Thiet bi va ktcnsh 05 kỹ thuật lamp

• Đây là một phương pháp khuếch đại ADN có tính đặc hiệu, hiệu quả cao và thời gian ngắn bằng cách tận dụng ưu điểm của Bst ADN Polymerase Bacillus stearothermophilus và Trang 3 • Dù m

KỸ THUẬT LAMP

(LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL

AMPLIFICATION)

1.TỔNG QUAN KỸ THUẬT LAMP

• LAMP là viết tắt của từ “LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION” có nghĩa là sự khuếch đại ADN ở điều

kiện đẳng nhiệt thông qua cấu trúc vòng hay móc (loop)

• LAMP được phát triển đầu tiên vào năm 2000 bởi nhóm tác giả T Notomi (Nhật Bản)

• Đây là một phương pháp khuếch đại ADN có tính đặc hiệu, hiệu quả cao và thời gian ngắn bằng cách tận dụng ưu điểm

của Bst ADN Polymerase (Bacillus stearothermophilus) và

một loạt 4 mồi được thiết kế đặc biệt để nhận diện toàn bộ

6 trình tự cách xa nhau trên ADN đích

• Dù mới ra đời nhưng LAMP cũng đã được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực như chuẩn đoán mầm bệnh, virus trong thủy sản, phát hiện nhanh vi sinh vật trong thực phẩm, môi trường,…LAMP

là một phương pháp khuếch đại gen tiềm

năng có nhiều hứa hẹn nếu tiếp tục được

nghiên cứu và thử nghiệm để áp dụng vào

những hướng nghiên cứu mới

• Sử dụng 4 mồi (primer) khác nhau được thiết kế đặc biệt

nhận ra 6 đoạn riêng biệt trên gen đích (target gene) và quá trình phản ứng xảy ra ở nhiệt độ cố định dùng phản ứng thay

thế mạch

• Khuếch đại và phát hiện gene có thể được hoàn thành chỉ

trong 1 bước bằng cách ủ hỗn hợp mẫu, primers, DNA

polymerase có hoạt tính thay thế mạch và chất nền ở nhiệt độ

• Hiệu quả khuếch đại rất cao

• Thiết kế 4 primers nhận ra 6 đoạn riêng biệt, phương pháp LAMP có thể khuếch đại đặc hiệu đoạn gen quan tâm

• Tổng giá thành có thể được giảm vì LAMP không đòi hỏi hoá chất đặc biệt và thiết bị phức tạp

2 NGUYÊN LÝ KỸ THUẬT LAMP

• Phương pháp này dựa trên sự tổng hợp ADN thay thế chuỗi tự xoay vòng được thực hiện bởi

một Bst DNA polymerase (Bacillus

stearothermophilus) và hai cặp mồi trong và mồi

ngoài được thiết kế đặc biệt

• Ở các bước đầu của phản ứng LAMP cả 4 mồi

được sử dụng, nhưng sau đó trong suốt phản

ứng chu kz chỉ các mồi trong được sử dụng để tổng hợp ADN thay thế chuỗi

• Để khởi đầu cho chu kì phản ứng LAMP, FIP

bắt cặp bổ sung với ADN đầu vòng ở vị trí F2c

để tiến hành tổng hợp mạch bổ sung thay thế Mặt khác, BIP sẽ bổ sung vào đầu kia của

mạch ADN đầu vòng và xảy ra quá trình tổng hợp ADN tương tự;

• Kết quả của phản ứng là hỗn hợp các sợi đôi ADN chứa nhiều trình tự ADN mục tiêu với

kích thước khác nhau

• Cặp mồi trong gồm 2 mồi là mồi xuôi (forward inner primer- FIP), và mồi ngược (backward inner primer- BIP) và mỗi một mồi có chứa hai trình tự riêng biệt tương ứng với trình tự sense và antisense của ADN đích Trình tự FIP và BIP sẽ được thiết kế như sau:

• +FIP chứa F1c, một đoạn TTTT và một trình tự F2 bổ sung với F2c

• +BIP sẽ chứa trình tự B1c bổ sung cho B1, một đoạn TTTT và B2

• +Hai mồi bên ngoài là B3 bổ sung cho đoạn B3c và trình tự F3 bổ sung cho F3c

• Để khởi động phản ứng LAMP, Bst DNA polymerase được sử dụng và ủ ở nhiệt độ

60 o C – 65°C trong 1 giờ Khi gen mục tiêu và các nhân tố cần thiết được ủ ở nhiệt

độ không đổi, các bước phản ứng xảy ra ban đầu như sau:

• Nguyên liệu ban đầu là sợi đôi ADN chứa gen mục tiêu

+ Bước 1: mồi xuôi FIP chứa trình tự F2 sẽ bổ sung vào mạch ADN ở vị trí F2c

+ Bước 2: DNA polymerase thực hiện kéo dài sợi ADN mới từ mồi FIP

+ Bước 3: mồi ngoài F3 bổ sung vào F3c và được kéo dài Sự tổng hợp sợi ADN mới bởi mồi này và DNA polymerase dẫn đến giải phòng sợi ADN tổng hợp từ mồi FIP + Bước 4: sợi đôi ADN được hình thành từ sợi khuôn và mồi F3

