PHÂN lập và ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ức CHẾ của VI KHUẨN VÙNG rễ đối với VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM gây BỆNH THỐI củ GỪNG TRONG điều KIỆN IN VITRO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG HUỲNH THỊ THÚY VÂN PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CỦA VI KHUẨN VÙNG RỄ ĐỐI VỚI VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM GÂY BỆ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

HUỲNH THỊ THÚY VÂN

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CỦA VI

KHUẨN VÙNG RỄ ĐỐI VỚI VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM GÂY BỆNH THỐI CỦ GỪNG

(ZINGIBER OFFICINALE ROSC.) TRONG ĐIỀU KIỆN IN

VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT

Cần Thơ, 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CỦA VI

KHUẨN VÙNG RỄ ĐỐI VỚI VI KHUẨN RALSTONIA

SOLANACEARUM GÂY BỆNH THỐI CỦ GỪNG

(ZINGIBER OFFICINALE ROSC.) TRONG ĐIỀU KIỆN IN

VITRO

Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS Trần Vũ Phến Huỳnh Thị Thúy Vân

MSSV: 3083897

Lớp: BVTV K34

Cần Thơ, 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Chứng nhận luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo vệ Thực vật với đề tài:

“PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CỦA

VI KHUẨN VÙNG RỄ ĐỐI VỚI VI KHUẨN RALSTONIA

SOLANACEARUM GÂY BỆNH THỐI CỦ GỪNG

(ZINGIBER OFFICINALE ROSC.) TRONG ĐIỀU KIỆN

IN VITRO”

Do sinh viên Huỳnh Thị Thúy Vân thực hiện

Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày tháng 2 năm 2012 Cán bộ hướng dẫn

TS Trần Vũ Phến

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật với tên:

“PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CỦA

VI KHUẨN VÙNG RỄ ĐỐI VỚI VI KHUẨN RALSTONIA

SOLANACEARUM GÂY BỆNH THỐI CỦ GỪNG

(ZINGIBER OFFICINALE ROSC.) TRONG ĐIỀU KIỆN

IN VITRO”

Do sinh viên Huỳnh Thị Thúy Vân thực hiện và bảo vệ trước hội đồng

Ý kiến của hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:

Luận văn tốt nghiệp hội đồng đánh giá ở mức:

Chủ tịch Hội Đồng

1996 - 2001: học tiểu học tại trường tiểu học Phong Hòa

2001 - 2005: học THCS tại trường THCS Phong Hòa

2005 - 2008: học THPT tại trường THPT Lai Vung 2

2008 - 2012: học Đại học tại trường Đại học Cần Thơ, ngành Bảo vệ thực vật khóa

34, khoa Nông nghiệp và Sinh học ưng dụng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hướng dẫn, các số liệu kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp này là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào trước đây

Người thực hiện

Huỳnh Thị Thúy Vân

Anh Trần Văn Nhã, chị Trần Thị Thúy Ái và các anh chị trong bộ môn Bảo

vệ Thực vật đã đóng góp những ý kiến quý báu và tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt thí nghiệm

Thành thật cảm ơn,

Chị Nguyễn Thị Thanh Nhàn lớp Trồng Trọt K33, các anh học lớp Trồng Trọt k33 và Nông Học k33, cùng các bạn lớp Bảo vệ thực vật K34 đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Trân trọng!

Huỳnh Thị Thúy Vân

MỤC LỤC

Lược sử cá nhân i

Lời cam đoan ii

Lời cảm tạ iii

Mục lục iv

Danh sách chữ viết tắt vii

Danh sách bảng viii

Danh sách hình ix

Tóm lược x

Mở đầu 1

CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

1.1 Sơ lược về cây gừng 2

1.2 Bệnh héo xanh thối củ gừng do vi khuẩn Ralstonia solanacearum 2

1.2.1 Triệu chứng bệnh 2

1.2.2 Đặc tính mầm bệnh 3

1.2.3 Sự xâm nhập, phát sinh và phát triển bệnh .4

1.2.4 Sự lưu tồn của mầm bệnh 4

1.2.5 Các biện pháp phòng trừ 5

1.3 Vi sinh vật vùng rễ và khả năng kích thích tăng trưởng cây trồng 5

1.3.1 Vi sinh vật vùng rễ 5

1.3.2 Vi sinh vật ngoại sinh vùng rễ 6

1.3.3 Vi sinh vật nội sinh rễ 6

1.3.4 Một số tác động của PGPR đối với cây trồng 7

1.3.4.1 Các cơ chế trực tiếp 7

1.3.4.2 Các cơ chế kiểm soát sinh học bệnh 10

1.4 Các nghiên cứu về ứng dụng vi sinh vật vùng rễ vào kiểm soát bệnh 13

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

2.1 Phương tiện 16

2.1.1 Thời gian và địa điểm 16

2.1.2 Vật liệu và thiết bị 16

2.2 Phương pháp 17

2.2.1 Điều tra thu mẫu 17

2.2.2 Phân lập vi khuẩn chi Bacillus 18

2.2.3 Xác định nhóm vi khuẩn bằng cách nhuộm Gram và quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học 18

2.2.4 Thí nghiệm 1: khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ chọn lọc sơ khởi với vi khuẩn Ralstonia solanacearum 19

2.2.5 Thí nghiệm 2 : Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ có triển vọng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh thối củ gừng 20

2.2.6 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng phân giải lân của các mẫu VKVR có khả năng đối kháng với R solanacearum 21

2.2.7 Thí nghiệm 4: Đánh giá cơ chế đối kháng của một số chủng vi khuẩn có triển vọng theo cơ chế tiết siderophore 21

2.2.8 Thí nghiệm 5: Khảo sát đặc điểm hình thái của các VKVR có triển vọng trong kiểm soát bệnh thối củ gừng 22

2.3 Phân tích số liệu 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Phân lập vi khuẩn vùng rễ và nội sinh rễ 23

3.2 Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh thối củ gừng 23

3.3 Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn có triển vọng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh thối củ gừng 27

