Nghiên cứu phân lập, bảo quản, hoạt hóa và đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc mô mỡ tự thân đối với bệnh nhân thoái hoá khớp gối

Ở Việt Nam, ứng dụng tế bào gốc mô mỡ tự thân điều trị thoái hóa khớp gối tuy đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu nhưng mới chỉ dừng ở giai đoạn thử nghiệm ban đầu, chưa có các nghiên cứ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÕNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

*********

TẠ VIỆT HƢNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, BẢO QUẢN, HOẠT HÓA

VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ CỦA TẾ BÀO GỐC

MÔ MỠ TỰ THÂN ĐỐI VỚI BỆNH NHÂN

THOÁI HÓA KHỚP GỐI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÕNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

*********

TẠ VIỆT HƢNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, BẢO QUẢN, HOẠT HÓA

VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ CỦA TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ

TỰ THÂN ĐỐI VỚI BỆNH NHÂN THOÁI HÓA KHỚP GỐI

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám đốc Học viện Quân y; Phòng Sau đại học – Học viện Quân y; Bộ môn Sinh lý bệnh – Học viện Quân y, cơ sở đào tạo đã tạo mọi điều kiện và sự giúp đỡ chí tình để tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám đốc Bệnh viện Quân y

103, đơn vị công tác đã cho phép và động viên giúp đỡ tôi tiến bước trên con đường học tập

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

- PGS.TS Nguyễn Lĩnh Toàn và PGS.TS Nguyễn Thị Phi Nga, người Thầy đã hướng dẫn trực tiếp, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án, đồng thời là người Thầy đã định hướng và truyền cho tôi lòng say mê và những kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

- Các Thầy, các Cô trong Hội đồng chấm luận án đã dành nhiều thời gian và công sức chỉ bảo giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thiện bản luận án này

- PGS.TS Trần Viết Tiến, Giám đốc Bệnh viện Quân y 103 - Chủ nhiệm

đề tài cấp Nhà nước cùng toàn thể các thành viên tham gia đề tài đã tận tình giúp đỡ và hợp tác để tôi có thể hoàn thành luận án

- Tập thể bác sĩ, điều dưỡng viên Khoa Khớp và Nội tiết, Bệnh viện Quân y 103 đã động viên và hỗ trợ nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện

đề tài luận án

- Tập thể cán bộ và nhân viên Bộ môn Khoa Huyết học – Truyền máu, Bệnh viện Quân y 103 đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Xin được chân thành cảm ơn các bạn bè và đồng nghiệp đã luôn giúp

đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với bố mẹ và anh chị em trong gia đình, đặc biệt là vợ và hai con đã luôn là chỗ dựa vững chắc của tôi, luôn thương yêu, khuyến khích, động viên và tạo điều kiện tốt nhất về tình cảm, tinh thần và vật chất cho tôi để hoàn thành tốt chương trình học tập và thực hiện thành công luận án này

Hà Nội, tháng 06 năm 2017

Tác giả

Tạ Việt Hƣng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu trong luận án là một phần số liệu trong đề tài độc lập cấp Nhà nước, mã số ĐTĐL.2012 G/21: “Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc tự thân trong điều trị bệnh thoái hóa khớp” Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu tập thể mà tôi là một thành viên chính Tôi đã được Chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề tài này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác

Hà Nội, tháng 06 năm 2017

Tạ Việt Hƣng

1.1.1 Khái niệm chung và phân loại 3

1.2.1 Cấu trúc, chức năng và thành phần của mô mỡ 8 1.2.2 Khái niệm chung về tế bào gốc mô mỡ 9 1.2.3 Các đặc tính của tế bào gốc mô mỡ 11

1.3.3 Các phương pháp điều trị thoái hóa khớp 26

1.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng tế bào gốc mô mỡ tự thân trong

điều trị thoái hóa khớp gối

34

1.4.1 Trên thế giới 35

2.2.4 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 46 2.2.5 Thu thập và xử lý số liệu 59 2.2.6 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 59

3.2 Kết quả phân lập, bảo quản và hoạt hóa tế bào gốc mô mỡ 66

3.2.1 Kết quả chọc hút mô mỡ và phân lập SVF 66 3.2.2 Chất lượng tế bào gốc mô mỡ sau phân lập và bảo quản 67 3.2.3 Kết quả hoạt hóa TBG mô mỡ bằng HTGTC và ánh sáng đơn

sắc lên một số hoạt động của TBG trên in vitro

3.3.3 Tính an toàn của phương pháp điều trị thoái hóa khớp bằng

TBG mô mỡ tự thân hoạt hóa bởi HTGTC tự thân và ánh sáng đơn sắc

87

4.3 Đánh giá hiệu quả điều trị của TBG mô mỡ tự thân đối với

bệnh nhân thoái hóa khớp gối

106

4.3.1 Đánh giá hiệu quả lâm sàng 108 4.3.2 Đánh giá hiệu quả cận lâm sàng 112 4.3.3 Đánh giá tính an toàn của phương pháp điều trị thoái hóa

khớp bằng TBG mô mỡ tự thân hoạt hóa bởi HTGTC tự thân và ánh

sáng đơn sắc

118

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACD Acid citric Citrat natri Dextrose

ACR American Collegue of Rheumatology (Hội thấp khớp

học Mỹ)

ADAMTS A Disintegrin and Metalloproteinase with

Thrombospondin Motifs

ADSC Adipose derived stem cells (tế bào gốc mô mỡ)

BMI Body Mass Index (chỉ số khối cơ thể)

CFU Colony Forming Unit (đơn vị tạo cụm)

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethyl sulfoxide

FBS Fetal Bovine Serum

HTGTC Huyết tương giàu tiểu cầu

IGF Insulin like Growth Factor (yếu tố tăng trưởng giống

Insulin)

IL Interleukin

MMP Matrix Metalloproteinase

MSC Mesenchymal stem cell (tế bào gốc trung mô)

mPGES-1 microsomal Prostaglandin E Synthase-1

NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory drugs (thuốc chống

viêm không steroid)

PRP Platelet Rich Plasma (huyết tương giàu tiểu cầu)

SVF Stromal vascular fraction (phân đoạn tế bào nền mạch

TIMP Tissue Inhibitor Metalloproteinase

TNF Tumor Necrosis Factor (yếu tố hoại tử khối u)

VAS Visual Analog Scale (thang hiển thị loại suy đo mức độ

đau)

WOMAC The Western Ontario and McMaster Universities

Osteoarthritis Index (thang điểm đo mức độ cải thiện chức năng vận động của khớp)

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Đặc điểm về tuổi, giới của các đối tượng nghiên cứu 60

3.2 So sánh chỉ số khối cơ thể của các đối tượng nghiên cứu 61

3.3 Thời gian phát hiện bệnh và giai đoạn bệnh 61

3.4 So sánh thang điểm VAS và thang điểm WOMAC 62

3.5 So sánh mức độ đau theo thang điểm VAS giữa hai nhóm 63

3.6 So sánh mức độ rối loạn chức năng vận động theo thang

điểm WOMAC giữa hai nhóm

63

3.7 So sánh các chỉ số hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và tốc độ

máu lắng giữa hai nhóm

64

3.8 So sánh các chỉ số sinh hóa giữa hai nhóm 64

3.9 Giai đoạn tổn thương khớp trên hình ảnh Xquang của hai

nhóm

64

3.10 Các chỉ tiêu đánh giá sụn khớp trên MRI của hai nhóm 65

3.11 Kết quả phân lập SVF từ mô mỡ (n = 42) 66

3.12 Tỷ lệ tế bào sống của SVF sau phân lập và bảo quản (n = 42) 67

3.13 Mức độ biểu hiện dấu ấn bề mặt CD90, CD105, CD13,

CD34, CD45, HLA-DR trên tế bào nuôi cấy sau cấy chuyển

lần 3 (P3) (n=6)

70

3.14 Khả năng bám dính của TBG mô mỡ hoạt hóa và không hoạt 72

hóa bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc (n = 42)

3.15 Khả năng tạo CFU-F của TBG mô mỡ hoạt hóa và không

hoạt hóa bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc (n = 6)