+Bước 5: sợi đơn ADN được tổng hợp từ mồi FIP và khuôn được giải phóng Vì đầu 5’ của sợi này có chứa 2 trình tự bổ sung nhau là F1c và F1 nên hình thành cấu trúc vòng

+ Bước 6: sợi ADN được tạo ra từ bước 5 sẽ làm khuôn cho mồi BIP tổng hợp sợi

mới và mồi B3 sẽ có chức năng như F3 là tổng hợp sợi mới và giải phóng sợi ADN mồi BIP

+ Bước 7: sợi đôi ADN được hình thành từ mồi B3 và sợi được tổng hợp từ bước 5 + Bước 8: sợi ADN được tổng hợp từ mồi BIP và sợi chứa mồi FIP sẽ hình thành cấu trúc vòng ở 2 đầu do sự bổ sung của 2 cặp trình tự với nhau

• Khi đoạn gene quan tâm và hoá chất được ủ ở nhiệt độ cố định khoảng 60-65°C trong vòng 45-60

polymerase có hoạt tính thay thế mạch, thay thế và giải phóng DNA mạch đơn Với phương pháp LAMP, không

giống như PCR, không cấn biến tính nhiệt đoạn DNA

mạch đôi thành mạch đơn Cơ cấu khuếch đại sau đây

giải thích từ khi FIP bám vào để giải phóng DNA template mạch đơn

Hình 2: Primer FIP bắt cặp với sợi DNA đơn

• Bước 2

Thông qua hoạt tính thay thế mạch của DNA

polymerase, đoạn DNA bổ sung cho template

DNA được tổng hợp, bắt đầu từ đầu 3’ của đoạn F2 của FIP

Hình 3: Tổng hợp mạch bổ sung

• Bước 3

F3 Primer bám vào đoạn F3c, ngoài FIP trên

đoạn DNA quan tâm và bắt đầu tổng hợp DNA thay thế mạch, giải phóng mạch bổ sung gắn FIP

Hình 4: Gắn primer F3 vào

• Bước 5

Đoạn bổ sung gắn FIP được tách thành mạch

đơn vì sự thay thế của đoạn DNA tổng hợp từ F3 primer Sau đó, mạch đơn được giải phóng tạo thành cấu trúc stem loop ở đầu 5’ do đoạn bổ

sung F1c và F1

Hình 6: Đoạn DNA đơn được tạo bởi primer FIP

• Bước 6

Đoạn DNA đơn trong bước (5) là template cho sự tổng hợp DNA do BIP khởi đầu và sự tổng hợp DNA

thay thế mạch do B3 làm mồi sau đó BIP bám vào

đoạn DNA tạo thành trong bước (5) Bắt đầu từ đầu 3’ của BIP, sự tổng hợp DNA bổ sung bắt đầu Thông qua quá trình này, đoạn DNA chuyển từ cấu trúc mạch vòng thành cấu trúc thẳng B3 primer bám bào bên ngoài

BIP và sau đó qua hoạt tính của DNA polymerase bắt đầu từ đầu 3’, DNA được tổng hợp từ BIP được thay

thế và giải phóng thành mạch đơn trước khi tổng hợp DNA từ B3 primer

Hình 7: Vị trí gắn primer BIP và B3

• Bước 7

Mạch đôi DNA được tạo thành qua quá trình điễn tả trong bước (6)

Hình 8: Tổng hợp mạch bổ sung nhờ primer B3

• Bước 8

Đoạn bổ sung gắn BIP thay thế trong bước (6)

tạo thành cấu trúc vòng ở mỗi đầu nhìn như cấu trúc quả tạ Cấu trúc này là cấu trúc khởi đầu cho vòng khuếch đại trong phương pháp LAMP Quá trình bên trên được coi như là quá trình tạo ra cấu trúc ban đầu cho vòng LAMP

Hình 9: Sự tạo thành đầu vòng của đoạn DNA đơn

• Bước 8-11

Cấu trúc DNA hình quả tạ nhanh chóng chuyển thành DNA mạch vòng

do tổng hợp DNA tự mồi FIP bám vào đoạn mạch đơn trong DNA vòng

và mồi quá trình tổng hợp DNA thay thế mạch giải phóng đoạn Dna

tổng hợp trước Mạch đơn giải phóng tao cấu trúc mạch vòng ở đầu 3’ tạo bởi đoạn B1c bổ sung và B1 Sau đó bắt đầu từ đầu 3’ của đoạn B1,

sự tổng hợp DNA dùng cấu trúc của mình làm template và giải phóng mạch bổ sung gắn FIP (Bước (9))

