Thực nghiệm về thành phần hóa học cây chổi xuể

Thực nghiệm về thành phần hóa học cây chổi xuể

Can dién ty SARTORIUS GP 1503P va METTLER BD 202

Bộ chưng cét CLEVENGER (phu luc 15)

Lo vi séng gia dung TOSHIBA ER - 657 VL cải tiến (phụ lục 16)

Máy đuổi dụng môi HEIDOLPH VV 2000

Cột sắc ký

Hệ thống chưng cất phân đoạn

Khúc xạ kế WAY ~ S ABBE

Triển quang kế WZZ ~ 2 AUTOMATIC POLARIMETER

Máy hồng ngoại SHIMADZU IR - 470

Máy sắc ký khí ghép khối phổ HP 6890 SERIES H

- Cột mao quan Model Nụ, HP 19091 § - 423 HP 5MS 5% phenilmetilsiloxan 30,0m x 250m x Ô,25nm

- Split raHo : 40 : Ì

- Nhiệt độ Inlets 250°C

- Khí mang He : áp suất 6,5 pSi; tốc độ : 0,9ml/phút,

- Chương trình nhiệt : nhiệt độ ban đầu : 50C, tăng 5°C/phút đến 90°C, giữ

yên 20 phúi, tăng 10”C/phút đến 150°C, giữ yên 5 phút, tăng 15°C/phúi đến 250°C, giữ yên 3 phút

4.1.2 Nguyên liệu

Miẫu chối xuể được thu hái vào tháng 9 năm 2001 tại 3 địa phương :

- Ấp Luân Phú, xã Đồng Văn, huyện Thanh Chương, tính Nghệ An

- Ấp Vĩnh Phước, phường Triệu Lương, thị xã Đông Hà, tỉnh Quảng Trị.

48

- thôn 2, xã Duy Trinh, huyện Duy Xuyên, tính Quảng Nam

4.1.3 Hóa chất

ĐieUl cter đã tính chế, Na;SO, khan, HƠI, KOH, NaOH, etanol 95%,

phenoltalein, alumin trung tính hoạt độ II, eter dầu hỏa 45° - 60°C, benzen, anhydrit phtalic, etil acetat, acid phosphoric

4.2 KHẢO SAT TINH DAU CHOI XUE

4.2.1 Ly trích tính dầu chối xuế

Tên khoa học cây chối xuể đã được định danh tại Bộ môn Thực vật, Khoa

sinh Trường ĐHKHTN TP.HCM

Nguyên liệu sau khi thu hái được phơi khô ở nhiệt độ phòng Tách riêng lá

và cành, sử dụng nguyên liệu khô để ly trích tỉnh dầu

Thành phần bách phân các cấu tử trong tỉnh đầu được xác định bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC - MS)

4.2.1.1 Phương pháp chưng cất hơi nước cổ điển

Nạp 200g nguyên liệu và Vựmp nước vào bình cầu 2 lít Ráp hệ thống chung cất (phụ lục 15) Tiến hành chưng cất tình dầu trong những khoảng thời gian xác

định tùy theo từng thí nghiệm Để nguội, trích lại phần nước chứa tính dầu trong

ống gan bing dietil eter Lam khan dung dich dieti] eter bang Na,SO, khan Loc,

thu hổi dung môi đưới áp suất kém Cân xác định lượng tình đầu ly ních được Kết quả ghi trong phần nghiên cứu

4.2.1.2 Phương pháp chưng cất hơi nước dưới tác dụng của vì sống có cho

nước vào nguyên HIỆN

Cho 50g nguyên liệu và Vự„y nước vào bình cầu ï li Ráp hệ thống chưng cất có sư hỗ trợ của vi sóng (phụ lục 16) chiếu xạ mẫu với công suất 600W trong

các khoảng thời gian xác định Để nguội hệ thống, trích phân nước chứa tỉnh dau bang dietil eter Tiếp tục ly trích tỉnh đầu như phần trên Kết quả ghi trong phần

nghiên cứu

4.2.2 Xác định chỉ số vật lý và hóa học

4.2.2.1 Chỉ số vật lý

Tiến hành xác định tÍ trọng, góc quay cực và chỉ số khúc xạ, độ hòa tan

trong etanol của tỉnh đầu tại Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa, Trường Đại Học

Khoa Học Tự Nhiên

4.2.2.1.1 Tỉ trọng của tỉnh dầu

TỈ trọng của tỉnh đầu được xác định bằng tỉ số giữa khối lượng tính đầu và

khối lượng nước cất có cùng thể tích ở cùng một nhiệt độ Cân trên cân phân tích

trọng lượng bình đo tí trọng mạ Cho nước cất 2 lần vào bình đo tỉ trọng cho tới

khi đây bình, cân trên cân phân tích xác định Mino: Để bình khô, tương tự cho

tính dẫu vào đến đây bình, xác định mrp Mỗi thí nghiệm tiến hành 3 lần Kết

quả ghi trong phần nghiên cứu

Tỉ trọng được tính theo công thức sau :

az TD

20 =

My50

4.2.2.1.2 Gác quay cực

Cho khoảng 10ml tỉnh dầu vào ống đo góc quay cực đãi ldm, thực hiện việc

do kha nang lam quay mat phẳng ánh sáng phân cực trên triển quang kế Thực

hiện phép đo 3 lần Kết quả trung bình ghi trong phần nghiên cứu.

