Thiet bi va ktcnsh 6 genetransfer04

Trang 1 CHUYỂN GENE Trang 2 NỘI DUNG Giới thiệu kỹ thuật chuyển gene Trang 3 NỘI DUNG Giới thiệu kỹ thuật chuyển gene Trang 4 GIỚI THIỆU KỸ THUẬT CHUYỂN GENE 1928 – Báo cáo đầu tiê

CHUYỂN GENE

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM, 01/2012

NỘI DUNG

Giới thiệu kỹ thuật chuyển gene

Các phương pháp chuyển gene đang được sử dụng

Lipofection

Electroporation

Biolistics

Microinjection

NỘI DUNG

Giới thiệu kỹ thuật chuyển gene

Các phương pháp chuyển gene đang được sử dụng

Lipofection

Electroporation

Biolistics

Microinjection

GIỚI THIỆU KỸ THUẬT

CHUYỂN GENE

1928 – Báo cáo đầu tiên về chuyển gene: vi khuẩn có thể thu nhận sinh chất nào đó từ môi trường sống làm chúng thay đổi

Chuyển gene = chuyển gene/genome từ sinh vật này vào genome sinh vật khác

GIỚI THIỆU KỸ THUẬT

CHUYỂN GENE

Chuyển toàn bộ nuclear

Tại sao phải chuyển gene

Nghiên cứu:

biểu hiện gene trong tế bào sống

Điều hòa biểu hiện gene

Tầm soát các hướng trị liệu

Sinh học ung thư

Tại sao phải chuyển gene

Ứng dụng: dùng tế bào sống để sản xuất các vector di truyền, protein tái tổ hợp phục vụ cho các mục đích chuyên biệt:

heo sản xuất nội tạng người phụ vụ cấy ghép,

protein trị liệu tái tổ hợp thế hệ thứ ba được tạo ra và sử dụng ngay trong tế bào chủ,

thực vật kháng côn trùng, chống chịu nhiệt độ cao, chống chịu lạnh, chống chịu hạn

vaccine DNA

trị liệu gene

Tại sao phải chuyển gene

Cloning:

Cừu với genome xác định

NỘI DUNG

Giới thiệu kỹ thuật chuyển gene

Các phương pháp chuyển gene đang được sử dụng.

Lipofection

Electroporation

Biolistics

Microinjection

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GENE

Khuếch tán thụ động: vi khuẩn thu nhận DNA không cần bất kỳ xử lý đặc biệt nào

Khuếch tán được hổ trợ: ví dụ tế bào vi khuẩn xử lý CaCl 2 kèm sốc nhiệt ở 42 0 C

Vector vi khuẩn/virus: ví dụ Agrobacterium

tumefaciens hay CaMV chuyển DNA vào thực

NỘI DUNG

Giới thiệu kỹ thuật chuyển gene

Các phương pháp chuyển gene đang được sử dụng

Lipofection

Electroporation

Biolistics

Microinjection

LIPOFECTION

Sử dụng hóa chất hữu cơ tổng hợp lipid-polyamines thiết kế đặc biệt để chuyển nucleic acid vào tế bào động vật hữu nhũ

Cấu tạo bao gồm đầu ưa nứơc (+) và đuôi kỵ nước (-)

Đầu (+) bám với nucleic acid (-)

Lipid micelle phản ứng với màng tế bào để chuyển nucleic acid vào bên trong tế bào

Sử dụng để chuyển DNA/RNA vào trong rất nhiều loại tế bào

Độc tính đối với tế bào thấp

LIPOFECTION

NỘI DUNG

Giới thiệu kỹ thuật chuyển gene

Các phương pháp chuyển gene đang được sử dụng

Lipofection

Electroporation

Biolistics

Microinjection

ELECTROPORATION

Electroporation ( chuyển gene xung điện) sử dụng điện trường mạnh trong thời gian ngắn làm tạm thời mất tính ổn định của màng tế bào Trong thời gian này, màng tế bào có

khả năng thấm cao đối với các phân tử hiện diện trong môi trường xung quanh

Nhờ đó, DNA/ RNA có thể được chuyển vào tế bào

ELECTROPORATION

Electroporation

CÁC ƯU ĐIỂM CỦA ELECTROPORATION

Không sử dụng hóa chất, không làm thay đổi cấu trúc, chức năng của tế bào đích

Dễ thực hiện

Thời gian ngắn

Không độc hại

Hiệu quả cao

Có thể áp dụng cho nhiều loại tế bào

ỨNG DỤNG CỦA ELECTROPORATION

Chuyển các gene marker

Sát nhập các gene chức năng

Chuyển thuốc, protein, mồi phân tử, các

chất chuyển hóa, kháng thể … để khảo sát

chức năng và cấu trúc của tế bào

• DNA đi vào trong tế bào qua các lỗ

• Khi xung điện tắt, các lỗ trên màng tế bào đóng lại, giữ lại các DNA bên

HEÄ THOÁNG GENE PULSER Xcell

CHỨC NĂNG

Tạo hai loại xung: dạng hàm mũ giảm, dạng sóng vuông Đáp ứng tối ưu với nhiều loại tế bào, eukaryote hay prokaryote

