, tàu hỏa, máy bay, tàu thủy, xe taxi, xe buýt

- Khử trùng bể bơi: sử dụng làm chất kháng khuẩn cho bể bơi công cộng và gia đình mà không tạo ra các sản phẩm phụ độc hại trong quá trình khử trùng, ngăn chặn sự phát triển của tảo và nấm, trong khi không ảnh hưởng đến pH và màu của nước và thân thiện với môi trường

- Xử lý nước thải sinh hoạt [16], nước thải công nghiệp

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HẠT NANO BẠC

1.2.1 Phân tích phổ UV-VIS

- Hiện tượng plasmon bề mặt:

Ở kích thước nanomet, đám mây electron có thể dao động trên bề mặt hạt và hấp thụ bức xạ điện từ, hiện tượng này gọi là cộng hưởng plasmon bề mặt [43] [48] Hiện tượng “cộng hưởng plasmon bề mặt” (SPR) được giải thích là: điện trường của sóng điện từ tác động lên các electron tự do trên bề mặt hạt nano, làm electron bị dồn về một phía, gây ra sự phân cực [34] [58] Sau đó, dưới tác dụng của lực phục hồi Coulombic, các electron sẽ trở lại vị trí ban đầu Vì có bản chất sóng, nên điện trường dao động làm cho sự phân cực này dao động theo Sự dao động này được gọi

là “plasmon” Khi tần số dao động của đám mây electron trùng với tần số của một bức xạ điện từ nào đó, sẽ gây ra sự dao động hàng loạt của các electron tự do Hiện tượng này gọi là “cộng hưởng plasmon bề mặt” (SPR) [58] Kích thước, hình dạng

và nồng độ của các hạt nano kim loại xác định vị trí quang phổ hấp thụ và chiều rộng dải phổ [40] [48]

Tóm lại, hiện tượng SPR làm cho các hạt nano bạc có khả năng hấp thụ VIS Theo thuyết Mie [56], khả năng hấp thụ các bước sóng UV-VIS phụ thuộc vào hình dạng, kích thước và nồng độ của hạt Khi kích thước hạt tăng lên, các đỉnh plasmon cộng hưởng sẽ chuyển sang bước sóng dài hơn và phổ mở rộng hơn [48] Dựa trên các thuộc tính quang phổ plasmon người ta có thể xác định được kích thước, hình dạng cụ thể của hạt nano [50]

UV-Hình 1.3 Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt

Hình 1.4 Phổ hấp thụ của các hạt nano bạc có kích thước từ 10 -100 nm ở nồng độ

0,02 mg/ml

1.2.2 Kính hiển vi điện tử truyền qua

1.2.2.1 Giới thiệu

Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscopy, TEM) là

một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lƣợng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số

1.2.2.2 Nguyên lý hoạt động và sự tạo ảnh trong TEM

Trong TEM, chùm điện tử được sử dụng thay cho ánh sáng trong kính hiển

vi quang học Điện tử được phát ra từ súng phóng điện tử Có hai cách để tạo ra chùm điện tử: sử dụng nguồn phát xạ nhiệt điện tử và sử dụng súng phát xạ trường [11]

Phương pháp TEM cho bức ảnh chân thực về kích thước hạt của vật liệu Nhờ cách tạo ảnh nhiễu xạ, vi nhiễu xạ và nano nhiễu xạ, kỹ thuật hiển vi điện tử truyền qua còn cho biết nhiều thông tin chính xác về cách sắp xếp các nguyên tử trong mẫu, theo dõi được cách sắp xếp đó trong chi tiết từng hạt, từng diện tích cỡ micromet vuông và nhỏ hơn Ảnh của hiển vi điện tử truyền qua cho phép người ta quan sát được hình dạng và xác định được kích thước của các hạt nano

Hình 1.5 Ảnh TEM của các hạt nano bạc kích thước 20 nm

1.2.2.3 Ưu điểm và hạn chế của TEM

Dù được phát triển từ rất lâu, nhưng đến thời điểm hiện tại, TEM vẫn là một công cụ nghiên cứu mạnh và hiện đại trong nghiên cứu về cấu trúc vật rắn, được sử dụng rộng rãi trong vật lý chất rắn, khoa học vật liệu, công nghệ nano, hóa học, sinh học, y học và vẫn đang trong quá trình phát triển với nhiều tính năng mạnh mới

