Thực nghiệm về thành phần hóa học cây cỏ mực

Thực nghiệm về thành phần hóa học cây cỏ mực

_Liận án thạc sĩ _ Khoa Học Hóa Học VO Thar Thy

rước khi tiến hành li trích, cô lập và xác định các hợp chất trong cây có nqmực, chúng tôi tiến hành các bước sau

mm @ Tỉnh chế dụng môi :

-Eter đầu hỏa :chưng cất ở phân đoạn 60-902C, làm khan với sợi natri kim loại,

- Benzen : lắc với HạSO, 20%, rửa nước, làm khan bằng Na;SO¿ hoặc CaCh

trong 24 giờ, chưng cất ở phân đoạn S8OPC, làm khan với sợi natri kửm loại

- EHl eter chưng cất ở 34,5°C, làm khan với CaC];, tiếp tục làm khan với sợi natr! kun loại

- Etanol chưng cất phân đoạn ở 78C,

- Metanol chưng cất phân đoạn ở 642C

- Cloroform lắc với nước 3-4 lần để loại alcol, chưng cất phân đoạn ở 61°C, lam khan v6i CaCh

- Etil acetat lắc với nước, chưng cất phân đoạn ở 78°C, làm khan với MgSOu

- Aceton chung cat phan doan 6 56°C

ø ly trích mẫu cây

Chúng tôi tiến hành li trích mẫu cây bằng các dung môi khác nhau: eter dầu

hỏa, cloroform và etanol thu được các loại cao tương ứng,

©Ồ Thuốc thử

Ngoài một số thuốc thử phục vụ cho phần khảo sát định tính, chúng tôi còn sử

dụng thuốc thử hiện hình là hơi iod, acid H;SO¿ đậm đặc, acid phosphomolibdic 10%

trong etanol, FeCl, 5% trong metanol

e Cột sắc kí

Sử dụng kỹ thuật sắc kí cột khô nhanh, cột sắc kí là phễu lọc xốp được gắn vào

hệ thống hút chân không, cho từ từ silica gel (G0H, Merck) vào cội, ép chặt lớp silica gel nay đưới sự trợ giúp của máy hút chân không cho cột thật cứng Bão hòa

cột bằng dung môi sắp giải H đến khi cột rút khô mà không nứt (khoảng một giờ) Nạp cao vào đầu cột

ø Thiết bị

- Máy cô quay RE l11 Rotavapor Kèm bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath

- Bép LW-8 Water Bath

- Soxhlet cdc loai: 1 lit, 2 lit, 10 lit

Luận án thạc sĩ Khoa Học Hóa Học Võ Than Thúy

1 ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ CẤU TỪ HỮU CƠ TRONG LÁ, THÂN, RE CAY CO MỤC:

Tiến hành định tính sự hiện điện của các cấu tử hữu cơ có trong các cao eter

dau hỏa, cao cloroform, cao etanol và bột khô của lá, thân, rễ cây cô mực Các cao

được điều chế theo sơ đồ 3

Li Dinh tinh sterol:

Định tính sierol bằng phần ứng hiện mầu với các thuốc thử sau:

e© Thuốc thử LIEBERMANN-BURCHARD: anhidric acetic (20ml), HạSO (1ml) Trắc nghiệm đương tính cho màu xanh lục, hổng, cam hoặc đổ Màu này bên vững sau

ruột thời gian

e Thuốc thử SALKOWSKI: H;ạSO¿ đậm đặc Trắc nghiệm dương tính cho màu đỏ

e Thuốc thử ROSENHEM : acid tricloroacetlic 90% Trắc nghiệm đương tính sẽ cho

màu tím Màu này sẽ chuyển sang xanh lơ sau 20 phút,

Thực nghiệm : LẤy 1g mẫu ngâm trong cloroforro (5Oml), sau 1 giờ, lấy dich

lọc

đem thử Cho dung địch thử vào ống nghiệm, nhỏ từ từ thuốc thử vào

1.2 Dinh tinh flavon:

Định tính flavon bằng phần ứng CIANDIN của WILSTATER: Mg kim loại, HCI

đậm đặc, trong môi trường etanol, alcol isoamil Trắc nghiệm dương tỉnh cho màu

hồng từ từ chuyển sang cam, vàng, đó, tím

Thực nghiệm : Bột khô (10g) được nấu trong nước cất (100ml), còn cao được

hòa tan trong eianol đun nóng trong 1 giờ Để nguội, lọc Lấy dịch lọc làm mẫu thử

e Ống nghiệm kiếm chứng :1-2ml dụng dịch mau

e Ong nghiém phan ting: 2mi dung dịch mẫu thử +5ml HCI đậm đặc + 0,1g Mẹ, để yên cho đến hết súi bọt khí, đun nóng đồng thời nhỏ từ từ alcol isoamil theo thành