CHỨC NĂNG

ARQ giảm khả năng tạo tia lửa điện ở điện thế cao, bảo vệ mẫu và thiết bị

Ion tích tụ trên bề mặt

mẫu tạo hiện tượng tia

lửa điện

CHỨC NĂNG

PC module điều chỉnh thời gian xung điện phù hợp với điện trở của mẫu nhờ điện trở nối song song với cuvette mẫu Nhờ vậy các mẫu có điện trở cao ( vi khuẩn) không bị chết do xung điện dài

CHỨC NĂNG

Chương trình đã thiết

lập sẵn cho một số tế

bào thông dụng

CHO E coli S cerivisiae Cos7 A tumefaciens P pastoris 3T3 P aeruginosa C albicans

293 S aureus S pombe HeLa B cereus D discoideum BHK21 S pyogenes

A549 L plantrum CV1

K562 HL60 Jurkat HuT78

NỘI DUNG

Giới thiệu kỹ thuật chuyển gene

Các phương pháp chuyển gene đang được sử dụng

Lipofection

Electroporation

Biolistics

Microinjection

BIOLISTICS- BẮN GENE

Chuyển nucleic acid vào trong tế bào bằng cách bắn vi đạn phủ nucliec acid vào chúng

ƯU ĐIỂM

Phương pháp đơn gỉan, nhanh, linh động Không phụ thuộc loại tế bào

Sử dụng ít DNA

Chuyển một hoặc nhiều gene

Có thể chuyển đoạn DNA lớn

Ít thao tác trên tế bào

Độ lập lại cao

Helios Gene Gun

Súng cầm tay – có thể áp dụng thực địa

Aùp suất 100 – 600 psi

Vùng đích nhỏ cho phép định vị mục tiêu chính xác

LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU

Biểu hiện gene

Liệu pháp gene

Miễn dịch di truyền

Sinh học ung thư

Hàn vết thương

Bệnh nhiễm trùng

Đánh dấu màu các neuron

QUY TRÌNH

Vi đạn vàng

Vi đạn bằng vàng vì:

Vàng không gây độc cho tế bào

DNA gắn lên vàng không bị phân hủy

Chuẩn bị ống đạn

CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG

b-gal expression in CHO cells

CHUYEÅN GENE in vitro

THOÂNG SOÁ CHO in vitro

0.5mg vi đạn vàng 400 psi, 24 hours sau bắn gene

CHUYỂN GENE in vivo

THOÂNG SOÁ CHO in vivo

CHUYỂN GENE Ở GIUN

CHUYỂN GENE Ở LÁ CÂY

• Chuyển cDNA virus vào khoai tây Tuija Kekarainen and Jari P T Valkonen, Department of Plant

Biology, Swedish

MẪU CẮT NÃO CHỒN FERRET

Dr Donald Lo / Duke University

HỆ THỐNG PDS-1000/He

in vitro, ex vivo (và in vivo cho một số thực vật, vi sinh vật)

Aùp dụng cho tế bào động vật, cơ quan nuôi cấy, tế bào và mô thực vật nuôi cấy, phấn hoa, côn trùng, tảo, nấm và

vi khuẩn Aùp suất trong khoảng 450 - 2200 psi Vùng bắn lớn – nhiều tế bào được chuyển