 Điểm mạnh của TEM

- Có thể tạo ra ảnh cấu trúc vật rắn với độ tương phản, độ phân giải (kể cả không gian và thời gian) rất cao đồng thời dễ dàng cung cấp các thông tin về cấu

trúc Khác với dòng kính hiển vi quét đầu dò, TEM cho ảnh thật của cấu trúc bên trong vật rắn nên đem lại nhiều thông tin hơn, đồng thời rất dễ dàng tạo ra các hình ảnh này ở độ phân giải tới cấp độ nguyên tử

- Đi kèm với các hình ảnh chất lượng cao là nhiều phép phân tích rất h u ích đem lại nhiều thông tin cho nghiên cứu vật liệu

 Điểm yếu của TEM

- Đắt tiền: TEM có nhiều tính năng mạnh và là thiết bị rất hiện đại do đó giá thành của nó rất cao, đồng thời đòi hỏi các điều kiện làm việc cao ví dụ chân không siêu cao, sự ổn định về điện và nhiều phụ kiện đi kèm

- Đòi hỏi nhiều phép xử lý mẫu phức tạp cần phải phá hủy mẫu (điều này không thích hợp với nhiều tiêu bản sinh học)

- Việc điều khiển TEM rất phức tạp và đòi hỏi nhiều bước thực hiện chính xác cao

1.2.3 Kính hiển vi điện tử quét

1.2.3.1 Giới thiệu

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM) là một loại

kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao của bề mặt mẫu vật bằng cách sử dụng một chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật

1.2.3.2 Nguyên lý hoạt động và sự tạo ảnh trong SEM

Việc phát các chùm điện tử trong SEM cũng giống như việc tạo ra chùm điện

tử trong kính hiển vi điện tử truyền qua, tức là điện tử được phát ra từ súng phóng điện tử (có thể là phát xạ nhiệt hay phát xạ trường ), sau đó được tăng tốc Tuy nhiên, thế tăng tốc của SEM thường chỉ từ 10 kV đến 50 kV vì sự hạn chế của thấu kính từ, việc hội tụ các chùm điện tử có bước sóng quá nhỏ vào một điểm kích thước nhỏ sẽ rất khó khăn Điện tử được phát ra, tăng tốc và hội tụ thành một chùm điện tử hẹp (cỡ vài trăm Angstrong đến vài nanomet) nhờ hệ thống thấu kính từ, sau

đó quét trên bề mặt mẫu nhờ các cuộn quét tĩnh điện Độ phân giải của SEM được

xác định từ kích thước chùm điện tử hội tụ, mà kích thước của chùm điện tử này bị hạn chế bởi quang sai, chính vì thế mà SEM không thể đạt được độ phân giải tốt như TEM Ngoài ra, độ phân giải của SEM còn phụ thuộc vào tương tác gi a vật liệu tại bề mặt mẫu vật và điện tử Khi điện tử tương tác với bề mặt mẫu vật, sẽ có các bức xạ phát ra, sự tạo ảnh trong SEM và các phép phân tích được thực hiện thông qua việc phân tích các bức xạ này Các bức xạ chủ yếu gồm: Điện tử thứ cấp

(Secondary electrons) và điện tử tán xạ ngược (Backscattered electrons) [10] [54]

[55]

1.2.3.3 Ưu điểm của kính hiển vi điện tử quét

Mặc dù không thể có độ phân giải tốt như kính hiển vi điện tử truyền qua nhưng kính hiển vi điện tử quét lại có điểm mạnh là phân tích mà không cần phá hủy mẫu vật và có thể hoạt động ở chân không thấp Một điểm mạnh khác của SEM

là các thao tác điều khiển đơn giản hơn rất nhiều so với TEM khiến cho nó rất dễ sử dụng Một điều khác là giá thành của SEM thấp hơn rất nhiều so với TEM, vì thế SEM phổ biến hơn rất nhiều so với TEM

1.2.4 Phương pháp tán xạ ánh sáng động

Tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering, DLS) là một kỹ thuật

trong vật lý, dựa vào sự tương tác của ánh sáng laser với các hạt và phân tích các biến động cường độ ánh sáng để đo chuyển động Brown Phương pháp này có thể được sử dụng để đo kích thước hạt đặc biệt là trong khoảng 2-500 nm [30] [52] [53]