30

4.2.2.1.3 Độ hòa tan trong etanol

Cho 1ml tỉnh đầu vào ống nghiệm Từ buret nhỏ từ từ etanol 80% xuống ống

nghiệm, vừa nhỏ vừa lắc cho đến khi dung địch trong ống nghiệm trong suốt thì

dừng lại Kết quả ghỉ trong phần nghiên cứu

4.2.2.2 Chỉ số hóa học

Chỉ số acid, xà phòng hóa và chỉ số ester của tỉnh dầu chối xuể được xác

định theo tiêu chuẩn TCVN 189 — 1993

4.2.2.2.1 Chỉ số acid (IA)

Chuẩn bị chất chỉ thị mầu phenolptalein 2g/1 trong etanol 95% Cân khoảng

0,5 + 0,0005g tỉnh dâu chối xuể vào erlen 125ml, thêm 5ml etanol, nhỏ Ì giọt chỉ

thị phenolptalein Thực hiện việc chuẩn độ bằng cách nhỏ từ từ đụng dich KOH

0,1N từ microburet vào erlen cho đến khi dung dịch vừa xuất hiện màu hồng

Thực hiện phép đo 3 lần, Ghi nhận thể tích Vyou dung dịch KOH dùng để chuẩn

Chỉ số acid được tính theo công thức sau :

561

FTD

TA = XVKOH

Kết quả ghi trong phần nghiên cứu

4.2.2.2.2 Chỉ số xà phòng (15)

Cho khoảng 0,5 + 0,0005g tỉnh đầu cho vào bình câu 100ml, Thêm vào

20ml dung dịch KOH 0,1N Đun hoàn lưu trong 2 giờ, để nguội, thêm 1 giọt chỉ

thị phenolptalein, chuẩn độ ngược bằng dung dịch HCI 0,1N Nhỏ từ từ dụng dịch

HCI 0,1N từ buret vào bình cầu cho đến khi dung dịch vừa mất màu hồng Thực

hiện phép do 3 lần Ghi trọng lượng tỉnh dầu mrp,Vị mÌ thể tích dung dịch HCI 0,1N dùng để chuẩn.

Thực hiện tương tự với mẫu trắng là 0,5 + 0,0005g nước cất, ghi nhận giá trị

Vo ml thé tích dung địch HCI 0,1N dùng để chuẩn,

Chỉ số xà phòng được tính theo công thức sau :

1S = 26! K(Vg ~V,)

Mrp

Kết quả ghi trong phần nghiên cứu

4.2.2.2.2 Chỉ số ester (IE)

Là hiệu số của chỉ số xà phòng và chỉ số acid : IE=lS ~ IA

Kết quả ghi trong phần nghiên cứu

4.3 TÁCH MỘT SỐ CẤU TỬ CHÍNH TRONG TINH DẦU CHỔI XUỂ

Chạy cột sắc ký nhiều lần Mỗi lân tiến hành với khối lượng tinh dầu 10g

4.3.1, Tach hydrocarbon terpen

Lắp cột sắc ký với chất hấp phụ alumin trung tính hoạt độ II theo

BROCKMAN, tỉ lệ alumin : tính dầu là 40:1 Cho 10g tỉnh đầu vào cột rửa giải

với eter dau héa (45° - 60°C) Tat cA cdc hydrocarbon terpen dude tach ra khdi cột sắc ký Đuổi dung mới thu được 5,982g Chưng cất phân đoạn này cho 0,2l5g

œ - pinen Ðs : 155” - 156°C và 2,873g y - terpinen Ðs : 182° - 183°C Các đặc tính

của œ - pinen và y - terpinen được ghi trong phần nghiên cứu

4.3.2 Tach eter

Rửa giải tiếp cột sắc ký với hỗn hợp benzen - eter 30 : 70, tat cá các eter và

ester déu được tách ra kèm theo một phần nhỏ alcol Đuối dung môi thu được

1,280g Chưng cất phân đoạn này thu dude 1,8 - cineol Ds : 175° - 178°C Cho

một lượng phosphoric acid vào cineol vừa chưng cất theo tỉ lệ mol cineol :

phosphoric acid 1A 1: 2 Lam lạnh, một phức rắn cineol - phosphoric acid tạo thành, Tách chất lống khói phức, hòa lại phức trong nước nóng, cineol được tách

ra và được làm khan với Na;SO,, lọc, chưng cất thu được cineol tinh khiét

Đs: 176” - 177°C Các đặc tính của cineol được ghi trong phần nghiên cứu

4.3.3 Tách alcol

Rửa giải tiếp cột sắc ký với hỗn hợp benzen - etil acetat theo tỉ lệ 40 : 60, toàn bộ alcol được tách ra Đuổi dung môi thu được 1,496g Trên phân đoạn này

với phân đoạn 2 vừa tách cineol Chuyển alcol về dạng phtalat acid rắn

Cho vào bình cầu 5g anhydrid phtahc 5ml tình đầu trong phân đoạn 3 va

50ml toluen Ðun hoàn lưu đến khi toàn bộ anhydrid phíalhc hòa tan (khoảng l5

phút) và đun tiếp 20 phút nữa, Chưng cất dưới áp suất kém thu hổi toluen Để

nguội, phialat acid kết tỉnh Làm lạnh, lọc áp suất kém, rửa với eter lạnh, thu được phtalat acid dang tinh thể rắn