ống nghiệm Từ từ xuất hiện một vòng mầu hồng, để hoặc ánh đỗ chứng tổ có sự

hiện điện của flavon

1.3, Định tính tanin:

Định tính tanin bằng các thuốc thử sau:

ø Thuốc thử STIASNY: Formol 36% (20m), HCI đậm đặc (10ml ) Cho dung dich

mẫu vào ống nghiệm, nhỏ thuốc thử vào, đun nóng Tanin sẽ trầm hiện khối vô định

e® Thudc th GELATIN: Gelatin (2g), NaCl bao hoa (10ml) Cho trầm hiện vàng

PHAN THIC NGHEM

Luận án thạc aT Khoa Học Hóa Học Võ Thai: Thúy

nhạt, để lâu hóa nâu

® Dung dịch Pbh(AcO); bão hòa

ø Dùng dich FeCl, 10% Cho mầu xanh đen hoặc lục

Thực nghiệm: đun 5g mẫu trong 100 ml nước khoảng lgiờ, lọc, lấy dich loc

làm dụng dịch thử Thực hiện các phần ứng màu với thuốc thứ,

1.4 Định tính glicosid:

Giicosid được xác định bằng các phần ứng mầu và phản ứng phát huỳnh quang Phần ứng có màu dựa trên phản ứng đặc trưng của phần đường như phần ứng TOLLEN (AgNO;/NH,OH), phan ứng KELLER-KHIANI (đặc trưng của đường 2- deoxi); phan ứng XANTHIDROL; phân ứng PESEZ

Phần ứng màu của phần không đường như phần ứng:

- Phản ứng BALIET: Dung dịch acid picric 1% trong metanol 20%, dung dich

NaOH 5%, nếu thấy xuất hiện màu vàng cam hoặc hồng sẫm là phản ứng dương

tính

- Phần ứng MOLISH: Thimol xanh 2% (1-2 giọÐ trong HạSO¿ đậm đặc (1m])

- Phan ứng LEGAL: Hòa tan mẫu trong 2-3 giọt piridin, thêm một giọt natri

nitroprussiat 0,5% mới pha, rồi cho từng giọt NaOH 2N

- Phan ing KEDDE: Dung dich A: acid 3,5-dinitrobenzen trong alcol

Dung dich B: KOH 5% trong nước,

- Phan ting RAYMOND: déng thể tích m-dinitrobenzen 1% trong nước và

NaOH 20% trong nước

- Phan ứng huỳnh quang đặc biệt dùng để nhận danh các glicosid trợ tim có

nhóm OH ở vị trí Cụa

Thực nghiệm : Để xác định sự hiện diện của glicosid, chúng tôi thực hiện

phương pháp SOOS (có sửa đổi) (sơ đồ 4)

Tận trích 5g cao với 20ml etanol 20% trong 24 giờ Lọc, chế hóa dịch lọc với 20ml dụng địch chì acetat 20% Lọc, lấy địch để chế hóa với 10ml đụng dịch NazSO,

bão hòa, Lọc, cô cạn dung dịch dưới ấp suất kém ở 40C, thu được cặn Hòa tan cặn này trong etanol 95% Lọc, lấy dịch lọc thử với các thuốc thử TQOLLENS, BALIET và

Với mẫu cao, hòa tan cao trong dụng môi đã dùng để b trích, lấy dịch đã hòa tan đem thử với các thuốc thử

1.5 Định tính alcaloid:

Định tính alcaloid bằng các thuốc thử:

a TT +

Luận án thạc sĩ Khoa Học Hóa Học Võ Thah Thủy

® Thuốc thử BOUCHARDAT: iod (2,5g), KI (5g), nước cất (100ml) Trắc nghiệm dương tính khi cho kết tủa nâu hoặc vâng đậm Cho thuốc thử vừa đủ, nếu dư sẽ hòa

tan kết tủa,

se Thuốc thử HAGER: dung dịch acid picric bão hòa trong nước Cho kết tủa mầu

vàng

e© Thuốc thử DRAGENDORFE: BI(NO;); (20g), HNGŒ đậm đặc (30ml) hòa vào nhau, lọc Hòa KI (68g) trong nước cất (60ml) Sau đó hòa 2 hỗn hợp trên vào nhau, để

yên 24 giờ, lọc, thêm nước vừa đủ 250ml Trắc nghiệm dương tính khi cho màu vàng

cam

ø Thuốc thử BERTRAND: acid silicotungstic (5g), nước cất (100g) Cho kết tủa

trắng, đun nóng cho màu vàng nâu

Thực nghiệm: theo hai phương phấp:

« Phương pháp HAROLD ST IOHN: gồm hai phần

Lấy 5g mẫu khô trích bởi 100ml HCI 10% ở 80°C trong 4-6 gid Loc dich dé

thử nghiệm Chỉ dùng khi alcaloid 6 dang tr do vi thudc thif cho kết tủa với muối

acid

Lấy 5g mẫu khô trích nguội với dung dịch PROLLIUS (etil eter :etanol 95%: cloroform:amonium hidroxid 20-50% theo ti 18 25:8:8:1 vé thé tich) trong 24 gid

Lác, lọc lấy dịch thứ

e Phuong phap SCHREIBER:

Lấy 5g mẫu khô trích với etanol 95% (150ml) trong 2 giờ Lọc lấy dịch alcol

Cô dưới áp suất thấp thu cặn Hòa tan cận trong hệ dụng môi etil eter:cloroform

(1:1) và HƠI 1% Dịch acid làm dịch thử

2 CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY CỔ MỤC

2.1.Trích H cô lập hợp chất Eelipta T, và Eclipta T, từ qui trình Hi ích

sesguiterpen lacton theo Govindachari '®:

Tiến hành qui tình l¡ trích và cô lập wedelolacton ctia Govindachari ©! (so đỗ 8) Chúng tôi thu được tính thể hình kim, mầu vàng lục, điểm nóng chảy 327-329°%C khi két tinh cain Ay, kết quả sắc kí lớp mồng cho một vết duy nhất màu tím với FeCh

5% trong metanol c6 Ry= 0,5 ; hé dung li benzen:metanol (3:1) Dat tén 1a Echipta

` Thực hiện sắc kí cột khô nhanh trên mẫu cao nạp vào cột là cặn

À¿ với dung địch giải li từ cloroform, etil acctat, metanol Hứng dung dịch giải lí qua

cột mỗi lọ 30ml, theo đõi bằng sắc kí lớp mồng Kết quả thu được 4 phân

đoạn được đánh số từ

Luan &n thac et Khoa Học Hóa Học

võ Thah Thúy

LIV (bang 8) Trong đó, chúng tôi chỉ khảo sát phân đoạn HI do lớp mồng cho 1 vết

Tay vậy cao của phân đoạn HH thu được có hai dạng tỉnh thể nên chúng tôi tiến

hành tỉnh chế chất bằng sắc kí điều chế,

Kết quả sắc kí điều chế thu được 300mg tỉnh chất màu trắng đục Sắc kí lớp

mỏng cho một vết duy nhất có R¿= 0,42 ; hệ đụng li etil acetat:metanol (9:1), nhiét

độ nóng chay 204°C Chúng tôi đặt tên là Eclipta Tụ

3.2 Cô lập một số hợp chất hữu cơ trong cây có mực từ cao eter đầu hỗa:

Hòa tan 20g cao eter dầu hỏa, trộn với silica gel loại dùng cho sắc kí cột Đuối

dung môi đến khô (bằng máy hút chân không) Thực hiện sắc kí cột khô nhanh trên

phểu lọc xốp với chat hap phu silica gel (loai dùng cho sắc kí lớp mỏng) Tiến hành giải l với các dung môi từ không phân cực đến phân cực Mỗi lọ hứng 5Ôml, được theo đối bằng sắc kí lớp mỏng

Chúng tôi thu được 7 phân đoạn đánh số từ 1-7 trong bảng 9 Trong đó chúng tôi chỉ khảo sát phân đoạn 1 và 2 Các phân đoạn còn lại tuy trọng lượng lớn nhưng

đo sắc kí lớp móng cho nhiều vết gần nhau nên chúng tôi chưa khảo sát

2.2.1 Cô lập hợp chat Eclipta T2:

Phân đoạn | (3-641) cla bảng 9 có kết quả sắc kí lớp mỏng với hệ dung li

benzen:etil acetat (7:3) cho 4 vết Trong đó cặn thu được khi cô cạn dung môi có

đạng sệt và lẫn nhiêu tỉnh thể hình kim mầu trắng Sau khi kết tỉnh lại nhiều lần,

chúng tôi thu được tính thể màu trắng Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất có

R; = 0,55 ; hé dung li benzen:metanol (11:0,5), điểm nóng chay 164-166°C Chúng tôi đặt tên là Eclipta T¿ (300mg)

Nước rửa qua lọc khi thu hồi dung môi có được lượng cao khá lớn nhưng sắc kí

lớp móng cho nhiều vết gần nhau nên chúng tôi chưa khảo sắt tiếp

2.2.2 Cô lập hgp chat Eclipta T;:

Phân đoạn 2 (642-1025) của báng 9 có kết quả sắc kí lớp mồng với hệ dung li

benzen:etil acetat (7:3) cho 2 vết đậm Cao thu được có dang sệt như dầu mầu vàng

sáng lẫn rất nhiều tỉnh thể hình kim Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất có