73

3.16 Số lượng tế bào trung bình mỗi lần tiêm 74

3.17 Điểm đau theo thang điểm VAS tại các thời điểm theo dõi 74

3.18 Biến đổi mức độ đau theo thang điểm VAS theo thời gian

theo dõi của nhóm nghiên cứu (n = 84)

75

3.19 Đặc điểm rối loạn chức năng vận động theo thang điểm

WOMAC theo thời gian theo dõi

76

3.20 Biến đổi mức độ rối loạn chức năng vận động theo thang

điểm WOMAC theo thời gian theo dõi của nhóm nghiên cứu

77

3.21 Số lượng bạch cầu theo thời gian theo dõi 78

3.22 Tốc độ máu lắng theo thời gian theo dõi 78

3.23 Đặc điểm tràn dịch khớp trên siêu âm theo thời gian theo dõi 78

3.24 Giai đoạn tổn thương khớp trên Xquang theo thời gian theo

dõi

79

3.25 Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại lồi cầu trong xương đùi

trên MRI theo thời gian theo dõi

79

3.26 Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại lồi cầu ngoài xương đùi

trên MRI theo thời gian theo dõi

80

3.27 Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại mâm chày trong trên MRI

theo thời gian theo dõi

81

3.28 Thay đổi độ dầy sụn trung tâm tại mâm chày ngoài trên MRI

theo thời gian theo dõi

81

3.29 Thay đổi chỉ số Circularity tại lồi cầu trong xương đùi trên

MRI theo thời gian theo dõi

81

3.30 Thay đổi chỉ số Circularity của sụn tại lồi cầu ngoài xương

đùi trên MRI theo thời gian theo dõi

82

3.31 Thay đổi chỉ số Circularity của sụn tại mâm chày trong trên

MRI theo thời gian theo dõi

83

3.32 Thay đổi chỉ số Circularity của sụn tại mâm chày ngoài trên

MRI theo thời gian theo dõi

83

3.33 Mức độ tổn thương đại thể sụn khớp trước và sau điều trị 85

3.34 Mức độ tổn thương vi thể sụn khớp trước và sau điều trị 85

3.35 Sự phục hồi tổn thương sụn khớp BN BV103-37 86

3.36 Biến đổi chỉ hồng cầu và tiểu cầu ở hai nhóm 88

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

3.1 Tỷ lệ các nhóm nghề nghiệp ở các đối tượng nghiên cứu 62

3.2 Tỷ lệ tế bào sống của SVF trước và sau khi bảo quản 67

3.3 Biến đổi điểm đau theo thang điểm VAS theo thời gian

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.2 Cơ chế bệnh sinh trong bệnh THK gối (Howell 1988) 19

1.3 Sinh bệnh học phân tử của thoái hóa khớp 20

1.4 Tín hiệu FGF-2 trong tế bào sụn khớp 24

1.5 PKCδ là nút tín hiệu của nhiều con đường gây THK 25

2.2 Thước đánh giá thang điểm đau VAS: mặt bệnh nhân quan

2.12 Ly tâm, chuyển lớp huyết tương và buffy coat 50

2.13 Hoạt hóa HTGTC bằng Calcium Activator Solution 50

2.14 Hoạt hóa TBG mô mỡ và HTGTC tự thân bằng máy chiếu

AdiLight 2

51

2.15 Máy Cytomics FC500 (Beckman Coulter – Hoa Kỳ) 51

2.16 Phân tích tổn thương sụn khớp trên MRI bằng phần mềm

Image-J

55

2.17 Kỹ thuật tiêm TBG mô mỡ và HTGTC vào khớp gối 58

3.1 Các sản phẩm của quá trình phân lập TBG mô mỡ 68

3.4 Kết quả phân tích biểu hiện một số dấu ấn bề mặt của TBG

mô mỡ sau khi cấy chuyển lần 3 (P3)

71

3.6 Khả năng tạo CFU-F của 6 mẫu TBG mô mỡ hoạt hóa và

không hoạt hóa bằng HTGTC và ánh sáng đơn sắc

73

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thoái hóa khớp là một bệnh hay gặp trong các bệnh về xương khớp và được xem là nguyên nhân hàng đầu gây đau đớn và tàn phế ở người lớn tuổi tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới Năm 2010, ở Mỹ có trên 27 triệu người mắc bệnh thoái hóa khớp trong khi ở Anh là trên 8 triệu người [52] Bệnh lý này có đặc điểm là tăng dần tình trạng thoái hóa của sụn khớp và phần xương dưới sụn Trong các khớp của cơ thể, khớp gối là vị trí thoái hóa thường gặp nhất [24] Tình trạng đau đớn và mất chức năng liên quan tới thoái hóa khớp gối ảnh hưởng xấu tới chất lượng cuộc sống, hạn chế khả năng lao động và những hoạt động sinh hoạt thường ngày của bệnh nhân

Trái ngược với sự tiến triển tăng dần của bệnh lý thoái hóa khớp gối, cho đến nay vẫn còn rất ít biện pháp điều trị hữu hiệu có tác dụng ngăn chặn căn bệnh này Phần lớn các biện pháp như dùng thuốc giảm đau, chống viêm

và bổ xung dịch khớp chỉ có tác dụng điều trị triệu trứng cho người bệnh mà không giải quyết được quá trình tiến triển của bệnh thoái hóa khớp Can thiệp ngoại khoa như nội soi cắt bỏ gai mâm chày, phục hồi các dây chằng, cấy sụn, thay khớp… có thể đưa tới các biến chứng sau phẫu thuật như tắc mạch, nhiễm khuẩn hay xa hơn là lỏng khớp Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm ra một phương pháp mới, thực sự tác động tới quá trình phục hồi sụn là một việc làm cấp thiết nhằm đem lại kết quả cao trong điều trị bệnh

Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy công nghệ tạo các mô với việc

sử dụng tế bào gốc phôi hoặc tế bào gốc trưởng thành có tiềm năng điều trị to lớn, đặc biệt các tế bào gốc trưởng thành tự thân phù hợp về miễn dịch không gây những vấn đề đạo đức như sử dụng tế bào gốc phôi và đã được chứng minh là an toàn [32] Hiện nay tế bào gốc trưởng thành có thể được lấy từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó mô mỡ được coi là một nguồn rất tiềm năng

và dễ thực hiện để phân lập tế bào gốc dùng trong điều trị Các nghiên cứu

đầu tiên được triển khai tại Hàn Quốc và Úc tiêm trực tiếp tế bào gốc tự thân

từ mô mỡ vào khớp để điều trị thoái hóa khớp gối và khớp háng cho thấy biện pháp điều trị này an toàn và bước đầu có hiệu quả tốt cho người bệnh [88], [120] Huyết tương giàu tiểu cầu cũng đã được sử dụng tương đối rộng rãi trong điều trị thoái hóa khớp nhờ tác dụng của các yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu Bên cạnh đó hoạt hóa quang bằng ánh sáng đơn sắc năng lượng thấp cũng có tác dụng kích thích các quá trình tăng sinh và biệt hóa của tế bào gốc

Ở Việt Nam, ứng dụng tế bào gốc mô mỡ tự thân điều trị thoái hóa khớp gối tuy đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu nhưng mới chỉ dừng ở giai đoạn thử nghiệm ban đầu, chưa có các nghiên cứu hệ thống về số lượng và chất lượng của tế bào gốc mô mỡ ở bệnh nhân thoái hóa khớp gối sau phân lập, bảo quản, hoạt hóa bằng huyết tương giàu tiểu cầu tự thân và ánh sáng đơn sắc (nuôi cấy phân lập chọn lọc và tăng sinh tế bào gốc mô mỡ, phân tích dấu ấn bề mặt tế bào, khả năng bám dính của tế bào gốc mô mỡ được hoạt

hóa và không hoạt hóa, khả năng tạo CFU-F trên in vitro…) cũng như đánh

giá hiệu quả điều trị và tính an toàn của phương pháp Do đó, chúng tôi tiến

hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập, bảo quản, hoạt hóa và đánh giá hiệu

quả điều trị của tế bào gốc mô mỡ tự thân đối với bệnh nhân thoái hoá khớp gối” nhằm hai mục tiêu:

1 Xác định một số đặc điểm của tế bào gốc mô mỡ ở bệnh nhân thoái hóa khớp gối sau phân lập, bảo quản và hoạt hóa bằng huyết tương giàu tiểu cầu tự thân và ánh sáng đơn sắc

2 Đánh giá hiệu quả điều trị bệnh nhân thoái hoá khớp gối bằng tế bào gốc mô mỡ tự thân

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1 NHỮNG HIỂU BIẾT CƠ BẢN VỀ TẾ BÀO GỐC

1.1.1 Khái niệm chung và phân loại

Tế bào gốc (stem cell) là một loại tế bào đặc biệt, duy nhất có khả năng

tự tái tạo, sinh ra những tế bào giống hệt chúng và biệt hoá thành những loại

tế bào chuyên biệt trong những điều kiện nhất định

Tế bào gốc (TBG) thể hiện khả năng tự thay mới (self renewal) và biệt hóa (differentiation) bằng cách phát triển tạo ra hai loại tế bào con khác nhau Loại tế bào con thứ nhất sẽ sinh sản bằng cách phân bào nhiều lần để tạo ra các tế bào tiền thân (progenitors) và tiếp tục biệt hóa để trở thành các tế bào trưởng thành Loại tế bào con thứ hai vẫn ở trạng thái không hoạt động ban đầu, chúng giữ nguyên kiểu hình TBG và tất cả những khả năng của tế bào

mẹ ban đầu cho tới khi có những tín hiệu hoặc hiện tượng kích hoạt mới xảy

ra để đáp ứng tăng sinh biệt hóa Hiện tượng này có vai trò rất quan trọng vì nếu tất cả tế bào con đều trở thành tế bào tiền thân thì nguồn TBG sẽ dần dần

bị cạn kiệt sau mỗi lần hoạt hóa và nhanh chóng làm suy giảm số lượng TBG cần thiết để hỗ trợ quá trình đổi mới, hồi phục và sửa chữa mô trong suốt cuộc đời [6], [9]

Tế bào gốc có thể có nguồn gốc từ phôi, bào thai hoặc từ những cá thể trưởng thành có các đặc tính chung nhưng khác nhau về khả năng tăng sinh và biệt hóa

Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell)

Năm 1998, James Thomson lần đầu tiên phân lập được một loại TBG phôi tại khối tế bào bên trong của phôi nang (blastocyt) có được nhờ thụ tinh nhân tạo vì mục đích nghiên cứu Cùng thời gian đó, Jonhn Gearhart cũng

tách được một loại TBG khác gọi là tế bào mầm phôi (embryonic germ cell)

từ phôi 6 tuần tuổi Hai loại tế bào này đều có những đặc tính cơ bản chung của TBG nhưng lại khác nhau về tiềm năng tăng sinh tự tái tạo mà không biệt hóa khi nuôi cấy trong ống nghiệm TBG phôi người có khả năng biệt hóa tạo

ra tẩt cả các tế bào có nguồn gốc phát triển từ ba lá phôi như tế bào thần kinh,

tế bào cơ tim, tế bào tạo xương, tế bào gan, tế bào tiền thân tạo máu [6], [13], [15]

Tế bào gốc thai (fetal stem cell)

Các TBG thai được thu nhận từ các mô của thai bỏ hay các phần phụ của thai nhi sau khi sinh như: máu dây rốn, màng bao dây rốn, nước ối, mô nhau thai, máu nhau thai… Dòng TBG trung mô từ thai có thể phân chia 20-

40 lần, có thể biệt hóa thành dòng trung mô xương và sụn, các tế bào tạo máu

và tế bào thần kinh [9], [13]

Tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell)

Là những TBG có trong các mô của cơ thể sau khi sinh Giống như những tế bào gốc khác, TBG trưởng thành có khả năng tạo clon, tự thay mới

và biệt hóa thành những dòng tế bào khác nhau TBG trưởng thành có ở nhiều

mô, có khả năng duy trì, sinh sản và thay thế những tế bào chuyên biệt do quá trình thay thế mô sinh lý hoặc phá hủy mô do bệnh lý [6], [13] TBG trưởng thành có thể sinh ra những loại tế bào chuyên biệt của mô mà mô đó chính là nguồn gốc nguyên ủy của nó Gần đây nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng những TBG của một cơ quan tổ chức có thể tạo ra những tế bào biệt hóa vượt quá ranh giới mô riêng của chúng, hiện tượng này được gọi là tính “mềm dẻo” (plasticity) Khả năng này cho phép chúng có thể biệt hóa vượt qua những giới hạn dòng tế bào, giới hạn mô và giới hạn của những lớp mầm TBG chuyên biệt của một mô có thể biệt hóa thành tế bào của một mô khác gọi là “chuyển biệt hóa” (transdifferentiation) và ngược lại những tế bào đã được biệt hóa có thể đảo ngược tình trạng đã biệt hóa, thay đổi căn bản kiểu hình để thực hiện

một chức năng khác, được gọi là biệt hóa ngược (dedifferentiation) [2], [13] Những phát hiện này có thể đem lại tiềm năng lớn trong việc điều trị các mô

bị bệnh hoặc tổn thương bằng sử dụng TBG tự thân từ một mô lành của cơ thể

và làm thay đổi những phương pháp điều trị ghép tổ chức và tái tạo tổ chức

TBG trưởng thành có mặt trong nhiều tổ chức của cơ thể, tuy nhiên với một số lượng rất ít Ngược lại những TBG của thai phân bố không giống như vậy, chúng chỉ có ở một số vị trí, trong một số tổ chức nhất định của thai [2] TBG thai có thể phát triển trong môi trường nuôi cấy sau khi chúng được tách

ra từ phôi hoặc thai Tùy theo điều kiện của môi trường nuôi cấy mà những TBG thai có thể tạo nên những cụm tế bào có thể biệt hoá tự nhiên tạo ra nhiều loại tế bào Nếu như những TBG thai trong nuôi cấy chưa biệt hoá được tiêm vào cơ thể chuột đã bị làm tổn thương hệ thống miễn dịch sẽ tạo nên khối u lành tính chứa hỗn hợp những tế bào đã biệt hoá một phần ở những con chuột này [2], [85] Hiện tượng đó không thấy đối với TBG của cá thể trưởng thành Những TBG ở cá thể trưởng thành có trong các tổ chức bình thường như não, tuỷ xương, ruột thường chỉ có thể sản xuất ra những tế bào đặc hiệu cho loại tổ chức cội nguồn của chúng Những TBG của một cá thể trưởng thành khi tách khỏi vi môi trường bình thường của cơ thể, đưa vào môi trường nuôi cấy thì khả năng biệt hoá bị hạn chế hơn rất nhiều so với những TBG của thai Chưa thấy một loại TBG nào của cá thể trưởng thành lại có khả năng biệt hoá thành những tế bào có nguồn gốc từ cả ba lá mầm phôi Điều đó chứng tỏ TBG của cá thể trưởng thành không có cùng mức độ đa tiềm năng so với những TBG phôi và thai

Những TBG có nguồn gốc khác nhau cũng không giống nhau về khả năng phát triển trong môi trường nuôi cấy TBG thai người có thể tạo ra trong phòng thí nghiệm với một số lượng rất phong phú và có thể tăng sinh nhưng vẫn giữ nguyên trạng thái chưa biệt hoá qua nhiều thế hệ Trên thực tế nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng, khả năng tạo ra một số lượng lớn tế bào từ một

TBG thai sẽ hết sức có ý nghĩa Những thông tin về định hướng biệt hoá TBG bào thai thành những tế bào chuyên biệt có những chức năng đặc hiệu chủ yếu

dựa trên những nghiên cứu ở những dòng tế bào thai chuột hoặc người nuôi cấy

in vitro Ngược lại những hiểu biết về biệt hoá của TBG ở các cá thể trưởng

thành có được là nhờ quan sát trên những mô hình cấy ghép hỗn hợp các tế bào gốc trên động vật thực nghiệm Tuy nhiên, đối với những TBG trưởng thành rất khó có thể tìm ra được những điều kiện thích hợp trong phòng thí nghiệm để cho những TBG này có thể tăng sinh mà không biệt hoá