Ưu điểm của DLS là: đơn giản, độ nhạy và độ chọn lọc cao, rút ngắn thời gian đo lường Do đó, các kỹ thuật đang ngày càng được sử dụng để mô tả các đặc điểm của hạt nano (tính toán kích thước hạt, đưa ra phân bố kích thước hạt và chỉ số

đa tán sắc) trong nhiều lĩnh vực khoa học và công nghiệp [25] [47] [52]

Mặc dù kỹ thuật DLS được sử dụng rộng rãi như vậy, nhưng DLS cũng gặp một số vấn đề trong trường hợp đo mẫu có kích thước lớn Có nhiều công trình về việc sử dụng DLS để đo lường các hạt nano kim loại có kích thước khác nhau [24]

[33] [57] nhưng nhìn chung các nhà nghiên cứu không áp dụng cho hạt nano kim loại với kích thước trên 100 nm [36] [50] [56]

1.2.5 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử

1.2.5.2 Cấu tạo chính của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử

Cấu tạo của một máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) gồm các bộ phận chính sau: Nguồn bức xạ, bộ phận hóa hơi hay nguyên tử hóa mẫu, bộ phận đơn sắc hóa, bộ phận phát hiện và khuếch đại tín hiệu

- Nguồn phát tia bức xạ cộng hưởng của nguyên tố cần phân tích: thường là

đèn cathod rỗng HCL (Hollow Cathode Lamp) hoặc đèn phóng điện không cực

EDL (Electronic Discharge Lamp) hoặc đèn phổ liên tục có biến điệu

- Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích, có hai loại kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu:

+ Kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa F-AAS (Flame AAS), sử dụng khí

C2H2 và không khí nén hoặc dinitơ oxid (N2O)

+ Kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa ETA-AAS (Electro Atomization AAS): kỹ thuật này thực hiện quá trình nguyên tử hóa mẫu trong thời

-Thermal-gian rất ngắn nhờ vào năng lượng của dòng điện có công suất lớn và trong môi trường khí trơ

- Bộ đơn sắc hóa thường đặt sau bộ phận nguyên tử hóa mẫu với mục đích chọn vạch cộng hưởng từ nguồn bức xạ nhiều vạch và loại bỏ nh ng vạch nhiễu do chính ngọn lửa phát ra

1.2.5.3 Phương pháp AAS với kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa

Kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa là dùng năng lượng của ngọn lửa đèn khí để hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu phân tích

Để tạo ra ngọn lửa, có thể đốt cháy nhiều hỗn hợp khí khác nhau trong các đèn khí thích hợp bao gồm một khí oxy hóa và một khí cháy Các hỗn hợp khí được dùng phải đảm bảo các yêu cầu nhất định để dùng vào mục đích hóa hơi và nguyên

tử hóa mẫu phân tích Các hỗn hợp khí được dùng nhiều nhất trong phép đo F-AAS là: acetylen và không khí nén, N2O và acetylen hay hydro và acetylen [15]

Các quá trình xảy ra trong ngọn lửa:

Trong ngọn lửa có nhiều quá trình đồng thời xảy ra, có quá trình chính và cũng có quá trình phụ Trong đó, nhiệt độ của ngọn lửa là yếu tố quyết định mọi diễn biến của các quá trình đó

Trước hết, khi mẫu ở thể sol khí được dẫn lên đèn nguyên tử hóa, dưới tác dụng nhiệt của ngọn lửa, ở miệng đèn, là sự bay hơi của dung môi hòa tan và các chất h u cơ trong thể sol khí Mẫu còn lại là các hạt rắn rất nhỏ mịn (các muối của các chất) trong ngọn lửa và nó được dẫn tiếp vào vùng trung tâm ngọn lửa Tiếp đó

là quá trình hóa hơi và nguyên tử hóa của các hạt mẫu khô Các quá trình này xảy ra thường theo hai cơ chế chính:

- Nếu Eh < En tức năng lượng hóa hơi Eh của các hợp phần có trong mẫu nhỏ hơn năng lượng nguyên tử hóa En của nó thì trước hết các hợp phần này sẽ hóa hơi