3.3.1 Thời điểm 24 giờ sau khi thử 27

3.3.2 Thời điểm 48 giờ sau khi thử 28

3.3.3 Thời điểm 72 giờ sau khi thử 30

3.4 Khả năng hoà tan lân khó tan của các chủng vi khuẩn vùng rễ 32

3.5 Khả năng tiết siderophore của các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh R solanacearum 34

3.6 Khảo sát đặc điểm của các chủng vi khuẩn có đối kháng 36

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 39

4.1 Kết luận 39

4.2 Đề nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ CHƯƠNG

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH BẢNG

3.1 Đặc điểm phân lập của các vi khuẩn vùng rễ có biểu hiện đối

kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum qua thí nghiệm sơ

khởi

24

3.2 Khả năng ức chế của 21 chủng vi khuẩn vùng rễ đối với vi

khuẩn Ralstonia solanacearum

26

3.3 Khả năng ức chế sự phát triển 3 chủng vi khuẩn R

solanacearum của 10 chủng vi khuẩn vùng rễ ở 24 giờ sau thí

nghiệm

28

3.4 Khả năng ức chế sự phát triển 3 chủng vi khuẩn R

solanacearum của 10 chủng vi khuẩn vùng rễ ở 48 giờ sau thí

nghiệm

29

3.5 Khả năng ức chế sự phát triển 3 chủng vi khuẩn R solanacearum

của 10 chủng vi khuẩn vùng rễ ở 72 giờ sau thí nghiệm

30

3.6 Khả năng phân giải lân của 10 chủng vi khuẩn vùng rễ có đối

kháng mạnh với vi khuẩn R solanacearum

33

đối kháng mạnh đối với vi khuẩn R solanacearum

36

DANH SÁCH HÌNH

2.1

Phương pháp trắc nghiệm khả năng đối kháng của vi khuẩn

vùng rễ đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên môi

trường King’s B có agar

nhiệt và không có xử lí nhiệt

Huỳnh Thị Thúy Vân 2011 “Phân lập và đánh giá khả năng ức chế của vi

khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh thối củ gừng ( Zingiber officinale Rosc.) trong điều kiện in vitro” Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư

Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ Cán

bộ hướng dẫn TS Trần Vũ Phến

TÓM LƯỢC

Đề tài: “Phân lập và đánh giá khả năng ức chế của vi khuẩn vùng rễ đối

với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh thối củ gừng (Zingiber officinale Rosc.) trong điều kiện in vitro” được thực hiện từ tháng 9/2010 đến tháng

09/2011 trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Đề tài được thực hiện với mục tiêu tuyển chọn các

chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng cao đối với vi khuẩn Ralstonia

solanacearum, đồng thời khảo sát các cơ chế đối kháng có lợi cho cây trồng

Phân lập vi khuẩn từ các mẫu rễ và đất xung quanh vùng rễ ở những cây khỏe có biểu hiện sinh trưởng vượt trội hơn các cây khác trên ruộng gừng ớ các huyện Chợ Mới, Tri Tôn, Châu Phú thuộc tỉnh An Giang theo phương pháp pha loãng huyền phù vi khuẩn, được chà trên môi trường King’s B có agar, ngoài ra còn

tuyển chọn các chủng Bacillus bằng cách xử lí nhiệt 900C trong 15 phút

Thí nghiệm 1 đánh giá khả năng đối kháng qua chọn lọc sơ khởi 216 chủng

vi khuẩn vùng rễ, trong đó có 21 chủng vi khuẩn có đối kháng với vi khuẩn

Ralstonia solanacearum chiếm 9,27% Từ 21 chủng vi khuẩn vùng rễ trên có 4

chủng vi khuẩn có đối kháng cao biểu hiện sớm và bền, có triển vọng là TT2.1kt, TT4.3kt, CP25.2kt, CM2.1kt

Sử dụng 4 chủng ở thí nghiệm 1 cùng với 4 chủng vi khuẩn có đối kháng với

vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên gừng TT5.10et, TT8.1t, TT5.12t, TT6.2et và 2 chủng vi khuẩn có đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cà chua PGPR 1,

PGPR 6, thử đối kháng với 3 chủng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh trên gừng

Kết quả chọn ra được 3 chủng PGPR 1, TT 5.10et, TT 2.1kt có khả năng đối kháng mạnh và ổn định với bán kính vòng vô khuẩn lần lượt là 0,89cm, 0,79cm, 0,89cm ở thời điểm 3 ngày sau khi thử

Tất cả 10 chủng vi khuẩn vùng rễ khi thử thì có 10 chủng có khả năng tạo siderophore, 9 chủng phân giải lân khó tan trong đó chủng TT 6.2et không có khả năng phân giải lân khó tan, trong đó 3 chủng PGPR 1, TT 5.10et, TT 2.1kt đều có khả năng tiết siderophore và phân giải lân, đây có thể là cơ chế đối kháng có liên quan đến việc kiểm soát bệnh héo xanh thối củ gừng Cả 3 chủng này đều là vi khuẩn Gram dương và có khả năng tạo nội bào tử

Theo Đỗ Văn Chúng (2011), qua điều tra về hiện trạng canh tác gừng và tình hình bệnh hại thì loại bệnh gây hại quan trọng và phổ biến trên gừng là bệnh héo

xanh thối củ do vi khuẩn Ralstonia solanacearum, thiệt hại do bệnh là khá cao, có

hộ thiệt hại đến 90% năng suất, phun thuốc hóa học không có hiệu quả trong phòng trị bệnh héo xanh Dư lượng thuốc hóa học gây ra sự suy thoái của hệ sinh thái nông nghiệp, làm giảm màu mỡ của đất (Kenny, 1982) và giảm mật số vi sinh vật

có lợi trong đất (Smiley, 1981)

Việc sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sinh học là một chiến lược không độc hại để giảm thiệt hại cây trồng gây ra bởi các mầm bệnh Các vi sinh vật đối kháng

là những tác nhân phòng trừ sinh học lý tưởng cho vùng rễ, giúp bảo vệ hệ rễ chống lại sự xâm nhiễm bởi các tác nhân gây bệnh (Lumsden và ctv., 1987) Vi khuẩn vùng rễ đóng một vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy tăng trưởng theo nhiều cơ chế khác nhau, sản xuất các chất chuyển hóa, kháng sinh chống lại tác nhân gây bệnh, hoặc kích kháng lưu dẫn (Induced Systemic Resistance-ISR) hoặc cạnh tranh ngay cả chất dinh dưỡng với mầm bệnh (Bolwerk và ctv., 2003)

Từ đó đề tài “Phân lập và đánh giá khả năng ức chế của vi khuẩn vùng

rễ đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh thối củ gừng (Zingiber

officinale Rosc.) trong điều kiện in vitro” đã được thực hiện với mục đích tuyển

chọn các chủng có khả năng đối kháng cao đối với vi khuẩn Ralstonia

solanacearum, đồng thời khảo sát một số cơ chế đối kháng

CHƯƠNG I LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY GỪNG

Gừng có tên khoa học là Zingiber officinale Rosc., thuộc họ Zingiberaceae

Gừng có nguồn gốc từ Ấn Độ, Trung Quốc, Đông Nam Á, Châu Phi, Nam Mỹ,… trong đó gừng được trồng nhiều ở các nước có khí hậu nhiệt đới Cây gừng được dùng làm gia vị và làm thuốc Nó có tác dụng trong các bệnh như buồn nôn, say tàu xe, đau bụng, khó tiêu, viêm khớp xương,…(Ravindran và Babu, 2004)

Theo Mai Văn Quyền (2007), gừng thuộc loại cây thân nhỏ, có thể sống lâu năm, cao từ 50-100cm tùy theo loại đất, có nơi cao tới 150cm Ở Việt Nam gừng được trồng và bán khắp nơi, nhất là vào dịp tết, được dùng làm đồ gia vị và dùng làm thuốc