Chức năng chính của TBG trong các mô trưởng thành là sửa chữa và tái tạo các mô nơi chúng cư trú Các TBG trưởng thành có khả năng tự tái tạo ra chính nó và biệt hóa thành ít nhất một loại tế bào trưởng thành Trong điều kiện bình thường, các TBG phân chia để tạo thành các tế bào tiền thân, các tế bào tiền thân này tùy theo từng mô mà trải qua một số lần phân chia tế bào và quá trình biệt hóa để tạo nên một mạng lưới các tế bào trưởng thành [13]

1.1.2 Cách gọi tên tế bào gốc

1.1.2.1 Theo tiềm năng biệt hóa

- Tế bào gốc toàn năng (totipotent): là loại TBG xuất hiện đầu tiên của

cơ thể người khi trứng được thụ tinh với tinh trùng, ở giai đoạn phôi dâu (blastomeres) Các tế bào này có tiềm năng cao nhất để biệt hóa thành tất cả các tế bào, qua đó hình thành được một bào thai hoàn chỉnh [13]

- Tế bào gốc vạn tiềm năng (pluripotent): là các tế bào được phân lập từ khối tế bào bên trong (inner cell mass - ICM) ở giai đoạn phôi nang (blastocyst) Trừ tế bào màng nuôi, tế bào gốc vạn tiềm năng có khả năng biệt hóa thành những tế bào thuộc cả ba lá phôi (trung bì, nội bì và ngoại bì) - nguồn gốc của tất cả các tế bào có chức năng chuyên biệt của cơ thể sau này Các TBG vạn tiềm năng không biệt hóa tạo ra tế bào màng nuôi nên từ các TBG này không có khả năng hình thành một bào thai hoàn chỉnh

- Tế bào gốc đa tiềm năng (multipotent): là các tế bào có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, được phân lập từ mô đã biệt hóa nguồn gốc thai hoặc cơ thể trưởng thành Các tế bào được tạo thành nằm trong một

hệ tế bào có liên quan mật thiết, ví dụ chỉ tạo nên các tế bào máu (bao gồm hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu), hoặc chỉ tạo nên các tế bào của hệ thống thần kinh Thường thì các TBG trưởng thành như TBG tạo máu, TBG thần kinh chỉ có tính đa tiềm năng; nhưng trong những điều kiện nhất định, chúng vẫn

có thể chuyển biệt hóa và trở nên có tính vạn tiềm năng

- Tế bào gốc vài tiềm năng (oligopotent), bốn tiềm năng (quadripotent),

ba tiềm năng (tripotent), hai tiềm năng (bipotent), đơn tiềm năng (unipotent)

là các TBG định cư hoặc các tế bào tiền thân tồn tại trong các mô thai hoặc cơ thể trưởng thành Các tế bào này có tiềm năng biệt hóa hạn chế, chỉ tạo ra một hoặc vài dòng tế bào nhất định Ví dụ: tế bào tiền thân dòng tủy, tế bào tiền thân trung mô, tế bào tiền thân thần kinh đệm…

1.1.2.2 Theo vị trí phân lập tế bào

- Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell - ESC): là TBG được phân lập

ở ngày thứ 6 của giai đoạn phôi nang (blastocyt), tại khối tế bào bên trong (ICM) Đây là loại TBG vạn tiềm năng có khả năng biệt hóa tạo ra tẩt cả các

tế bào có nguồn gốc phát triển từ ba lá phôi [13]

- Tế bào mầm phôi (embryonic germ cell - EGC): là các TBG được thu nhận từ mào sinh dục (genital ridge) của phôi tuần thứ 6, là TBG vạn tiềm năng và được coi là nguồn gốc biệt hóa thành các tế bào sinh dục Khả năng tăng sinh của tế bào mầm phôi ít hơn so với tế bào gốc phôi, trong 2 năm nó phân chia khoảng 40-80 lần so với 300-450 lần của TBG phôi [6]

- Tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell): là TBG được phân lập từ các mô trưởng thành trong cơ thể: tủy xương, máu, giác mạc, gan, da, dạ dày,

mô mỡ, tụy… TBG trưởng thành bao gồm tế bào gốc dòng sinh dưỡng

(somatic line) và dòng sinh dục (germ line) Các TBG này có khả năng tạo clon, tự đổi mới và biệt hóa thành những dòng tế bào khác nhau

1.1.2.3 Theo kiểu tế bào biệt hóa

Tế bào gốc cũng được gọi theo kiểu biệt hóa của chúng như: TBG cơ tim sẽ biệt hóa thành tế bào cơ tim, TBG xương biệt hóa thành tế bào xương, TBG tạo máu sẽ biệt hóa thành các tế bào máu… Một số tác giả cho rằng những TBG chỉ tạo ra một hay vài tế bào (như cách gọi trên) là những tế bào tiền thân (progenitor cell), hay cơ chất (precursor cell) vì chúng chỉ biệt hóa

mà không có khả năng tự làm mới Các ý kiến khác lại cho rằng, tế bào tiền thân là tế bào ít tiềm năng (nhiều tiềm năng, vài tiềm năng…) nhưng vẫn được gọi là TBG [13]

1.2 TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ

1.2.1 Cấu trúc, chức năng và thành phần của mô mỡ

Mô mỡ là mô liên kết mềm, chứa collagen gắn kết các tế bào với nhau thành mạng lưới với cấu trúc được chia thành thùy bởi những mạch máu nhỏ Chức năng chính của mô mỡ là dự trữ chất béo dưới hình thức triglycerid và làm nhiệm vụ đệm lót bảo vệ cơ thể Ngoài ra mô mỡ còn thực hiện chức năng như một cơ quan nội tiết thông qua việc sản xuất ra một số hormon như Adiponectin, Resistin, Angiotensin, Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), TNFα, IL-6, Leptin, Estradiol (E2) [13]

Mô mỡ chủ yếu nằm dưới da và bao quanh các nội tạng Trong hệ da,

mô mỡ định cư ở mức độ sâu nhất của da, tạo thành một lớp mỡ dưới da có tác dụng cách nhiệt Còn đối với các cơ quan nội tạng, mô mỡ bao quanh như vật đệm có vai trò bảo vệ Ở động vật có hai loại mô mỡ: mô mỡ nâu (brown adipose tissues - BAT) và mô mỡ trắng (white adipose tissues - WAT) Tùy theo loài mà có số lượng và sự phân bố khác nhau Mô mỡ nâu gặp chủ yếu ở trẻ sơ sinh hoặc động vật có vú ngủ đông Về hình thái nó có màu đậm do mật

độ ty thể cao trong bào tương, vai trò chính là sinh nhiệt cho cơ thể Mô mỡ

trắng gặp ở động vật có vú Ở người, mô mỡ trắng chiếm khoảng 20% trọng lượng cơ thể (ở nam) và 25% (ở nữ) [13] Tế bào mỡ trưởng thành của mô mỡ trắng là giọt lipít lớn và rất ít nguyên sinh chất, nhân nằm ở rìa tế bào, chứa một không bào lớn, ít ty thể Tùy thuộc vào vị trí cư trú mà mô mỡ trắng có chức năng chuyên biệt Mô mỡ trắng ở các cơ quan bụng và ngực (không bao gồm tim), gọi là mỡ nội tạng, có chức năng tiết cytokin viêm và do đó liên quan đến các quá trình viêm tại chỗ và toàn thân Mô mỡ trắng ở cơ xương tiết ra acid béo tự do, interleukin-6 (IL-6) và yếu tố hoại tử u-α (tumor necrosis factor α - TNFα), đóng vai trò quan trọng trong sự đề kháng insulin

Mô mỡ trắng ở mô tim tiết nhiều cytokin trong các phản ứng viêm tại chỗ và hóa hướng viêm, ảnh hưởng tới sự phát triển xơ vữa động mạch và tăng huyết

áp tâm thu của cơ thể Mô mỡ trắng ở thận đóng vai trò trong việc tái hấp thu natri và do đó có thể ảnh hưởng đến thể tích máu nội mạch và gây bệnh cao huyết áp