R; = 0,52 ; hé dung li benzen:metanol (11:0,5), c6 diém néng chay 156-158°C

Nước rửa qua lọc được sắc kí lớp móng với hệ dung l¡ cloroform cho nhiều vết

nên chúng tôi chưa khảo sát

Luan an thac st Khoa Hoc Héa Hoc VO Tharh Thiy

2.2.3 A cetil hóa 2 hợp chất Eclipta T; và hợp chất Eclipta T;:

20-30 mg mẫu +1ml anhidric acetic + 1ml piridin Để yên ở nhiệt độ phòng 24

giờ Kiểm tra lại bằng sắc kí lớp mỏng để đảm bảo hợp chất đã được acetil hóa

hoàn toàn

Cho hỗn hợp phần ứng vào bình long, trich vdi etil eter (5x20ml) Lay ldp eter riêng, rửa lại với nước cất (3x20ml nước)

Lấy lớp etil eter làm khan với NazSO¿, lọc, đuổi dung môi, sấy khô, thu được

tỉnh thể không màu

3 THỬ NGHIỆM TÍNH KHÁNG KHUẨN:

3.1 Dụng cụ và vật liệu:

e Vị khuẩn thử nghiệm: thử nghiệm trên 4 chủng vi khuẩn: Bacilus subiilis;

Staphylococcus aureus; Pseudomonas aeruginosa; Escherichia coli Cac ching vi

khuẩn này được giữ trong môi trường BHI + 5% glicerol ở nhiệt độ âm 26°C trong

các ống eppendorf và được cấy chuyền 2 tháng 1 lần

e Niôi trường kháng sinh đề: sử dụng môi trường Mueller Hinton Agar (MHA)- môi trường tiêu chuẩn cho kháng sinh đổ, sản phẩm của hãng Biolife

e Mau thi nghiệm: stigmasterol, 3-O D- glucopyranosil của acid echinocystic và

poriferasterol Mẫu thử nghiệm được giữ ở 4°C trong lọ có nắp vặn chặt

e Dụng cụ gồm: các đĩa giấy có đường kính 6mm được tiệt trùng qua nổi hấp

Autoclave ở 121C trong 30 phút và sấy khô hoàn toàn; các hộp Petri nhựa có đường

kính 90mm vô trùng và que bông (để trải vì khuẩn) vô trùng

3.2 Phương pháp tiến hành:

e Chuẩn bị vỉ khuẩn thử nghiệm: từ các ống eppendorf giữ chủng, vi khuẩn được cấy chuyển ra trên mặt thạch dinh dưỡng thường (Nutrient agar) đối với các chủng B.subtilis, S.aureus, P.aeruginosa, E.coli Ủ các hộp thạch đã có vi khuẩn ở 37C

qua đêm Sau khi các khuẩn lạc (vi khuẩn sinh sản mọc thành khóm) xuất hiện,

chọn 3-5 khuẩn lạc riêng lẻ, giống nhau để làm một huyền dịch vi khuẩn trong ống

nghiệm chứa 5m] nước muối sinh lí sao cho đạt độ đục 0,5 McF (tương đương với

10° CFU/ml)

e Chuẩn bị hộp thạch thử nghiệm: cần 38g môi trường MHA trong llít nước cất, đun cách thủy đến tan hoàn toàn Khử trùng bằng nổi hấp Autoclave ở nhiệt độ

1210C trong 30 phút Sau khi để nguội đến nhiệt độ 50C bắt đầu phân phối ra các

Luan an thac st Khoa Hoc Héa Hoc V6 Tharh Thiy

dia Petri v6 tring Trong một đĩa Petri có 22ml thạch tương đương với độ dày 4mm Các hộp thạch này được ủ qua đêm 6 37°C để kiểm tra sự vô trùng Loại bổ các hộp

thạch bị nhiễm Dùng que bông vô trùng nhúng vào huyền dịch vi khuẩn đã chuẩn

bị ở trên rồi trải đều chủng vi khuẩn thử nghiệm trên mặt thạch của môi trường

MHA

e Làm kháng sinh đồ: sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch Mỗi đĩa giấy

được tẩm 20ul dung dịch chất kháng khuẩn và để bay hơi hết dung môi Dùng kẹp

vô khuẩn kẹp đĩa giấy chứa chất kháng khuẩn đặt lên mặt thạch thử nghiệm Làm tương tự với mẫu trắng là đĩa giấy chứa dung môi đã bay hơi Lật ngược hộp thạch

và ủ ở 37°C Sau 18 giờ đọc kết quả đường kính vòng vô khuẩn là vòng không có vi khuẩn mọc xung quanh ổïa giấy thử nghiệm

3.3 Kết quả:

Mỗi chủng vi khuẩn làm 3 lần và lấy kết quá trung bình Đường kính vòng vô khuẩn được tính bằng mm

PHAN THIC NGHEM Tra 46