ở dạng phân tử Sau đó các phân tử này mới bị phân ly thành các nguyên tử tự do:

Bên cạnh các quá trình chính, trong ngọn lửa đèn khí còn một số quá trình phụ (sự ion hóa của nguyên tố phân tích, sự phát xạ, sự hấp thụ của phân tử, sự tạo thành hợp chất bền nhiệt)

+ Phương pháp Volhard: Cho muối bạc nitrat dư phản ứng với natri clorid trong môi trường acid, định lượng muối bạc dư bằng dung dịch KSCN với chỉ thị phèn sắt amon và thêm một lượng nhỏ nitrobenzen:

Ag+ + Cl- → AgCl ↓

Ag+ + SCN- → AgSCN ↓

Fe3+ + SCN- → Fe(SCN)2+ (màu đỏ) + Phương pháp Fajans: Cho muối bạc nitrat phản ứng với natri clorid, chỉ thị fluorescein, gần điểm tương đương dung dịch từ màu vàng chuyển sang màu hồng:

Ag+ + Cl- → AgCl ↓ HFlu ↔ H+ + Flu-Trước điểm tương đương, lượng AgNO3 cho vào còn thiếu nên tủa tạo thành hấp phụ Cl-

dư trong dung dịch, vì vậy các hạt kết tủa mang điện tích âm Sau điểm tương đương, Ag+

dư nên được kết tủa hấp phụ Vì vậy kết tủa mang điện tích

dương sẽ hấp phụ anion Flu- của chỉ thị, làm nó chuyển từ màu vàng sang màu hồng Sự chuyển màu này giúp ta phát hiện điểm kết thúc của chuẩn độ

+ Nhược điểm của các phương pháp hóa học định tính, định lượng bạc:

- Các phép định tính chỉ phát hiện được bạc ở dạng ion

- Yêu cầu một lượng mẫu lớn

- Độ chính xác và độ nhạy không cao khi phân tích mẫu chỉ chứa bạc ở dạng

đó lấy mẫu và đếm số lượng vi sinh vật sống còn lại trong sản phẩm sau khoảng thời gian ủ nhất định [6]

1.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và khả năng gây bệnh của một số loài VSV dùng trong nghiên cứu [4] [8]

Phương pháp tiếp xúc sử dụng 5 loài VSV chỉ thị bao gồm:

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

- Staphylococcus aureus ATCC 6538

- Streptococcus mutans ATCC 700610

- Streptococcus sanguinis ATCC 10556

- Candida albicans ATCC 10231

1.3.2.1 Candida albicans

- Đặc điểm hình thái: là VSV Eucaryote, cơ thể là nh ng tế bào nhỏ hình trứng, có khi có chồi nhỏ

- Sinh sản: vô tính bằng cách nảy chồi, h u tính bằng cách hình thành túi bào

tử

- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển trên môi trường nuôi cấy thông thường Môi trường Sabouraud là môi trường nuôi cấy cơ bản Điều kiện thích hợp là: pH = 5,8-6,2; nhiệt độ = 25-28°C

+ Môi trường Sabouraud lỏng: tạo váng trên bề mặt;

+ Môi trường Sabouraud đặc: khuẩn lạc to, nhẵn, màu trắng đục

- Khả năng gây bệnh: là nấm men ký sinh trong ống tiêu hóa, gặp điều kiện thuận lợi có thể gây bệnh như: tưa lưỡi ở trẻ em, viêm thực quản, viêm da, viêm âm đạo,…

1.3.2.2 Streptococcus mutans

Cho đến nay Streptococcus mutans được xem là tác nhân chính gây ra sâu

răng Vi khuẩn này lên men carbohydrate tạo ra acid, làm pH giảm xuống < 5, sự giảm pH liên tục có thể đưa đến sự khử khoáng trên bề mặt răng, làm mất vôi ở các

mô cứng của răng, khởi phát quá trình sâu răng

Cơ chế chính xác để S.mutans bám dính và tích tụ trên bề mặt thì chưa rõ

nhưng S.mutans được nghĩ là yếu tố gây bệnh vì chúng có khả năng tạo glucans ngoại bào từ sucrose Tuy nhiên nhiều loại vi khuẩn có thể tổng hợp polysaccharide như glucans hoặc destrans lại không thể gây sang thương sâu răng Có lẽ có nh ng

yếu tố khác ảnh hưởng đến độc lực của S.mutans Người ta nhận thấy, S.mutans

chứa nh ng phân tử polypeptide có thể tạo liên kết đồng hóa trị, đó có thể là phương tiện để vi khuẩn bám dính vào bề mặt răng