Mô mỡ trắng có nhiều chức năng bao gồm cách nhiệt, đệm cơ học, dự trữ năng lượng carbon dư thừa dưới dạng triacylglycerol và là trung gian cân bằng glucose nội môi Mô mỡ trắng cũng đóng vai trò quan trọng như một cơ quan nội tiết/miễn dịch bằng cách tiết adipokin như các cytokin viêm, yếu tố

bổ trợ, chemokin và protein giai đoạn cấp tính Chức năng nội tiết của mô mỡ trắng điều khiển sự thèm ăn, chuyển hóa năng lượng, chuyển hóa glucose và lipid, quá trình viêm, hình thành mạch và các chức năng sinh sản

Thành phần tế bào của mô mỡ bao gồm các tế bào mỡ trưởng thành, tế bào tiền tạo mỡ, nguyên bào sợi, tế bào cơ trơn mạch máu, tế bào nội mô mạch máu, tế bào quanh mạch, các đại thực bào và tế bào lympho Trong số các tế bào của mô mỡ, phân đoạn tế bào nền mạch máu (stromal vascular fraction - SVF) được quan tâm nhiều trong nghiên cứu TBG, vì đây là nguồn cung cấp các TBG đa tiềm năng [13], [56], [57], [80], [107], [117]

1.2.2 Khái niệm chung về tế bào gốc mô mỡ

Năm 1973, các tác giả đã báo cáo phương pháp phân tách và đặc tính sinh học của quần thể tế bào nền từ mô mỡ, tuy nhiên tính đa tiềm năng của chúng mới chỉ được xác nhận vào những năm đầu của thiên niên kỷ [20], [116], [117], [118]

Năm 2001, Patricia Zuk và nhóm nghiên cứu của Đại học California (Hoa Kỳ) phát hiện thấy sản phẩm chọc hút mỡ sau khi rửa với dung dịch PBS và phân hủy với 0,075% collagenase thu được dung dịch giàu tế bào giống nguyên bào sợi cùng với lượng lớn các tế bào quanh mạch, tế bào nội

mô và các tế bào cơ trơn Quần thể tế bào này có thể được duy trì in vitro

trong thời gian dài với khả năng gấp đôi quần thể ổn định và mức lão hóa

thấp Thêm vào đó chúng có thể biệt hoá in vitro thành các tế bào mỡ, tế bào

sụn, tế bào cơ và tế bào xương khi được cảm ứng bằng các chất chuyên biệt Tiếp sau đó, những công bố khác đã góp phần khẳng định tiềm năng của các TBG từ mô mỡ người có khả năng biệt hoá thành dòng cơ, sụn, thần kinh dưới các điều kiện thích hợp [13], [56], [116, [118]

Tùy theo cách thu hoạch mô mỡ, phân lập tế bào mà có những thuật ngữ khác nhau về các tế bào tiền thân đa tiềm năng từ mô mỡ như: tế bào thu được từ chọc hút mỡ (processed lipoaspirate cells - PLA cells), phân đoạn tế bào nền mạch máu (stromal vascular fraction - SVF), tế bào nền thu được từ

mô mỡ (adipose tissue derived stromal cells - ADSCs), tế bào tiền thân tạo

mỡ (preadipocyte) và một số tên gọi khác Do các TBG thu được từ mô mỡ chủ yếu là các TBG trung mô, phân đoạn tế bào này đôi khi còn được gọi là tế bào gốc trung mô thu được từ mô mỡ (adipose tissue derived mesenchymal stem cells - ATMSCs) Đây là các tế bào có hình dạng giống như nguyên bào sợi là hình thái đặc trưng của TBG trung mô, giống với các TBG trung mô thu được từ các mô khác [13], [80], [117] Năm 2004, tại hội nghị thường niên lần thứ 2 của liên đoàn quốc tế liệu pháp mỡ IFATS (the International Federation

of Adipose Therapeutics and Sciences), các tác giả đã thống nhất sử dụng

thuật ngữ “tế bào nền/gốc mô mỡ” (adipose-derived stromal/stem cells - ASCs) để chỉ quần thể tế bào từ mô mỡ có khả năng bám dính bề mặt nhựa nuôi cấy, nuôi cấy tăng sinh và mang tính đa tiềm năng [19], [56], [80], [116]

Mô mỡ chứa số lượng lớn các tế bào đa tiềm năng, là điều kiện cần thiết hàng đầu cho liệu pháp TBG Số lượng các TBG và tiền thân trong phân đoạn tế bào nền mạch máu từ mô mỡ chiếm khoảng 3% tổng số tế bào, cao gấp 2.500 lần so với các tế bào gốc trong tủy xương Ở tủy xương, số lượng tế bào có nhân sau phân lập khoảng 6x106

1.2.3 Các đặc tính của tế bào gốc mô mỡ

1.2.3.1 Khả năng tiết các cytokin

TBG mô mỡ được coi như một chất trung gian của quá trình tái tạo mô thông qua việc tiết ra các yếu tố hòa tan đặc biệt TBG mô mỡ tiết ra nhiều yếu tố tăng trưởng, bao gồm: yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi cơ bản (basic fibroblast growth factor - bFGF), yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (vascular endothelial growth factor - VEGF), yếu tố tăng trưởng giống Insulin

1 (insulin-like growth factor 1 - IGF-1), các yếu tố tăng trưởng tế bào gan (hepatocyte growth factors - HGF), yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF) và yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β1 (transforming growth factor- TGF-β1) Các yếu tố này rất cần thiết cho quá trình tạo mạch, chống oxy hóa

và điều hòa miễn dịch, vì vậy mà nó có vai trò to lớn trong việc tái tạo mô, đặc biệt là ở các bệnh nhân cấy ghép và thiếu máu cục bộ [56], [57], [107], [108]

Ngoài khả năng tiết các cytokin, TBG mô mỡ còn biểu lộ nhiều thụ thể yếu tố tăng trưởng như: PDGF α và β (PDGF receptors α and β), VEGF, HGF, EGF và bFGF [69], [103], [108] Vì thế nên TBG mô mỡ đáp ứng rất

nhạy cảm khi tiếp xúc với các yếu tố tăng trưởng, qua đó thúc đẩy sự tăng sinh và tái tạo mô một cách hiệu quả hơn Kaewsuwan và CS đã nghiên cứu tác dụng của 6 yếu tố tăng trưởng trên tới sự tăng sinh của TBG mô mỡ, thấy rằng PDGF-BB có tác dụng kích thích cao nhất ở nồng độ 10 ng/mL và tín hiệu tương tác giữa PDGF-BB với thụ thể PDGF- β có tác dụng kích thích mạnh TBG mô mỡ [67], [108]

1.2.3.2 Marker bề mặt của tế bào gốc mô mỡ

Hiện nay, các phương pháp sử dụng để phân lập TBG mô mỡ chủ yếu dựa trên sự phân hủy của collagenase với dịch hút mỡ, sau đó ly tâm tách các

tế bào ra khỏi các tế bào mỡ nguyên thủy Quần thể tế bào SVF khi nuôi cấy

sẽ lựa chọn được TBG mô mỡ nhờ sự bám dính của chúng giống như các TBG trung mô khác Vì TBG mô mỡ có các phân tử bám dính trên bề mặt tế bào, do vậy trong điều kiện nuôi cấy ngoài cơ thể, các tế bào này có khả năng bám đơn lớp vào bề mặt nhựa nuôi cấy và có hình dạng giống nguyên bào sợi [21], [41]

Bảng 1.1 Các dấu ấn trên bề mặt của TBG mô mỡ

Gần đây, liên đoàn quốc tế về liệu pháp mỡ (International Federation of Adipose Therapeutics and Sciences - IFATS) và Hội liệu pháp tế bào quốc tế (International Society for Cellular Therapy - ISCT) đã đưa ra 3 tiêu chuẩn tối thiểu định nghĩa TBG mô mỡ của người Thứ nhất, TBG mô mỡ có khả năng bám dính vào bề mặt nhựa khi nuôi cấy Thứ hai, TBG mô mỡ biểu hiện các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu (bảng 1.1) Thứ ba, TBG mô mỡ có khả năng

biệt hóa in vitro thành nguyên bào xương (osteoblasts), tế bào mỡ (adipocyte)

và nguyên bào sụn (chondroblasts) [26], [41] Với kiểu hình này, các TBG thu được từ mô mỡ thỏa mãn đặc tính của TBG trung mô Do vậy, nhiều tác giả gọi TBG thu được từ mô mỡ là TBG trung mô [13], [80]