Theo Đỗ Huy Bích (2003), gừng chứa 2-3% tinh dầu với các thành phần chủ yếu là các hợp chất hydrocacbon sesquiterpaenic, β-zingiberen 35%, ar-curcumeren 17%, β-farnesen 10%, và 1 phần nhỏ các hợp chất alcol monterpenic như geraniol, linalol, borneol Nhựa dầu gừng chứa 20-25% tinh dầu và 20-30% các chất cay, thành phần chủ yếu của các chất cay là zingerol, shogaol, zingeron, trong đó chất zingerol chiếm tỉ lệ cao nhất Đó là 1 chất lỏng màu vàng, tan trong cồn 500 , ether, cloroform, benzen, và tan vừa trong ether dầu hỏa nóng Ngoài ra trong tinh dầu còn chứa thành phần α-camphen, β-phelandren, eucalyptol, zingerol

1.2 BỆNH HÉO XANH THỐI CỦ GỪNG DO VI KHUẨN RALSTONIA

SOLANACEARUM

1.2.1 Triệu chứng bệnh

Ở cây còn non thì toàn cây héo rũ, lá tái xanh và cây chết khô, trên cây đã lớn thì một hai lá héo rũ xuống, tái xanh, sau 2-5 ngày toàn cây héo xanh, trên thân vẫn còn xanh Vi khuẩn xâm hại chủ yếu mạch dẫn thân, rễ, lá Phá hủy và làm tắt nghẽn mạch dẫn trở thành nâu xẫm, bên trong mạch dẫn chứa đầy dịch nhờn vi khuẩn, ấn nhẹ vào đoạn cắt hoặc ngâm trong ly nước lạnh sẽ thấy dịch nhờn tuông

ra Cây bệnh sẽ có triệu chứng héo rũ vào buổi trưa nắng và chiều mát tươi lại, mạch dẫn bị hóa nâu, củ sậm màu và bị nhũn nước, lá vàng từ dưới lên,vài ngày sau thì cây chết, củ gừng bị biến màu thối hỏng từ trong ra ngoài Củ bị thối có mùi thối

khó chịu (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999, Nguyễn Thị Nghiêm, 2006, Đỗ Huy Bích, 2003)

1.2.2 Đặc tính mầm bệnh

Theo Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân (1999), mầm bệnh có những đặc tính như sau:

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là loài sống và lưu tồn trong đất, ký sinh

thực vật Hình gậy 0,5-1,5µm, háo khí, chuyển động có lông roi (1-3) ở đầu, gram

âm

Vi khuẩn đa thực, có tính chuyên hóa thấp, khả năng chọn phạm vi kí chủ rất rộng bao gồm nhiều loài cây thuộc các họ thực vật khác nhau Ví dụ như các loài cây họ cà, họ đậu, bầu bí, chuối,…, gồm trên 200 loài khác nhau thuộc 44 họ

Trên môi trường Kelman, khuẩn lạc có màu trắng kem nhẵn bóng, nhờn (vi khuẩn có tính độc gây bệnh) Nếu khuẩn lạc chuyển sang màu nâu, răn reo là isolat

vi khuẩn mất tính độc Để thử vi khuẩn có tính độc thường dùng môi trường TZC Trên môi trường này nếu khuẩn lạc ở giữa có màu hồng, rìa trắng thì vi khuẩn có tính độc

Có vỏ nhờn, nhờ đó mà vi khuẩn có thể liên kết lại với nhau thành khối nhỏ

và có khả năng chống chịu cao với nhiệt độ, hóa chất,tia sáng mặt trời…., có thể lưu tồn lâu dài

Ralstonia solanacearum có khả năng phân giải làm lỏng gelatin, có dòng có

khả năng khử nitrat, có thể tạo acid khi phân giải 1 số loại đường, hợp chất carbon,…

Loài vi khuẩn này phân hóa thành nhiều race, biovar khác nhau tùy theo loài cây ký chủ, vùng địa lí, đặc điểm sinh hóa, tính độc, tính gây bệnh Trong đó race 4 biovar 3 và biovar 4 là gây hại trên cây gừng

Các biovar phân định dựa trên cơ sở đặc tính sinh hóa là khả năng oxy hóa các nguồn hydrate carbon gồm 3 loại đường maltose, lactose, cellubiose và 3 loại rượu mannitol, dulcitol, sorbitol

Trong đó biovar 3 có đặc tính tạo ra acid có khả năng oxy hóa cả 3 loại đường maltose, lactose, cellubiose và 3 loại rượu mannitol, dulcitol, sorbitol Biovar 4 chỉ oxy hóa 3 loại dulcitol, mannitol và sorbitol

Vi khuẩn tiết ra men pectinmethyllesteraza phân giải pectin có thể sinh ra acid pectinic ở trong mạch dẫn kết hợp với canxi tạo thành pectat canxi làm vít tắt

sự lưu thông của bó mạch, góp phần tạo ra triệu chứng héo đột ngột của cây bệnh

1.2.3 Sự xâm nhập, phát sinh và phát triển bệnh

Theo CABI (2007), vi khuẩn xâm nhiễm vào cây ký chủ qua các vết thương

và khí khổng, trong cây, vi khuẩn di chuyển trong các bó mạch và quá trình này được đẩy mạnh khi nhiệt độ tăng cao hơn Tốc độ di chuyển cũng phụ thuộc một phần vào từng loại cây kí chủ

Bệnh nghiêm trọng nhất ở 24-350C, bệnh không phát triển ở nhiệt độ dưới

100C Ở các chủng (biovars) khác nhau thì có nhiệt độ thích hợp khác nhau (Swanepol, 1990)

Độ ẩm của đất cao và thời tiết ẩm ướt, lượng mưa có liên quan với tỷ lệ mắc bệnh cao Độ ẩm của đất cũng ảnh hưởng đến sinh sản và lưu tồn của tác nhân gây bệnh (Nesmith và Jenkins, 1985)

Theo Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân (1999), vi khuẩn phát triển thích hợp ở

pH 7-7,2, nhiệt độ thích hợp 25-300C, nhất là ở 300C, nhiệt độ tối thiểu 100C, tối đa

410C, nhiệt độ gây chết 520C Những vi khuẩn này xâm nhiễm vào thân, rễ, cuống

lá qua các vết thương cơ giới do nhổ cây giống đem trồng, do côn trùng, tuyến trùng tạo ra, hoặc do chăm sóc, Vi khuẩn có thể xâm nhập qua các khe hở tự nhiên, bì khổng trên củ Bệnh phát triển mạnh và nhanh ở nhiệt độ cao, mưa gió, nhất là ở trên đất cát pha, đất thịt nhẹ hoặc đất nhiễm vi khuẩn, trồng các giống mẫn cảm với bệnh từ trước Trong đó, nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển và phát sinh bệnh

Điều kiện thời tiết, chẳng hạn như nhiệt độ thấp, bệnh không biểu hiện triệu chứng ra bên ngoài, rất khó nhận biết nên bệnh có thể lây lan ra diện rộng (CABI, 2007)