1.3.2.3 Streptococcus sanguinis

Streptococcus sanguinis là một chủng vi khuẩn Gram (+) Chủng vi khuẩn

này có khả năng hô hấp, sản xuất và chống chịu với H2O2 Chủng vi khuẩn này cũng có hoạt tính các enzyme NADH oxidase và superoxide dismutase cao, gợi ý

rằng chính các enzyme này ñã tham gia vào quá trình bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi tổn thương do axit và H2O2

1.3.2.4 Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh)

- Đặc điểm hình thái: trực khuẩn Gram (-),có một lông ở một đầu, không sinh nha bào

- Hô hấp: hiếu khí tuyệt đối;

- Đặc điểm nuôi cấy: dễ phát triển trong môi trường nuôi cấy thông thường, thích hợp nhất ở pH = 7,2-7,5; nhiệt độ = 37°C

+ Môi trường canh thang: tạo váng trên bề mặt;

+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc nhỏ, màu xanh, bề mặt nhẵn hoặc xù

1.3.2.5 Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng)

- Đặc điểm hình thái : cầu khuẩn Gram (+) mọc thành từng đám, không hình thành nha bào, không di động

- Hô hấp : hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện

- Đặc điểm nuôi cấy : dễ phát triển trên môi trường nuôi cấy thông thường

+ Môi trường canh thang : sau 5-6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ có hiện tượng lắng cặn ;

+ Môi trường thạch thường: khuẩn lạc tương đối tròn, mép đều đặn, màu vàng sẫm

- Khả năng gây bệnh: có thể gây nhiễm khuẩn ngoài da, nhiễm trùng huyết, nhiễm độc thức ăn, viêm ruột cấp…

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Một số chế phẩm có chứa nano bạc dùng trong y tế được bào chế tại Khoa Nghiên cứu & phát triển – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương, bao gồm:

Bảng 2.2 Các mẫu nghiên cứu

pha chế

Thể tích

Mẫu 3 NSM1 Nước súc miệng nano bạc 5 ppm 10/2016 2 lít Mẫu 4 NSM2 Nước súc miệng nano bạc 5 ppm 12/2016 2 lít

Bảng 2.3 Công thức cho 3 lít hỗn dịch nano bạc 1000 ppm

2 Natri tetrahydroborat (NaBH4) 1,06 gam

Bảng 2.4 Công thức cho 1 lít dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm

STT Tên nguyên liệu Số lượng

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

- Staphylococcus aureus ATCC 6538

- Streptococcus mutans ATCC 700610

- Streptococcus sanguinis ATCC 10556

 Vi nấm:

- Candida albicans ATCC 10231

2.2.3 Hóa chất, dung môi

- Bạc nitrat (Merck, Đức)

- Acid nitric tinh khiết AAS (Merck, Đức);

- Nước cất, nước trao đổi ion đạt tiêu chuẩn DĐVN IV;

2.2.4 Môi trường nuôi cấy VSV

 Môi trường thạch Casein đậu tương (Soyabean Casein Digest Agar)

Casein thủy phân bởi pancreatin 15,0 g

Đậu tương thủy phân 5,0 g

pH 7,3 ± 0,2

 Môi trường thạch Sabouraud (Sabouraud Dextrose Agar)

Hỗn hợp của Pepton và đậu tương

thủy phân bởi pancreatin (1:1) 5,0 g

2.2.5 Thiết bị, dụng cụ

2.2.5.1 Thiết bị :

Các thiết bị định kỳ được hiệu chuẩn đạt tiêu chuẩn GLP và ISO 17025

- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS HITACHI Z-5000 có trang bị đèn catod rỗng, đầu đốt sử dụng ngọn lửa acetylen – không khí nén