So sánh TBG mô mỡ với TBG trung mô từ tủy xương (bone derived mesenchymal stem cells - BMSCs), De Ugarte và CS (2003) cho rằng dường như hai quần thể tế bào này tương tự nhau, chỉ có một vài khác biệt nhỏ chủ yếu là kiểu biểu hiện các phân tử bám dính, từ đó tác giả đã giả thuyết rằng, TBG mô mỡ và TBG trung mô từ tủy xương là hai tiểu nhóm TBG trung mô Sự khác biệt một số dấu ấn của chúng có lẽ do môi trường sống đem lại [40] Nhìn trên phương diện thực hành, phân lập TBG mô mỡ đơn giản hơn từ tủy xương, vì chỉ cần gây tê cục bộ thì đã có thể hút được

marrow-số lượng tế bào lớn hơn (khoảng 4x107

tế bào/100 mL mỡ chọc hút so với 1x105 tế bào/30 mL dịch tủy xương) Hơn thế nữa, nhìn trên phương diện khả năng tăng sinh và biệt hóa thành các dòng tế bào khác nhau, nghiên cứu của Zhu và CS (2008) cho rằng TBG mô mỡ tốt hơn so với TBG trung

mô từ tủy xương [115] Vì vậy, mô mỡ đại diện cho một nguồn TBG phong phú, thiết thực và hấp dẫn cho y học tái tạo

1.2.3.3 Khả năng điều hòa miễn dịch

Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy TBG mô mỡ ảnh hưởng tới

hệ thống miễn dịch của cơ thể Tính chất ức chế miễn dịch của TBG mô mỡ

đã được chứng minh in vitro thông qua ức chế cả sự tăng sinh tế bào lympho

và giảm sản xuất các cytokin tiền viêm, kích thích sản xuất các cytokin kháng viêm Chúng cũng ức chế sản xuất kháng thể từ các tế bào lympho B và ức chế hoạt động của các tế bào trình diện kháng nguyên đuôi gai Ngoài ra còn

có bằng chứng tương tự từ một số nghiên cứu in vivo cho thấy, chúng làm

giảm phản ứng trong bệnh ghép chống chủ, cấy ghép da và ghép tim đồng loài [85], [95]

TBG mô mỡ sản xuất ra các phân tử kháng viêm như IL-10, IL-1 receptor antagonist (IL-1ra), indoleamine 2,3-dioxygenase, transforming growth factor (TGF-β) và prostaglandin E2 Trong các nghiên cứu gần đây cho thấy, TBG mô mỡ có khả năng ức chế miễn dịch rất cao trong khu vực viêm mà không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố được tiết ra từ tổ chức này Chức năng điều hòa miễn dịch của TBG mô mỡ tăng lên mạnh mẽ khi các đại thực bào hoạt hóa tiết ra các cytokin như interferon-γ, TNFα và IL-1α/β; từ đó làm tăng sản xuất một loạt các yếu tố ức chế khác [34], [110]

1.2.3.4 Khả năng biệt hóa in vitro của tế bào gốc mô mỡ

Hình 1.1 Khả năng biệt hóa của TBG mô mỡ

* Nguồn: Gir P, Plastic and Reconstructive Surgery, (2012) [57]

TBG mô mỡ là TBG có khả năng biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khi được nuôi cấy trong môi trường chọn lọc với các chất cảm ứng chuyên biệt

[108], [117] Các nghiên cứu in vitro đã chứng minh trong từng môi trường

cảm ứng TBG mô mỡ có xu hướng biệt hóa theo nhiều hướng riêng biệt, không chỉ tạo nên các tế bào thuộc trung bì phôi (tế bào mỡ, tế bào xương, tế bào sụn, tế bào cơ, nguyên bào sợi) mà còn tạo thành các tế bào có nguồn gốc ngoại bì phôi và nội bì phôi như tế bào thần kinh, tế bào gan, tế bào tụy, nội

tiết, nội mô, cơ tim [108], [118] Khả năng biệt hóa in vitro tạo ra tế bào mỡ,

tế bào xương và tế bào sụn đã được ISCT chọn là một trong ba tiêu chuẩn tối thiểu để khẳng định tập hợp tế bào thu được sau phân lập, nuôi cấy từ nhiều nguồn là tập hợp các TBG trung mô (mesenchymal stem cells - MSCs) [41]

Ngoài cách nhận biết các tế bào TBG mô mỡ dựa trên hình thái và các dấu ấn bề mặt, một cách khác để nhận biết quần thể tế bào TBG mô mỡ là dựa vào khả năng của chúng có thể biệt hóa thành xương, mỡ và sụn trong môi trường nuôi cấy chuyên biệt

Biệt hóa tạo tế bào mỡ

TBG mô mỡ có thể biệt hóa hình thành các tế bào mỡ khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy hỗn hợp chứa isobuthylmethylxanthin, insulin, indomethacin Sẽ có sự tích lũy các hạt giàu mỡ bên trong tế bào sau 7 ngày biệt hóa, và các tế bào bộc lộ peroxisome proliferation activated receptor γ2 (PPAR-γ2), lipoprotein lipase, fatty acid-binding protein aP2 và glucose transporter týp 4 [55], [108] Cuối cùng các hạt mỡ kết hợp với nhau và chiếm toàn bộ tế bào Sự tích lũy mỡ trong các hạt được xác định bằng phương pháp hóa mô với thuốc nhuộm Oil red O [92]

Biệt hóa tạo tế bào xương

TBG mô mỡ có thể biệt hóa hình thành các nguyên bào xương (osteoblasts) khi môi trường nuôi cấy trong ống nghiệm có bổ sung 1,25 dihydroxy vitamin D3, acid ascorbic, β-glycerophosphate, BMP (bone

morphogenetic protein) và dexamethasone trong 2-4 tuần [92], [108] Sau biệt hóa, các tế bào TBG mô mỡ có sự lắng đọng can xi làm tăng biểu hiện alkaline phosphate và được phát hiện qua nhuộm Alizarin đỏ hoặc von - Kossa. Ngoài ra

có thể xác định kết quả biệt hóa tạo tế bào xương bằng cách phân tích sự biểu hiện một số protein đặc trưng khác như: osteocalcin, bone sialoprotein, osterix, runx2 [26]

Biệt hóa tạo tế bào sụn

Để biệt hóa tạo tế bào sụn, TBG mô mỡ được nuôi cấy có bổ xung các tác nhân như: TGF-β1 (transforming growth factor β1), BMP 6 (bone morphogenetic protein 6), dexamethason, insulin, ascorbate-2-phosphat [108] Các tế bào này sẽ phát triển thành nhiều lớp có hình thái giàu chất đệm, và các phân tích mô học cho thấy khả năng bắt màu mạnh với thuốc nhuộm toluidine blue, chứng tỏ chất đệm ngoại bào rất giàu glycosaminoglycan TBG mô mỡ sau biệt hóa có biểu hiện một số các protein đặc trưng như: collagen týp II, aggrecan, sox 9 [26]