1.2.4 Sự lưu tồn của mầm bệnh

Ralstonia solanacearum đã được chứng minh lưu tồn trên tàn dư thực vật

2-3 năm Vi khuẩn có thể lưu tồn trong củ giống, thân, rễ cây gừng, nghệ, mà quan trọng nhất là bề mặt nước bị nhiễm vi khuẩn (CABI, 2007)

Vi khuẩn có thể lưu tồn trong gỗ trong vài ngày, trong kim loại vài tuần và trong cao su vài tháng và trong phân gia súc 2-4 tuần, trong các chất thải 1-2 tháng (CABI, 2007)

Theo Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân (1999), ở trong đất vi khuẩn có thể lưu tồn lâu dài 5-6 năm hoặc 6-7 tháng tùy thuộc vào ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm, loại đất, các yếu tố sinh vật và các yếu tố khác

1.2.5 Các biện pháp phòng trừ bệnh

Theo CABI (2007), việc sử dụng hóa chất không có hiệu quả kiểm soát bệnh, các loại thuốc kháng sinh như streptomycine, ampicilline, tetracycline và penicilline gần như không có tác dụng, do đó các biện pháp phòng trừ sinh học đã

được thực hiện và cho kết quả 2 chủng vi khuẩn Bacillus polymyxa và

Pseudomonas fluorescens là có hiệu quả phòng trừ trong phòng thí nghiệm

Theo Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân (1999), việc phòng trừ bệnh héo xanh

vi khuẩn hiện nay còn rất khó khăn và phức tạp, là vấn đề tồn tại chung trên thế giới Cách tốt nhất là phải áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp,chủ động sớm: Chọn lọc sử dụng các giống cây trồng kháng bệnh, năng suất cao, đặc biệt cần thiết cho các vùng màu có áp lực bệnh nặng hàng năm; củ giống khỏe, sạch bệnh, lấy giống ở các vùng, các ruộng không có bệnh; kiểm tra loại bỏ các củ giống nhiễm bệnh trước khi gieo trồng, tiêu hủy tàn dư cây bệnh; tiêu diệt các loài cỏ dại, đặc biệt các loài cỏ dại là kí chủ của mầm bệnh, luân canh với lúa nước hoặc các loài không là kí chủ như ngô, mía, bông, trong 5-7 năm; tăng cường bón phân hữu cơ, phân hoai mục và bón vôi Cũng có thể sử dụng biện pháp thay đổi pH đất để tiêu diệt mầm bệnh bằng cách làm giảm độ pH đất với 4-5 vào mùa hè và nâng độ pH

đất lên 6 vào mùa thu

1.3 VI SINH VẬT VÙNG RỄ VÀ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG CÂY TRỒNG

1.3.1 Vi sinh vật vùng rễ

Rhizosphere là thể tích đất xung quanh và dưới ảnh hưởng của rễ cây, và rhizoplane thì bao gồm toàn bộ bề mặt rễ thực vật và có ái lực mạnh đối với các phân tử đất Trong nghiên cứu các hệ sinh thái của vi sinh vật thì vùng rễ bao gồm

cả rhizoplane Trong vùng rễ, các tương tác quan trọng luôn luôn diễn ra giữa các

cây trồng, đất và vi sinh vật Những tương tác này có ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng và năng suất cây trồng (Antoun và Prévost, 2005)

Theo Lugtenberg và Kamilova (2009), thì vùng rễ (rhizosphere) là vùng chịu tác động của rễ cây, phong phú hơn, nhiều vi khuẩn hơn so với vùng đất xung quanh bên ngoài của vùng rễ Chỉ một phần nhỏ của bề mặt rễ được bao phủ bởi vi khuẩn Các vùng phổ biến nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là các nút giao giữa các tế bào biểu bì và các khu vực nơi các rễ bên xuất hiện

Sự tương tác vi khuẩn thực vật trong vùng rễ là năng động và phức tạp Một

số gây hại đến sức khỏe cây trồng do chúng cạnh tranh dinh dưỡng và gây bệnh cho cây Bên cạnh đó thì có một số kích thích tăng trưởng cây trồng bằng cách sản xuất kích thích tố hoặc ức chế tác nhân gây bệnh Các vi khuẩn hữu ích cho các cây trồng được phân thành hai nhóm: vi khuẩn tạo thành một mối quan hệ cộng sinh với các cây trồng và sống tự do ở trong đất nhưng thường được tìm thấy gần, hoặc thậm chí trong các mô thực vật (Kloepper và ctv., 1988 ; Frommel và ctv., 1991); vi khuẩn sống tự do mang lại lợi ích cho đất nhằm nâng cao sự phát triển của thực vật thường được gọi là vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (plant growth promoting rhizobacteria - PGPR ) (Kloepper và ctv., 1989)

1.3.2 Vi khuẩn ngoại sinh rễ

Nhiều vùng của rễ non có sự hiện diện và sinh sống của vi khuẩn vùng rễ, nơi đây có nhiều hốc sinh thái thích hợp mà những vi khuẩn thuộc các chi như:

Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus và Pseudomonas có thể phát triển Những vi

khuẩn này ngăn chặn sự phát triển và xâm nhập của vi sinh vật có hại Nhiều báo cáo cho thấy tác động có lợi của vi khuẩn vùng rễ lên sự tăng trưởng của cây được cho là do chúng có khả năng kiềm chế hay chiếm chỗ của mầm bệnh (Lambert và ctv., 1987)

1.3.3 Vi khuẩn nội sinh rễ

Vi khuẩn vùng rễ (rhizobacteria) mà khi tiêm chủng vào trong đất có các vi cạnh tranh, gây tác động có lợi trên sự phát triển của thực vật được gọi là vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (PGPR) (Kloepper và Schroth, 1978) PGPR là vi khuẩn sống tự do (Kloepper và ctv., 1989), và một số trong đó xâm nhập vào mô của thực vật sống và không gây hại đến cây trồng (Sturz và Nowak,

2000), các PGPR này được gọi là vi khuẩn nội sinh (endophytes) (Antoun và Prévost, 2005)

1.3.4 Một số tác động của PGPR đối với cây trồng

Theo Lugtenberg và Kamilova (2009), để phát huy tác dụng có lợi trong môi trường rễ, PGPR phải có khả năng cạnh tranh tốt với các vi khuẩn vùng rễ khác về các chất dinh dưỡng tiết ra từ rễ và về các nơi có thể chiếm cứ được trên rễ

PGPR có thể kích thích tăng trưởng thực vật theo phương thức trực tiếp hoặc gián tiếp (Antoun và Prévost, 2005)

1.3.4.1 Các cơ chế trực tiếp

Cơ chế trực tiếp bao gồm việc sản xuất các hợp chất dễ bay hơi và phytohormones kích thích sinh trưởng từ vi khuẩn , hạ thấp mức độ ethylene trong cây trồng, cải thiện tình trạng dinh dưỡng cây trồng (giải phóng phosphate và vi chất dinh dưỡng từ các nguồn không hòa tan) và kích thích cơ chế kháng bệnh (kích kháng lưu dẫn- ISR) (Antoun và Prévost, 2005)