- + ROH ———> CL

COOH

Hoa tan “lat seid rắn trong dung dich NaOH 10% va đun hoàn lưu trong

2 giờ Alcol terpen tách ra khỏi dung dịch natri ph†alat

dd NaOH NaGH CL + ROH

Tách alcol terpen, rửa với nước, làm khan với Na;SO, và chưng cất đưới áp

suất kém thu được neroldol Ðs : 145°C/12mm Các đặc tính của nerohdol được

ghi trong phần nghiên cứu,

4.4 THU NGHIEM TINH KHANG KHUẨN

Việc thử nghiệm tính kháng khuẩn của tình dầu chối xuể được thực hiện

trên 7 chúng vi khufn : Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Samonella enteritidis, Escherichia coli, Streptococcus

pneumoniae Thực hiện tại Khoa Sinh ~ Bộ môn Vị sinh - Sinh học Phân tử,

Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, TP.HCM Thử nghiệm tính kháng khuẩn

theo phương pháp khoanh giấy

4.4.1 Phương pháp nguyên cứu

- Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm : các chủng vi khuẩn trên được giữ trong

môi trường BHI + 5% ghcerol ở nhiệt đệ — 26°C trong các ống eppendorf và được

cấy truyền 2 tháng mội lân

- Môi trường kháng sinh để : sử dụng môi trường Mueller Hinton Agar

(MHA), môi trường tiêu chuẩn cho kháng sinh để, sản phẩm cha hing BioLife

- Mẫu thử nghiệm là tĩnh dâu chổi xué được giữ ở 4°C trong lọ có nắp văn chặt

- Dụng cụ : các đĩa giấy có đường kính 6mm được tiệt trùng qua nổi ấp Autoclave 6 121°C trong 30 phút và sấy khô hoàn toàn, các Petri nhựa có đường

kính 90mm vô trùng, que bông (để trải vi khuẩn) vô trùng

4.4.2 Phương pháp tiến hành

4.4.2.1 Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm

Từ các ống eppendorf giữ chủng, vi khuẩn được cấy truyền trên mặt thạch

dinh du@ng thudng (Nutrient agar) đối với các ching vi khudn S.aureus, E.Coli,

P.aeruginosa, V.cholerae, B.subtilis, S.enteritidis và trên môi trường thạch mấu

(Blood agar) đối với chúng vi khuan S.pneumoniae Ủ các hộp thạch đã có vị

khuẩn ở nhiệt độ 37°C qua đêm

Sau khi khuẩn lạc vi khuẩn sinh sẵn tạo thành khóm) xuất hiện, chọn 5 - 5

khuẩn lạc riêng lẻ, giống nhau để làm một huyền dịch khuẩn trong ống nghiệm

chứa 5ml nước muối sinh lý sao cho đạt độ đục 0,5MCF (tương đương với 107

CEU/ml) hay tương đương với GD¿so trong khoảng 0,08 - 0,1.

54

4.4.2.2 Chuẩn bị hộp thạch thứ nghiệm

Can 38g méi tring MHA trong mét lít nước cất, đun cách thủy đến tan hoàn toàn Khử trùng bằng nổi hấp autoclave ở nhiệt độ 121°C trong 30 phút, Sau

khi để nguội đến 5SO°C bắt đầu phân phối ra các đĩa Petri vô trùng Trong đĩa

Petri có đến 24mi thạch tương đương với độ dày 4mm Các hộp thạch được ủ qua

đêm ở 37°C để kiểm tra sự vô trùng Loại bỏ các hộp thạch bị nhiễm

Ding que bông vô trùng nhúng vào huyền dịch vi khuẩn đã chuẩn bị ở trên

rồi trải đều chủng vị khuẩn thử nghiệm trên mặt thạch của môi trường MHA

Đối với chủng S.pneumoniae thì môi trường bổ sung thêm 5% máu cừu đã

loai fibrin

4.4.2.3 Thực hiện kháng sinh đồ

Sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch

Dùng kẹp vô khuẩn kẹp đĩa giấy tẩm tình dầu đặt lên mặt thạch thứ nghiệm lâm tương tự với mẫu trắng là đĩa giấy tẩm nước cất Lật ngược hộp thạch và ủ ở

37°C, Sau 18 giờ đọc đường kính vòng vô khuẩn là vòng không có vi khuẩn mọc

xung quanh đĩa giấy thử nghiệm Kết quả ghỉ trong phần nghiên cứu