1.3 BỆNH THOÁI HÓA KHỚP

1.3.1 Định nghĩa và dịch tễ học bệnh thoái hóa khớp

Thoái hóa khớp (THK) là hậu quả của quá trình cơ học và sinh học làm mất cân bằng giữa tổng hợp và huỷ hoại của sụn và xương dưới sụn Sự mất cân bằng này có thể được bắt đầu bởi nhiều yếu tố như di truyền, phát triển, chuyển hoá và chấn thương THK liên quan đến tất cả các mô của khớp động, cuối cùng biểu hiện bởi các thay đổi về mặt hình thái, sinh hoá, phân tử và cơ sinh học của tế bào và chất căn bản của sụn dẫn đến nhuyễn hoá, nứt loét và mất sụn khớp, xơ hoá xương dưới sụn, tạo gai xương và hốc xương dưới sụn THK là một bệnh hay gặp trong các bệnh về xương khớp Ở các nước đang phát triển, THK là bệnh khớp phổ biến nhất, nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tàn phế Trong các khớp của cơ thể, khớp gối là vị trí THK thường gặp nhất [24] Tình trạng đau đớn và mất chức năng liên quan tới THK gối ảnh hưởng

xấu tới chất lượng cuộc sống, hạn chế khả năng lao động và những hoạt động sinh hoạt thường ngày của bệnh nhân Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới cho thấy có 0,3 đến 0,5% dân số bị bệnh lý về khớp, trong đó THK chiếm 20% và THK gối hay gặp chiếm 12,57% Ở Mỹ có hơn 13% số người ở độ tuổi từ 55 đến 64 tuổi, và hơn 17% số người ở độ tuổi từ 65 đến 74 tuổi bị đau

và mất hoạt động, liên quan tới bệnh THK [5] Khoảng 100.000 bệnh nhân ở

Mỹ không thể đi lại được do bệnh nặng THK gối là nguyên nhân gây tàn tật cho người già đứng thứ 2 sau bệnh tim mạch Ước tính đến năm 2030, có khoảng 25% người trưởng thành ở Mỹ bị THK có thể bị tàn tật ở các mức độ khác nhau [73] Ở Pháp, bệnh THK chiếm 28,6% các bệnh về xương khớp, ước tính có tới 3,4 triệu người tới điều trị bệnh THK mỗi năm Tỷ lệ này ở Trung Quốc là 280-300 người/100.000 dân Khoảng 13% phụ nữ và 10% nam giới ở tuổi trên 60 có triệu chứng của THK gối và tỷ lệ này sẽ ngày càng tăng lên do dân số già đi cũng như sự phát triển của hiện tượng thừa cân trong các cộng đồng [114] 25% số người trên 55 tuổi có đau khớp gối và 10% cộng đồng này đau khớp gối ảnh hưởng rõ đến việc đi lại [39] Tỷ lệ THK gối ở nam thấp hơn nữ, ngoài ra ở phụ nữ, nhất là lứa tuổi trên 55 khi mắc bệnh thường có triệu chứng nặng hơn nam giới nhất là sau mãn kinh Trong một tiến cứu có sự tham gia của các nhà lâm sàng kết hợp với chẩn đoán hình ảnh bắt đầu năm 1996 (sau đó có sự hỗ trợ của cộng hưởng từ) khi các đối tượng được khám lại vào năm 2007 và 2008 thì tỷ lệ đau vừa đến nặng ở khớp gối từ 3,7% sau 11 năm đã trở thành 26,7% với tỷ lệ mắc bệnh cũng như mức độ nặng của các triệu chứng cao hơn ở nữ giới [104] Tuy nhiên đối với những cộng đồng nghiên cứu khác nhau, phương pháp chẩn đoán khác nhau, các nghiên cứu cũng đưa ra các tỷ lệ mắc bệnh khác nhau

Tại Việt Nam, theo thống kê tình hình bệnh khớp ở bệnh viện Bạch Mai có khoảng 10,4% số bệnh nhân đến khám và điều trị vì bệnh THK trong

đó THK gối chiếm khoảng 13% tổng số bệnh nhân THK, tỷ lệ này gần đây có

xu hướng ngày càng tăng [1, [8].Theo nghiên cứu tại Bệnh viện E trong năm

2004 cho thấy, số bệnh nhân THK chiếm 20,25%, trong đó THK gối là 9,07% trong tổng số các bệnh nhân mắc bệnh khớp điều trị nội trú Bệnh viện Chợ Rẫy trong 3 năm số bệnh nhân vào viện THK chiếm 27,2 % tổng số các ca bệnh khớp [4] Thoái hóa khớp hầu như không gây nguy hiểm đến tính mạng nhưng ảnh hưởng rất nhiều đến sinh hoạt và lao động của bệnh nhân do giảm

* Thuyết cơ sinh học: trong các hoạt động lao động và sinh hoạt, sụn cũng

như các thành phần khác của khớp phải chịu lực tì nén cũng như các xung lực, các tác động cơ học đó có thể tạo nên các vi gãy ở bề mặt sụn, làm suy yếu mạng lưới collagen và hư hỏng các cấu trúc proteoglycan Proteoglycan có độ keo thấp và rất

ưa nước Khả năng thải nước và hút nước khi tăng hoặc giảm tải khiến sụn có khả năng hấp thu xung lực Sự bất thường trong cấu trúc của các protein này sẽ làm giảm chức năng của sụn và dẫn đến THK

* Thuyết tế bào: các chấn thương gây nên vi gẫy và quá trình viêm có thể

tạo ra các “mảnh vỡ”, bình thường được các đại thực bào làm sạch Đến một lúc,

số lượng các “mảnh vỡ” này vượt quá khả năng làm sạch của đại thực bào, lúc này chúng sẽ trở thành các chất trung gian gây viêm, kích thích tế bào sụn tiết ra các enzym tiêu protein gây thoái biến chất căn bản sụn khớp Bên cạn đó, các đại thực bào ở màng hoạt dịch tăng cường tiết ra các cytokin tiền viêm Cả IL-1 và TNF đều gây tăng tổng hợp prostaglandin từ các tế bào màng hoạt dịch và làm cho quá trình viêm ngày càng nặng thêm

Hình 1.2 Cơ chế bệnh sinh trong bệnh THK gối (Howell 1988) [8]

Trong điều kiện sinh lý bình thường, sụn khớp duy trì một trạng thái cân bằng giữa tổng hợp và thoái hóa các thành phần của chất căn bản bao gồm collagen týp II và aggrecan, một loại proteoglycan có nhiều nhất trong

sụn khớp [99] Tuy nhiên, trong THK, sự cân bằng đó bị phá vỡ, quá trình dị

hóa chiếm ưu thế hơn so với đồng hóa dẫn đến mất dần mô sụn, các tế bào

thưa thớt ở vùng sụn yếu, tăng kích thích trạng thái oxy hóa trong tế bào, và

cuối cùng dẫn tới tế bào chết theo chương trình [73]

Hình 1.3 Sinh bệnh học phân tử của thoái hóa khớp

* Nguồn: Lee A.S, Gene, (2013) [73]

Cùng với tiến triển bệnh, sự oxy hóa các phân tử nội và ngoại bào tiếp

tục làm rối loạn ổn định nội mô sụn và thúc đẩy quá trình dị hóa thông qua

cảm ứng từ các tế bào chết [64] Lúc này, các tế bào sụn bị hoạt hóa bất

thường sẽ sản xuất quá mức các cytokin tiền viêm (ví dụ IL-1), các enzym

thoái hóa chất căn bản (MMPs, aggrecanases) và các yếu tố tăng trưởng dị

hóa (ví dụ FGF-2) Cùng với những mảnh vỡ từ thoái hóa chất căn bản, chúng

có mặt trong hoạt dịch như những chất gây cảm ứng dị hóa, kích thích các tế

bào màng hoạt dịch (nguyên bào sợi, đại thực bào) tăng cường tổng hợp các

cytokin và enzym tiêu hủy protein, tác động trở lại đến màng hoạt dịch và sụn

khớp và làm cho vòng xoắn bệnh lý ngày càng trầm trọng Để đối phó với

tình trạng mất sụn, quá trình tu sửa xương xảy ra dẫn đến xơ xương dưới sụn

và hình thành gai xương (hình 1.3) Những thay đổi sinh lý bệnh của các tế bào màng hoạt dịch mở đường cho sự hình thành mạch máu và dây thần kinh,

là một phần giải thích cho cơ chế đau trong THK

Nhiều chất trung gian hóa học đóng vai trò quan trọng trong cả hai con đường thoái hóa và nhận cảm đau liên quan tới sự tiến triển của THK Ví dụ như các yếu tố tiền viêm trong nhóm interleukin (IL-1, IL-6, IL-17), yếu tố hoại tử u α (TNF-α) và prostaglandin E2 (PGE2) Các chất trung gian này không chỉ kích thích sản xuất các enzym tiêu protein gây ra thoái hóa chất căn bản, mà còn góp phần vào con đường gây đau trong THK [73]