Còn theo Lugtenberg và Kamilova (2009), một số chủng vi sinh vật có lợi kích thích tăng trưởng thực vật trực tiếp khi không có mặt của tác nhân gây bệnh cây trồng Tùy thuộc vào cơ chế tác động, các vi khuẩn kích thích tăng trưởng có thể được phân thành các nhóm như:

Nhóm có vai trò như phân bón sinh học:

Vi khuẩn thuộc nhóm nầy cung cấp chất dinh dưỡng cho cây trồng Vi khuẩn

Rhizobium và Bradyrhizobium có khả năng hình thành nốt sần cố định đạm trên các

cây họ đậu và cây cỏ linh lăng, chuyển đổi N 2 thành dạng amonia mà cây có thể sử

dụng được Azospirillum là vi khuẩn sống tự do và có thể sống cộng sinh với lúa miến, lúa mì và ngô để cố định nitơ, mà chủ yếu là Azospirillum làm tăng sự phát

triển của rễ và từ đó tăng sự hấp thu nước và chất dinh dưỡng cho cây (Lugtenberg

và Kamilova, 2009)

Theo Goldstein và Liu (1987), các vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng cây trồng có thể làm tăng chất dinh dưỡng cho cây trồng sử dụng bằng cách hòa tan

photpho không hòa tan và giải phóng potassium từ khoáng chất silicat Azotobacter

là 1 chi trong PGPR cũng được áp dụng như tác nhân phòng trừ sinh học do có một

số hoạt động kích thích tăng trưởng cây trồng trực tiếp của nó bao gồm cả cố định

đạm tự do, hòa tan phosphate, sản xuất kích thích tố tăng trưởng, và sản xuất vitamin (Shende và ctv., 1977) Trong đất có khoảng 30-50% phosphate ở dạng hợp chất với hữu cơ trong đất mà cây trồng không thể sử dụng được Các thành phần này được khoáng hóa bởi vi sinh vật, giúp cho cây trồng có thể sử dụng được dưới dạng phospho hòa tan Các chi PGPR khác nhau có khả năng phân hủy hợp chất

phosphate, bao gồm: Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium, Burkholderia,

Achromobacter, Agrobacterium, Micrococcus, Aerobacter, Flavobacterium, Chryseobacterium, và Erwinia Sự hòa tan phosphate hữu cơ nhờ vào sự tham gia

của các acid hữu cơ và enzyme phosphatase Hầu hết các vi khuẩn nầy có thể hòa tan các phức Ca-P, và có những vi khuẩn khác hoạt động phân cắt phức Fe-P, Mn-

P, và Al-P (Aeron và ctv., 2011)

Theo Lugtenberg và Kamilova (2009), lượng phosphate hòa tan trong đất thấp có thể giới hạn sự tăng trưởng của thực vật Một số vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật bằng cách hòa tan phosphate từ các phosphate hữu cơ hoặc vô cơ bị liên kết ở dạng phức hợp, do đó tạo điều kiện thuận lợi cho cây trồng tăng trưởng

Vi khuẩn vùng rễ tiết các enzyme không đặc hiệu như phosphatase, phytase, phosphonatase, C-P lyase, hòa tan các phosphate từ hợp chất hữu cơ trong đất Trong đó C-P lyase tách các liên kết phosphate hữu cơ, việc giải phóng các phospho từ khoáng chất phosphate có liên quan đến việc sản xuất các acid hữu cơ như sản xuất acid gluconic

Nhóm có vai trò kích thích tăng trưởng thực vật

(Phytostimulators)

Okon và ctv., (1998) cho rằng thúc đẩy tăng trưởng cây trồng bằng cách sản xuất ra các chất kích thích tăng trưởng như IAA, gibberellins, cytokinins Một số

VKVR, như các chủng Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, và

Enterobacter cloacae, kích thích tăng trưởng của thực vật bằng cách phóng thích

các chất bay hơi (Ryu và ctv., 2003) Mức độ kích thích tăng trưởng cao nhất đã được quan sát với 2,3-butanediol và acetoin

Azotobacter và Azospirillum không chỉ cố định nitơ mà còn sản xuất chất

điều hòa sinh trưởng thực vật chẳng hạn như indole acetic acid (IAA), acid gibberellic, cytokinin, và các vitamin (Rodelas và ctv., 1999) Các chi thuộc nhóm

vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật thường ít tiết ra cytokinin, trong

khi đó chi Bacillus tiết gibberellin ở nồng độ cao Các chi vi khuẩn khác, như

Proteus mirabilus, Pseudomonas vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus, Escherichia coli, vv…, sản xuất auxin, cytokinin, gibberellin, và acid abscisic

(Griffith và Ewart, 1995) Gần đây một số chủng của nhóm Bacillus subtilis,

Bacillus amyloliquefaciens đã được chứng minh là có thể sản xuất các chất có hoạt

tính tương tự IAA, và được tạo ra với lượng hợp lý bởi Bacillus amyloliquefaciens

FZB42 khi được nuôi với môi trường bổ sung tryptophan IAA có thể thúc đẩy sự phát triển rễ, kích thích kéo dài tế bào thực vật hoặc phân chia tế bào hoặc gián tiếp ảnh hưởng đến hoạt động của vi khuẩn tiết enzyme 1-aminocyclopropane-1-

carboxylate deaminase, (Aeron và ctv., 2011) Chủng Pseudomonas fluorescens

G20-18 sản xuất số lượng cao hơn về ba chất cytokinin, isopentenyl adenosine, trans-zeatin ribose và dihydrozeatin riboside (Garcia de Salamone và ctv., 2001)

Sắt trong lớp vỏ của trái đất là hiện diện trong một hình thức không hòa tan của hydroxit sắt (Fe 3+), và do đó không có sẵn cho các vi sinh vật và thực vật sử dụng Một số vi khuẩn phát triển hệ thống hấp thu sắt (Neilands và Nakamura, 1991) Các hệ thống này có sự tham gia của chất siderophore, đây là một chất cố định sắt và protein hấp thu cần thiết để vận chuyển sắt vào trong tế bào Siderophore là chất có trọng lượng phân tử thấp (~ 400-1000 Da) tạo hợp chất sắt chelating cố định Fe3+ và vận chuyển nó vào tế bào và làm cho nó trở nên hữu dụng cho các tế bào vi khuẩn (Briat, 1992) Các phân tử siderophore có ái lực rất cao với sắt (kd=10-20 – 10-50), nên tạo liên kết với hầu hết Fe3+ hữu dụng ở vùng rễ và ngăn cản sự phát triển của các tác nhân gây bệnh trong vùng lân cận vì thiếu chất sắt (O'Sullivan và O'Gara, 1992)

Giảm stress cho cây

Vi khuẩn kích thích tăng trưởng cây trồng tiết các enzyme aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase tạo điều kiện thuận lợi cho sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng bằng cách giảm mức ethylene trong cây (Lugtenberg và Kamilova, 2009) ACC là tiền chất trực tiếp của ethylene, một chất