Mạch đơn mới được giải phóng tạo cấu trúc quả tạ vì hai đầu có đoạn

bổ sung F1 - F1c và B1c - B1 (Bước (11)) Cấu trúc này là cấu trúc ngược lai của cấu trúc tạo thành trong bước (8) Giống như từ bước (8) đến (11), cấu trúc trong bước (11) dẫn đến quá trình tổng hợp DNA tự mồi bắt đầu từ đầu 3’ trong đoạn B1 Hơn nữa, BIP bám vào đoạn B2c và bắt đầu sự tổng hợp DNA thay thế mạch, giải phóng đoạn DNA do B1 mồi Theo đó, cấu trúc tương tư như ở bước (9) và (10) cũng như

giống cấu trúc do bước (8) tạo thành Với cấu trúc tạo thành ở bước (10), BIP bám vào đoạn mạch đơn B2c, sự tổng hợp DNA tiếp tục bởi

sự thay thế đoạn mạch đôi DNA Kết quả của quá trình này là nhiều

cấu trúc bao gồm nhiều đoạn lặp lại ngược của đoạn quan tâm trên cùng một mạch được tạo thành

Hình 10: Tiến trình các bước 8 đến 11

• Đánh giá kết quả của LAMP

+ Đánh giá kết quả bằng điện di

LAMP có thể được đánh giá kết quả bằng điện

di Kết quả dương tính sẽ cho một vạch smear dài

• Đánh giá kết quả không bằng điện di

Do lượng sản phẩm của phản ứng LAMP rất lớn nên ta

có thể quan sát bằng mắt thường nếu có một số hóa chất

đo độ hấp thụ ở 650nm (nếu đạt đến 0,1 là dương tính)

• Trong quá trình khuếch đại DNA bằng DNA

polymerase, các ion pyrophosphate được tạo ra như một sản phẩm phụ từ bề mặt phản ứng

deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)

• Calcein trong hỗn hợp phản ứng ban đầu kết hợp với ion mangan (Mn2 +) không có tín hiệu Khi phản ứng khuếch đại xảy ra, ion mangan bị tách khóicalcein do ion pyrophosphat tạo ra (P2O74-), dẫn đến sự phát huỳnh quang Và calcein tự do có khả năng kết hợp với ion magiê (Mg2 +) trong hỗn hợp phản ứng, để nó tăng cường phát huỳnh quang

• Một phương pháp khác là mẫu ADN sau khi chạy LAMP sẽ được bổ sung SYBR Green I, ethidium bromide hay Fluorescent Rồi quan sát dưới đèn UV Kết quả dương tính có hiện màu đặc trưng hay phát sáng

QUI TRÌNH

4 TÍNH ƯU VIỆT CỦA KỸ THUẬT LAMP

SO VỚI PCR

• LAMP là một phương pháp khuếch đại ADN mới, có độ

Polymerase và một bộ 4 mồi được thiết kế đặc biệt để nhận ra từ 2- 6 trình tự cách xa nhau trên gen đích, do vậy làm tăng độ nhạy cũng như độ nhanh của phản

ứng

• Thời gian thực hiện LAMP nhanh hơn so với PCR Theo

đó, thời gian thực hiện PCR trung bình khoảng 2,5 – 3 giờ, trong khi thời gian thực hiện LAMP trung bình

khoảng 1-1,5 giờ Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan

trọng trong việc chuẩn đoán và xác định bệnh nhanh ở động vật, đặc biệt là trên người

• Kết quả của phản ứng LAMP có thể được quan

sát ngay dưới ánh sáng thường hoặc soi dưới tia

UV

• Hệ thống LAMP không yêu cầu nhiều thiết bị như máy luân nhiệt và chu trình nhiệt Hơn thế nữa,

hệ thống này không cần đến năng lượng điện (vì

có thể sử dụng túi ấm hoặc túi giữ nhiệt) Do đó,

có thể giảm được thời gian vận chuyển, phát hiện nhanh, có tính di động và hiệu quả kinh tế cao

Phù hợp với những vùng đang còn thiếu thốn về

cơ sở hạ tầng

• – Tube 0,2ml; 2ml; đầu côn các loại

• – Hộp đá, đá giữ lạnh hóa chất, sinh phẩm

• – …

- Gần đây, ngành ký sinh trùng học đã thích nghi với kỹ thuật LAMP

để phát hiện một số bệnh ký sinh trùng, bao gồm cả các loài

ký sinh trên người ký sinh trùng đường ruột (Cryptosporidium), trùng kiết lị (Entamoeba histolytica),

ký sinh trùng sốt rét

(Plasmodium), Trypanosoma, Taenia, Schistosoma, Fasciola

hepatica và Fasciola gigantica, và Toxoplasma gondii, và ký sinh trên

động vật như Theileria và Babesia

- Thậm chí muỗi mang ký sinh trùng Plasmodium và Dirofilaria

immitis đã được xác định nhờ sử dụng kỹ thuật này Ngoài ra, kỹ

thuật này có thể phát hiện trùng lông sau ngày đầu tiên tiếp xúc

trong ốc, các chủ trung gian của Schistosoma

• Ứng dụng chuẩn đoán bệnh:

• Bệnh Đốm Trắng Trên Tôm do WSSV và một số virus gây bệnh trong nuôi trồng thuỷ sản