1.3.2.1 Interleukin-1 (IL-1)

IL-1 là một trong những cytokin có liên quan đến THK được nghiên cứu nhiều nhất, nó đóng vai trò nổi bật trong cả thoái hóa sụn khớp và kích thích các con đường nhận cảm đau IL-1 ức chế tổng hợp chất căn bản và thúc đẩy phân hủy sụn, kìm hãm sự biểu hiện các thành phần thiết yếu của chất căn bản (aggrecan và collagen týp II) trong các tế bào sụn, tạo ra một môi trường hoạt động của các enzym tiêu protein như matrix metalloproteinase (MMP-1, MMP-13) và ADAMTS-4 (a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs), ở cả tế bào sụn và nguyên bào sợi màng hoạt dịch Bên cạnh những tác động trực tiếp, IL-1β còn gián tiếp tạo ra một loạt các cytokin khác như IL-6, IL-8 và yếu tố cảm ứng bạch cầu (leukemia inducing factor - LIF); chúng tương tác lẫn nhau gây nên những tác dụng phụ hoặc tác dụng hiệp đồng trong dòng thác dị hóa IL-1β cũng đã được chứng minh là kích hoạt trực tiếp các bộ phận nhận cảm đau thông qua hoạt hóa các kinase nội bào, và cũng có thể gây ra cảm ứng nhận cảm đau một cách gián tiếp qua việc sản xuất các kinin và prostanoid [73], [102]

Vai trò của IL-1 trong THK tiếp tục được khẳng định qua các nghiên

cứu in vivo với việc sử dụng chất đối kháng receptor IL-1 (IL-1ra) như một

yếu tố điều trị tiềm năng để ngăn chặn thoái hóa sụn Là một chất ức chế phân

tử IL-1β, IL-1ra không chỉ cho thấy hiệu quả trong các mô hình THK ở động vật, mà còn cải thiện tốt kết quả điều trị lâm sàng [45], [73]

1.3.2.2 TNF-α

TNF-α cũng là một cytokin có khả năng tác động tới các tế bào sụn để kích thích chúng tăng sản xuất ra các enzym proteinase làm giáng hoá chất căn bản của sụn khớp Xét về mặt tác dụng, IL-1 mạnh gấp nhiều lần so với TNF-α, tuy nhiên hai cytokin này lại có khả năng đồng vận mạnh mẽ Nếu chỉ tiêm riêng một mình IL-1 tái tổ hợp vào trong khớp của chuột cống, chuột nhắt, hoặc thỏ, thì cũng đủ để kích thích hoạt động phá huỷ sụn khớp Nhưng nếu tiêm vào trong khớp của các động vật nói trên đồng thời cả IL-1 và TNF-

α thì mức độ phá huỷ mô sụn sẽ tăng cao hơn so với khi chỉ tiêm riêng một trong hai loại cytokin này Các công trình nghiên cứu về bệnh viêm khớp dạng thấp cho thấy, TNF-α chi phối quá trình viêm cấp tính, trong khi IL-1 đóng vai trò chủ đạo trong việc duy trì quá trình viêm và quá trình phát sinh tổn thương loét ở sụn khớp Người ta cho rằng còn cần phải thực hiện thêm nhiều các nghiên cứu hơn nữa để có thể xác định xem liệu hiệu quả đồng vận của các cytokin có được mở rộng tới cả THK hay không [49]

Ngoài tác dụng dị hóa mạnh trong cơ chế bệnh sinh của THK, TNF-α còn kích hoạt trực tiếp các tế bào thần kinh cảm giác thông qua các thụ thể TNFR1 và TNFR2, và khởi động một loạt các phản ứng viêm thông qua sản xuất IL-1, IL-6 và IL-8 [102] Tác động trực tiếp của TNF-α ở ngoại vi gây ra cơn đau thần kinh, và cơn đau này có thể bị ngăn chặn bởi các thuốc chống viêm như Ibuprofen và celecoxib [101] Điều trị kháng TNF-α bằng kháng thể kháng TNF làm giảm cơn đau kéo dài trong THK và sự trung hòa của TNF-α

ở chuột đã cải thiện được cả chứng tăng cảm đau cũng như quá trình viêm [73]

1.3.2.3 IL-6

IL-6 là một cytokin tiền viêm quen thuộc khác, liên quan tới quá trình thoái hóa sụn, cũng như chứng tăng cảm giác đau và quá mẫn trong các mô khớp IL-6 đóng một vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của viêm khớp dạng thấp, và nồng độ của nó tăng cao trong huyết thanh và hoạt dịch của bệnh nhân viêm khớp Điều thú vị là, các tế bào thần kinh hướng tâm chính cũng đáp ứng với IL-6, cho thấy vai trò của IL-6 trong việc dẫn truyền đau trong trạng thái viêm khớp Thật vậy, nhiều nghiên cứu cũng đã làm sáng tỏ các vai trò tiềm năng của IL-6 trong con đường gây đau liên quan đến THK [27], [73]

1.3.2.4 Prostanoids và PGE2

Trong giai đoạn tiền viêm của sụn khớp, nhiều sản phẩm của enzym prostanoid cyclooxygenase (COX) được tổng hợp và ly giải, bao gồm: PGE2, PGD2, PGF2a, thromboxan và PGI2 Sự hoạt hóa COX sẽ làm tăng cường sản xuất enzym MMP-3, ức chế sự tổng hợp proteoglycan và collagen, kích

thích tế bào sụn chết theo chương trình [73]

Trong số các chất trung gian này, PGE2 được coi là nguyên nhân chính dẫn đến đau do viêm trong viêm khớp PGE2 tương tác thông qua nhiều thụ thể E prostanoid (EP) như (EP1, EP2, EP3, EP4), có mặt ở tế bào thần kinh cảm giác ngoại biên và tủy sống [42] IL-1β kích thích sản xuất ra một lượng lớn PGE2, gây nên tình trạng đau đớn và suy thoái sụn trong THK Mặt khác,

về phương diện hóa sinh, IL-1β được ghi nhận là làm tăng biểu lộ hoạt tính của enzym COX-2 và enzym mPGES-1 (microsomal prostaglandin E synthase-1) tại mRNA Điều đó chứng tỏ rằng, trong THK, IL-1β không chỉ kích thích tăng tổng hợp PGE2 mà còn làm tăng cả mPGES -1 và COX-2 nữa Qua một số nghiên cứu cho thấy, PGE2 gây ra các tác dụng dị hóa xuôi dòng,

là con đường trung gian gây đau thông qua tác dụng kích thích các yếu tố liên quan đến đau như IL-6 và enzym oxid nitric synthetase cảm ứng (iNOS) Hơn

nữa, khi kết hợp với cytokin dị hóa IL-1, PGE2 điều hòa tăng cả IL-6 và

iNOS mRNA in vitro [27], [58], [73], [74]

1.3.2.5 FGF-2 và PKCδ

Hình 1.4 Tín hiệu FGF-2 trong tế bào sụn khớp

* Nguồn: Lee A.S, Gene, (2013) [73]

Các nghiên cứu của Li và CS (2012) đã cho thấy vai trò dị hóa và

chống đồng hóa mạnh của FGF-2 trong sự ổn định nội mô sụn người FGF-2

được giải phóng nhiều trong quá trình chịu tải trọng và/hoặc tổn thương của

sụn khớp, nó hoạt hóa nhiều các con đường truyền tín hiệu (MAPKs) như

ERK, p38 và JNK Những kinase này lần lượt phosphoryl hóa một loạt các

yếu tố phiên mã để điều chỉnh sự biểu hiện gen và thay đổi chức năng tế bào,

dẫn đến giảm tổng hợp proteoglycan và ức chế các yếu tố tăng trưởng đồng

hóa, như yếu tố tăng trưởng giống insulin 1 (IGF-1) và protein hình thái

xương (BMP-7) trong sụn khớp FGF-2 kích thích mạnh mẽ biểu hiện của

MMP-13, enzym chính làm suy thoái collagen týp II Con đường tín hiệu