1-ức chế tăng trưởng của rễ, và chủng Pseudomonas fluorescen GR12-2 như một số

loại vi khuẩn khác sản xuất ACC-deaminase (Jacobson và ctv., 1994), làm thoái

hóa ACC, do đó ngăn ngừa cây tạo ra ethylene đến mức Vi khuẩn tiết enzyme này chuyển đổi ACC thành 2 -oxobutanoate và NH3 Việc sản xuất enzyme deaminase ACC có thể giảm stress cho cây, chẳng hạn như khi vi khuẩn gây bệnh tác động lên cây trồng, chống chịu với stress do polyaromatic hydrocarbon, do kim loại nặng như Ca2+ và Ni2+, hay do muối và hạn (Lugtenberg và Kamilova, 2009)

1.3.4.2 Các cơ chế kiểm soát sinh học bệnh

Đối kháng

Sử dụng vi sinh vật trong phòng trừ sinh học là một chiến lược ít rủi ro giúp giảm thiệt hại do mầm bệnh cho cây trồng (Lumsden và ctv., 1987) Tổng hợp kháng sinh là một trong các cơ chế hiệu quả nhất trong việc sử dụng các hợp chất đối kháng để ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh Một số lượng lớn thuốc kháng

sinh đã được sản xuất từ các chủng Pseudomonas fluorescens khác nhau, bao gồm:

agrocin-84, agrocin-434, 2, 4-diacetyl phloroglucinol, herbicolin, oomycin, phenazine, pyoluteorin, pyrrolnitrin, pyrroles, v.v., và chúng có vai trò ức chế tác

nhân gây bệnh (Aeron và ctv., 2011) Nhiều chủng vi khuẩn Bacillus được coi là

nhà máy sản xuất tự nhiên của lipopeptide mạch vòng, bao gồm: iturin, fengycin, và surfactin, và sự tham gia của chúng trong việc kiểm soát các bệnh do vi sinh vật đã được chứng minh (Li và ctv., 2007; Romero và ctv., 2007; Yoshida và ctv., 2001 Asaka và Shoda, 1996)

Vi khuẩn sản xuất kháng sinh diệt các mầm bệnh, hoạt động thông qua sự đối kháng Một loại vi khuẩn thích hợp cho phòng trừ sinh học, không chỉ tổng hợp

và tiết kháng sinh, mà còn cạnh tranh mạnh hơn với các sinh vật khác về các chất dinh dưỡng tiết ra từ rễ và các chỗ ở trên rễ để cung cấp các kháng sinh cho toàn bộ

hệ thống rễ (Chin và ctv., 2000) Kháng sinh được xác định có ở vi khuẩn phòng trừ sinh học gram âm bao gồm các hợp chất cổ điển như: HCN, phenazines, trong đó chủ yếu là phenazine-1-carboxylic acid và phenazine-1-carboxamide; 2,4-diacetyl phloroglucinol (DAPG), pyoluteorin ; và pyrrolnitrin Zwittermycin A và

kanosamine có thể được sản xuất bởi vi khuẩn Bacillus cereus Kháng sinh mới

được phát hiện trong các chủng vi khuẩn phòng trừ sinh học là D-gluconic acid và 2-hexyl-5-propyl resorcinol Chất bay hơi không là hydrogen cyanide, như 2,3-butanediol cũng giữ vai trò trong bảo vệ cây (Lugtenberg và Kamilova, 2009)

Gây nhiễu tín hiệu của tác nhân gây bệnh

Nhiều vi khuẩn chỉ thể hiện các yếu tố độc lực hoặc gây bệnh với mật số vi khuẩn cao, khi có một mức nhất định các phân tử thụ cảm đại diện như N-acyl homoserine lactones (AHLs) tích tụ trong môi trường (Bassler, 1999) Gây nhiễu tín hiệu là cơ chế kiểm soát dựa trên sự suy thoái của AHL (Lin và ctv., 2003) Ví

dụ, bằng cách dùng Ahl lactonases của các chủng B thuringiensis thủy phân vòng

lacton hoặc phá vỡ liên kết amide của AHLs Gần đây, đã chứng minh được enzyme AHL acylases đóng một vai trò trong sự hình thành của màng sinh học Thiếu sự hình thành màng sinh học có thể làm cho kiểm soát sinh học được dễ dàng hơn (Shephard và Lindow, 2008)

Ký sinh và bắt mồi

Cơ chế kiểm soát chính được sử dụng bởi một số loài nấm Trichoderma,

được dựa trên enzyme phá hủy vách tế bào nấm (Harman và ctv., 2004) Tuy nhiên

cơ chế này không có hiệu quả đối với vi khuẩn (Lugtenberg và Kamilova, 2009)

Kích kháng lưu dẫn (ISR)

Tương tác giữa một số vi khuẩn với rễ cây có thể làm cho cây trồng đề kháng với một số vi khuẩn, nấm, và virus gây bệnh Hiện tượng này được gọi là

kích kháng lưu dẫn (ISR) (Blevins, 1987) Hai chi Pseudomonas và Bacillus được

tập trung nghiên cứu nhiều hơn về cơ chế này ISR phụ thuộc vào sự truyền tín hiệu jasmonic acid và ethylene trong cây trồng (Van Loon, 2007)

Nhiều thành phần riêng rẻ của vi khuẩn có thể tạo kích kháng ISR, như: LPS, roi, acid salicylic, và siderophore (Van Loon, 2007) Gần đây, các lipopeptides mạch vòng, yếu tố Phl kháng nấm, phân tử tín hiệu AHLs, hỗn hợp các

chất dễ bay hơi được sản xuất bởi Bacillus subtilis GB03, và từng chất riêng rẻ như

như acetoin và 2,3 – butanediol cũng được cho là có tác động này (Lugtenberg và Kamilova, 2009)

Một số nghiên cứu cho thấy rằng nhiều chủng thuộc chi Bacillus có tác động

như tác nhân kiểm soát sinh học thông qua cơ chế ISR hơn là sự kháng sinh (Lugtenberg và Kamilova, 2009) DeWeert và ctv., (2002) đã báo cáo một chủng vi

khuẩn phòng trừ sinh học khác, Pseudomonas fluorescens WCS365, cũng tác động

dựa trên cơ chế ISR

Cạnh tranh ion sắt

Khi được nuôi trong đĩa có chứa môi trường với nồng độ sắt thấp cùng với nấm, các chủng vi khuẩn có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh khi chúng tiết ra siderophore để tạo ra chelating-Fe3+ Sau khi liên kết, phức hợp Fe 3+- siderophore được hình thành, sau đó kết hợp với các thụ thể giới hạn sắt ở bề mặt tế bào vi khuẩn và cuối cùng các ion Fe3+ được phóng thích ra và hoạt động trong tế bào chất dưới dạng Fe2+ Vi khuẩn sản xuất siderophore ở nồng độ cao trong vùng

rễ có thể ức chế sự phát triển của nấm bệnh khi nồng độ Fe 3+ môi trường thấp, như trong đất acid, (Schippers và ctv., 1987)