• In Vitro – Tế bào và cơ quan động vật

nuôi cấy, tế bào thực vật

• Ex vivo – mô và phấn hoa thực vật

• In vivo - một số thực vật, côn trùng, tảo, nấm, vi khuẩn và một số vi sinh vật

ĐỐI TƯỢNG

• Biểu hiện gene

• Công nghệ sinh học nông nghiệp và phát triển mùa vụ – vaccine cho thực vật

• Kháng bệnh

LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU

PDS-1000/He

CHUAÅN BÒ MAÃU

PDS-1000/He Rupture Disk

PDS-1000/He Nạp Macrocarrier

PDS-1000/He Nạp Tế Bào Đích

PDS-1000/He Baén

THÔNG SỐ

Vi Khuẩn 29 6 1100 M5 Tungsten Nấm Men 28 6 1300 0.6nm vàng

TB Thực Vật 28 9 1100 1.0nm vàng TBĐông Vật 15 3 1100 1.6nm vàng

Vacuum Target dist Helium Kích thước vi đạn ins Hg cm psi

Lúa Mạch Chuyển Gene

Peggy G Lemaux and colleagues / UC Berkeley

PDS-1000/Hepta

• Bộ chuyển đổi cho 7 ngõ ra

• Tạo vùng bắn lớn

• Thích hợp số lượng lớn mẫu

• Aùp dụng cho tế bào và cơ quan động vật nuôi cấy, tế bào và mô thực vật, nấm men và vi khuẩn

Helios Gene Gun PDS1000/He PDS1000/He Hepta

Loại đích Động vật: mọi loại mô

có thể tiếp xúc trực tiếp; da, cơ quan; tế bào, mô, cơ quan nuôi cấy

Thực vật: trên đồng ruộng, nhà kính, mô và tế bào nuôi cấy

Nấm men, vi khuẩn,

Vi sinh vật

Động vật: tế bào và

cơ quan nuôi cấy

Thực vật: thực vật nhỏ nguyên vẹn, tế bào và mô nuôi cấy

Nấm men, vi khuẩn,

NỘI DUNG

Giới thiệu kỹ thuật chuyển gene

Các phương pháp chuyển gene đang được sử dụng

Lipofection

Electroporation

Biolistics

Microinjection

MICROINJECTION

ĐẶC HIỆU

Nhắm đến một tế bào

Thao tác vật lý tế bào

Cho vào hoặc lấy ra các thành phần của tế bào

THÀNH PHẦN

Kính hiển vi

THÀNH PHẦN

Kính hiển vi, bộ vi thao tác

THÀNH PHẦN

Kính hiển vi, bộ vi thao tác, bộ vi tiêm

Thành phần của hệ thống

Vi thao tác:

• motor tự động

– 3 trục – Di chuyển 25mm – Độ phân giải 40nm

Bộ điều khiển Tay điều khiển joystick

– Joystick treo – Có bộ nhớ vị trí

Vi tiêm kỹ thuật số:

• 2 kênh áp suất

Vi Tiêm Đồng Bộ:

• syringe micrometer

• 2 vận tốc

• Tương thích nhiều thể tích

• Dùng dầu hoặc nước

Thành phần của hệ thống

ỨNG DỤNG

Tạo động vật chuyển gene

Vi tiêm tế bào cố định

Thụ tinh nhân tạo

TẾ BÀO KHÔNG CỐ ĐỊNH

• 2 microtools

– Giữ – Bơm/chuyển

• Aùp suất thấp

– Dương (tiêm) – Aâm (giữ, hút)

VI TIÊM TIỀN NHÂN

Hợp tử ở giai đoạn tiền nhân của tế bào động vật hữu nhủ được tiêm dung dịch DNA Tiêm DNA vào trong tiền nhân

Hợp tử phát triển thành các thể có thể biểu hiện chuyển gene

CHUYỂN TẾ BÀO MẦM

Phôi chưa biệt hóa chứa khoảng 100 tế bào mầm được chuyển vào một số tế bào

mầm mang đột biến gene quan tâm

Phôi phát triển thành cá thể mang thể khảm

Tế bào trứng được vi tiêm tinh trùng

Thụ tinh nhân tạo intracytoplasmic sperm injection (ICSI)

TẾ BÀO CỐ ĐỊNH

Gene Transfer

Gene Pulser Xcell MicroPulser Cuvettes

Helios Gene Gun PDS-1000/He

XenoWorks

Lipid Competent Cells

ElectroCompetent

Cells Electroporation

GT Reagents

Biolistics

Microinjection

Lipid Transfection

RNAi: RNA interference, RNA mạch đôi bám vào mRNA làm bất hoạt biểu hiện gene

siRNA: small interfering RNA

Ứng dụng mới: RNAi trong ức chế HBV ở chuột

McCaffrey, A P et al.

Chuột được chuyển plasmid mang bộ gene HBV vào gan: biểu hiện bệnh, HBV có sinh sản

Chuột được chuyển thêm plasmid có siRNA chuyên biệt cho HBV mRNA: ức chế sinh sản HBV

Triển vọng: điều trị HBV, bệnh

nhiễm virus

Vấn đề cần giải quyết:

phương pháp chuyển gene ứng dụng cho điều trị

không ảnh hưởng đến tế bào chủ