- Kính hiển vi điện tử quét FE-SEM Hitachi S-4800

- Cân phân tích Mettler Toledo AB 204S có độ chính xác 0,1mg

- Máy đo pH

- Nồi hấp Hyrayana, nồi hấp Tomy

- Tủ ấm Memmert BP 600

- Máy lắc Vortex Genie2

- Tủ an toàn sinh học (Biosafety cabinet)

- Tủ sấy Memmert ULE 600

2.2.5.2 Dụng cụ

Bình định mức, pipet chính xác, bình nón, cốc và các dụng cụ thủy tinh khác đạt tiêu chuẩn dùng cho phòng thí nghiệm phân tích

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm

2.3.1.1 Kiểm nghiệm hình dạng và kích thước nano bạc bằng SEM

- Tiến hành kiểm nghiệm với kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM), loại kính hiển vi tạo ảnh với độ phân giải cao nhờ chùm điện tử

hẹp quét trên bề mặt mẫu Việc tạo ảnh mẫu vật được thực hiện bằng ghi nhận và phân tích bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu vật

- Lựa chọn tốc độ quét ảnh, điều kiện xử lý mẫu, độ phóng đại nhằm thu được hình ảnh rõ nét của các tiểu phân bạc, để có thể xác định kích thước của các tiểu phân nhỏ nhất, lớn nhất và tỷ lệ các tiểu phân hình cầu trên tổng số tiểu phân trên vi trường

2.3.1.2 Định tính, định lượng nano bạc bằng AAS

 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho định tính, định lượng nano bạc bằng AAS

Tiến hành khảo sát chọn điều kiện phân tích thích hợp nhằm định tính, định lượng được bạc trong các mẫu nghiên cứu trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Các điều kiện cần khảo sát bao gồm:

- Khảo sát lựa chọn nồng độ acid;

- Khảo sát lựa chọn độ rộng khe;

- Khảo sát lựa chọn tốc độ khí;

- Khảo sát chiều cao đầu đốt

 Đánh giá phương pháp định tính, định lượng nano bạc bằng AAS [5] [19] [35]

- Độ đặc hiệu của phương pháp

Tạo mẫu placebo với các thành phần tá dược tương tự như ở trong chế phẩm,

nhưng không có hoạt chất Tiến hành đo so sánh các mẫu: mẫu placebo, mẫu thử, mẫu chuẩn

Yêu cầu: Mẫu thử phải có vạch hấp thụ ở bước sóng 328,1 nm tương ứng với vạch hấp thụ của bạc trong dung dịch bạc chuẩn Đồng thời, mẫu placebo phải không có vạch hấp thụ ở bước sóng 328,1 nm

- Khoảng tuyến tính

Chuẩn bị dãy 5 – 7 dung dịch chuẩn bạc trong dung dịch acid nitric Tiến hành đo độ hấp thụ theo các thông số đo đã khảo sát Mối tương quan gi a độ hấp thụ và nồng độ dung dịch chuẩn được biểu diễn bằng phương trình và hệ số tương quan hồi quy

Yêu cầu: đường hồi qui thu được phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan phải không nhỏ hơn 0,995

- Độ lặp lại

Tiến hành phân tích ở mức nồng độ 100% với 6 mẫu thử độc lập của cùng một chế phẩm, tính toán hàm lượng Ag tìm lại được Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị RSD (%);

Yêu cầu: RSD không lớn hơn 3%

- Độ đúng

Xác định trên mẫu tự tạo Khảo sát với 3 nồng độ của mẫu tự tạo: thêm chuẩn ở các mức 80%, 100% và 120% so với hàm lượng trên nhãn vào hỗn hợp tá dược như trong công thức của thành phẩm Ở mỗi mức nồng độ của mẫu tự tạo, tiến hành thực nghiệm 3 phép thử riêng biệt

Yêu cầu: độ thu hồi (được phản ánh qua tỷ lệ phần trăm gi a kết quả định lượng so với hoạt chất cho vào) phải đạt từ 95% đến 105% (đối với hỗn dịch nano bạc 1000 ppm) và từ 80% đến 110% (đối với dung dịch nước súc miệng nano bạc 5 ppm)

2.3.1.3 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn

Phương pháp tiếp xúc được sử dụng trong đánh giá tác dụng diệt khuẩn của các sản phẩm nano bạc