Cạnh tranh chất dinh dưỡng và chỗ ở

Cạnh tranh giữa vi khuẩn phòng trừ sinh học với tác nhân gây bệnh về dinh dưỡng và chỗ ở trong vùng rễ đã từ lâu được xem là một cơ chế phòng trừ sinh học, nhưng bằng chứng thực nghiệm còn thiếu Kamilova và ctv., (2005) đã áp dụng phương pháp áo một hỗn hợp gồm các chủng vi khuẩn vùng rễ lên trên bề mặt hạt

đã tiệt trùng, sau đó ủ hạt cho nảy mầm Sau 1 tuần, thu chóp rễ, nơi được định cư bởi các vi sinh vật canh tranh tốt nhất, sau đó phân lập và nhân nuôi vi khuẩn thu được và dùng để thực hiện trên các hạt mới cho 1 chu kỳ mới tiếp theo Sau ba chu

kỳ như vậy, các vi khuẩn phân lập được cho kết quả tốt hoặc thậm chí tốt hơn cả

chủng vi khuẩn về định vị chuẩn trên rễ là P fluorescens WCS365 trong việc cạnh

tranh về chỗ ở trong rễ Hầu hết các mẫu phân lập, bao gồm các chủng

Pseudomonas PCL1751 và PCL1760 kiểm soát được bệnh thối rễ cà chua do Fusarium oxysporum Tuy nhiên, kết quả quan sát thấy rằng một trong những

chủng vi khuẩn vùng rễ có cạnh tranh tốt nhất ở đỉnh sinh trưởng rễ đã không kiểm

soát bệnh thối rễ cà chua do Fusarium oxysporum gây ra Điều đó kết luận rằng

hiệu quả tổng thể của phòng trừ sinh học không chỉ dựa vào cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng và chỗ ở mà còn cần dựa trên nhiều cơ chế khác (Lugtenberg và Kamilova, 2009)

Sản xuất các enzyme phân hủy

Gần đây, các enzyme thủy phân cũng được quan tâm đáng kể vì chúng đóng một vai trò quan trọng trong kiểm soát bệnh Vi sinh vật có khả năng phân hủy vách

tế bào các sinh vật khác hiện diện phổ biến trong các hệ sinh thái tự nhiên Sự phân

hủy hoặc làm biến dạng các thành phần vách tế bào của tác nhân gây bệnh bằng các enzyme sản xuất bởi các vi khuẩn đối kháng là một trong các phương pháp hợp lý trong phòng trừ các bệnh trong đất Việc sản xuất các enzyme phân hủy vách tế bào chẳng hạn như: chitinase, chitosanase, β-1,3-glucanase, β-1,4-glucanase, β-1,6-glucanase, protease, và lipase, làm phân hủy vách tế bào, dẫn đến phân giải của màng tế bào làm chết tế bào của tác nhân gây bệnh (Aeron và ctv., 2011)

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ỨNG DỤNG VI SINH VẬT VÙNG RỄ VÀO KIỂM SOÁT BỆNH

Trong nước đã có những nghiên cứu thành công các chế phẩm vi sinh vật và ứng dụng thành công vào thực tế phòng trừ bệnh trong sản xuất nông nghiệp

Tạ Thị Chính và Lý Kim Bảng (2005), đã tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn HD8, HD54, HD58, có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cà chua và dưa hấu, 3 chủng này có khả năng ức chế mạnh vi khuẩn gram âm HDL4,

vi khuẩn gram dương HDL9 và vi khuẩn Ralstonia solanacearum N22 gây bệnh

héo xanh cà chua, ngoài ra 2 chủng xạ khuẩn HD54 và HD58 còn ức chế mạnh nấm

Fusarium oxysporum Fo47 gây thối cổ rễ lúa

Nguyễn Thị Hồng Hải và ctv., (2006), đã ứng dụng vi khuẩn nội sinh thực

vật trong phòng trừ bệnh héo xanh trên cây trồng do vi khuẩn Ralstonia

solanacearum Đã xác định được 16 chủng vi khuẩn nội sinh từ 12 mẫu rễ các cây

họ cà, hành, ớt,… và các chủng phân lập được điều có khả năng ức chế mầm bệnh

Và các chủng CI 1-5 , CI 1-6, CI 1-7, CI 4-1’, CI4-4’, NA3’, NA 4, NA16 là các chủng vi khuẩn nội sinh và có khả năng đối kháng với mầm bệnh mạnh nhất, có triển vọng trong việc ứng dụng phòng trừ sinh học bệnh héo xanh

Nguyễn Thị Kim Cúc (2006), đã phát hiện ra các chủng vi sinh vật có khả

năng đối kháng cao với nấm Fusarium oxysporum Trong 15 chủng vi khuẩn, có 7

chủng H15, H16, H13, H6, H10, TH8, TH10 là các chủng có khả năng đối kháng với mầm bệnh manh hơn các chủng còn lại, trong đó chủng TH10 có khả năng đối

kháng Fusarium oxysporum cao nhất và được chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

Trần Vũ Phến và ctv., (2008), đã tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ kích thích

tăng trưởng và triển vọng trong phòng trừ bệnh héo xanh do vi khuẩn R

solanacearum gây ra trên cây cà chua, thí nghiệm đã tuyển chọn hơn 500 chủng vi

khuẩn vùng rễ phân lập trên ruộng trồng các cây trồng cạn chọn ra được 40 chủng

có khả năng định vị ở vùng rễ và có đối kháng với vi khuẩn R solanacearum Sau

khi khảo sát ở điều kiện ngoài đồng đã chọn được 5 chủng Tbt1.18.1et, Tbt1.12.7et, Tbt1.18.2t, T4.6t, T1.12.7et vừa có khả năng kích thích tăng trưởng vừa kiểm soát

được bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacearum gây ra

Lê Mộng Trai (2009), đã đánh giá hiệu quả xử lí chế phẩm vi khuẩn vùng rễ

trong kiểm soát bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra và khả

năng kích thích tăng trưởng cây, năng suất trái Đây là một thành công đầu trong nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm vi khuẩn vùng rễ để phòng trị bệnh cho cây trồng Thí nghiệm đã thử với 6 nghiệm thức, 6 cách phun xử lí khác nhau Kết quả cho thấy chế phẩm vi khuẩn vùng rễ ở dạng bột đã cho hiệu quả kiểm soát bệnh tốt với cách xử lí áo hạt và phun chế phẩm vào đất ở thời điểm 3 ngày sau khi trồng và

10 ngày sau khi trồng đạt hiệu quả cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức xử lí khác và với nghiệm thức đối chứng về khả năng ức chế mầm bệnh Đồng thời ở nghiệm thức này khả năng kích thích tăng trưởng và năng suất trái cũng cao nhất trong các nghiệm thúc xử lí Kết quả này đáng ghi nhận vì nó cho thấy được khả năng kiểm soát bệnh của chế phẩm vi khuẩn vùng rễ, bảo vệ cây trồng trong điều kiện ngoài đồng; ngoài ra chế phẩm còn có khả năng kích thích cây trồng tăng trưởng và tăng năng suất, tùy theo thời gian tăng trưởng của cây mà có thể xử lí chế phẩm để tăng hiệu quả kiếm soát bệnh của chế phẩm

Nguyễn Thanh Giàu và Nguyễn Trung Long (2009), đã áp dụng vi khuẩn

Pseudomonas fluorescen 231-1 phòng trị bệnh đốm lá chảy nhựa thân dưa hấu do

nấm Didymella bryoniea ở điều kiện ngoài đồng Thí nghiệm được thực hiện với 4

nghiệm thức trồng trong 2 vụ liên tục, và kết quả cho thấy ở nghiệm thức 4, xử lí áo hạt + tưới vào đất + phun lên lá có hiệu quả kiểm soát bệnh cao nhất qua từng thời gian sinh trưởng của cây trong cả 2 vụ trồng và đông thời cũng làm tăng năng suất cây trồng so với các nghiệm thức khác Đây là kết quả đáng ghi nhận và đã chứng minh được vi khuẩn vùng rễ là có lợi và có khả năng kiểm soát bệnh trong điều kiện ngoài đồng, đồng thời giúp cây trồng tăng trưởng tôt hơn, năng suất cao hơn

Lý Thu Thảo (2010), đã đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên gừng và khảo sát 1 số cơ

chế đối kháng, kết quả cho thấy có 7 chủng vi khuẩn vùng rễ PGPR1, PGPR3,

Tt8.1t, Tt5.3, Tt7.3e, Tt5.10et và Tt5.12t có khả năng đối kháng tốt với cả 3 dòng vi

khuẩn gây bệnh héo xanh trên gừng, và có 9 mẫu VKVR có khả năng tiết

siderophore là Tt5.10et, Tt5.3, Tt7.3e tiết siderophore dạng catechol, các mẫu

PGPR1, PGPR3, Tt5.9et, PGPR6, Tt5.12t, PGPR17 tiết dạng hydroxamate

Nguyễn Vũ Cương (2011), đã khảo sát khả năng phòng trị bệnh đốm lá ớt

do vi khuẩn Xanhthomonas campestris pv vesicatoria bằng vi khuẩn vùng rễ trong

điều kiện phòng thí nghiệm và nhà lưới, thí nghiệm đã chọn ra 3 chủng vi khuẩn

vùng rễ là 18, 67 (Bacillus sp.), 80, có khả năng đối kháng triển vọng với bán kính

vòng vô khuẩn cao nhất trong phòng thí nghiệm để thực hiện đánh giá khả năng đối

kháng với vi khuẩn Xanhthomonas campestris pv vesicatoria trong điều kiện nhà

lưới, với 4 biện pháp xử lí, trong đó 2 biện pháp phun lên lá trước; phun lên lá trước

và sau khi chủng bệnh có hiệu quả cao nhất, 2 chủng 67 và 80 biểu hiện hiệu quả

phòng trị như nhau và cao hơn so với chủng 18

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương tiện

2.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ tháng 9/2010 đến 9/2011

Địa điểm: Nhà lưới, bộ môn Bảo Vệ thực Vật, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

2.1.2 Thiết bị và vật liệu

Dụng cụ thu mẫu rễ khoẻ: bọc nilon, dao, cồn, viết

Tủ lạnh, tủ cấy vi sinh, nồi thanh trùng autoclave, lò vi sóng microwave, máy lắc ngang, máy lắc vortex, tủ thanh trùng khô

Kính hiển vi, lam đếm, đĩa pêtri, ống nghiệm, micropipette,…

Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm:

+ Yeast Malt HiVeg

Peptone 5g Malt extract 3g Yeast extract 3g

Nước cất 1000ml

pH = 7.2 + Môi trường O-CAS (Overlaid CAS) (Pérez Miranda và ctv., 2007)

Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) 30.24 mg

2.2.1 Điều tra thu mẫu

Chọn ruộng điều tra: Chọn những ruộng trồng gừng có diện tích >1000 m2

10 ruộng/huyện

Thu thập mẫu: chọn thu 5 điểm (mẫu) /ruộng, mỗi mẫu là 1 cây sinh trưởng, phát triển vượt trội nhất trong ruộng có bệnh thối củ gồm rễ và đất bám vào rễ, cho vào bọc nylon riêng, ghi ký hiệu (= ký hiệu phiếu điều tra)

2.2.2 Phân lập vi khuẩn chi Bacillus

Chọn những rễ nhỏ cân 0.2g cắt ra thành từng đoạn nhỏ cho vào ống nghiệm chứa 10ml phosphate buffer đã khử trùng lắc 10 phút Phân lập vi khuẩn vùng rễ trong tủ cấy vi sinh bằng cách chà 0,01ml huyền phù vi khuẩn tách ra từ đất trên 4 đĩa pêtri (trong đó 2 đĩa chứa môi trường King’s B và 2 đĩa môi trường chitin agar), lấy 2 đĩa có 2 môi trường khác nhau xử lí nhiệt ở 900C trong 15 phút, sau đó giữ trong tủ úm ở nhiệt độ 300C (Sadfi và ctv., 2001)

Phân lập vi khuẩn nội sinh bằng cách lấy rễ trong ống nghiệm được khử trùng mặt ngoài bằng clorine 1% và cồn 70% trong 1 phút, sau đó rửa lại 2-3 lần bằng phosphate buffer Sau đó nghiền nhỏ mẫu rễ cho thêm vào đó 10ml buffer lắc đều và rút 0.01ml chà trên 4 đĩa (2 đĩa chứa môi trường King’s B và 2 đĩa môi trường chitin agar), lấy 2 đĩa xử lí nhiệt ở 900C trong 15 phút, sau đó để trong tủ úm

ở nhiệt độ là 300C

Quan sát, mô tả dạng khuẩn lạc để chọn những khuẩn lạc rời rạc

Các dạng khuẩn lạc khác nhau được chọn và chuyển sang môi trường King’s

B trong đĩa, kiểm tra lại sự tinh ròng

Chủng vi khuẩn tinh ròng được trữ ở 4oC, trong ống nghiệm dùng làm vật

liệu khảo sát khả năng đối kháng với bệnh thối củ gừng do vi khuẩn Ralstonia

solanacearum gây ra

Các chủng vi khuẩn vùng rễ phân lập được ghi kí hiệu theo tên huyện thu mẫu (CP- Châu Phú, TT- Tri Tôn, CM- Chợ Mới), tiếp theo là theo số thứ tự ruộng thu mẫu trong cùng huyện (1-30), e: nội sinh và t: có xử lý nhiệt

Ví dụ: tên chủng vi khuẩn vùng rễ phân lập được là CP25.2t có nghĩa là mẫu

vi khuẩn phân lập ở huyện Châu Phú, ruộng thứ 25, khuẩn lạc số 2 trong đĩa môi trường, có xử lí nhiệt

2.2.3 Xác định nhóm vi khuẩn bằng cách nhuộm Gram và quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học

Sau khi tách ròng, tiến hành nhuộm gram để bước đầu xác định vi khuẩn Phương pháp nhuộm gram (Prescott và ctv., 2002)