Thiet bi va ktcnsh 2 real time pcr nk 06

Trang 6 DNA VÀ CƠ CHẾ TỰ NHÂN ĐÔI TRONG TẾ BÀO Trang 10 Chuẩn bị mẫu, ly trích DNA/RNA Thực hiện phản ứng PCR trong máy luân nhiệt Phát hiện sản phẩm khuếch đại QUI TRÌNH THỰC HIỆN X

PCR VÀ REAL-TIME PCR

NỘI DUNG

Giới thiệu kỹ thuật PCR và Real-Time PCR Thiết bị PCR và Real-Time PCR

Các ứng dụng của Real-Time PCR

Nghiên cứu biểu hiện gene

Nghiên cứu mức độ nhiễm virus, vi khuẩn

Phát hiện GMO ( sinh vật biến đổi gene)

Phân biệt allelic/SNP

PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân

bản trình tự DNA quan tâm trong test tube

PCR LÀ GÌ ?

K Mullis đã phát minh ra thử nghiệm PCR vào năm 1985

Và chỉ 8 năm sau, K Mullis đã được giải Nobel hoá

học nhờ phát minh PCR

DNA VÀ CƠ CHẾ TỰ NHÂN ĐÔI TRONG TẾ BÀO

DNA POLYMERASE PRIMER

VẬY, CẦN CÓ NHỮNG GÌ TRONG TEST TUBE?

Taq polymerase dNTP

Primer ( mồi ) DNA mẫu

Buffer

PHẢN ỨNG PCR DIỄN RA NHƯ THẾ NÀO ?

QUI TRÌNH THỰC HIỆN XÉT NGHIỆM PCR

Ly tâm và đun nóng

Chọn chương trình chu kỳ nhiệt

Điện di, quan sát và chụp ảnh

Đặc hiệu Nhạy

Nhanh

ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT PCR

Real Time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA đang diễn ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp

REAL TIME PCR LÀ GÌ ?

Thực chất, hệ thống Real Time PCR gồm máy luân nhiệt (PCR) được nối với máy quang phổ huỳnh

quang và máy vi tính

REAL TIME PCR LÀ GÌ ?

Quang phổ huỳnh quang

Máy luân nhiệt

Máy vi tính

Real Time PCR gồm 2 quá trình diễn ra đồng thời: nhân bản DNA bằng phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ thuận với số lượng đoạn DNA tạo thành

REAL TIME PCR LÀ GÌ ?

Phẩm nhuộm khi chèn vào sợi đôi DNA sẽ phát huỳnh quang mạnh hơn khi ở trạng thái tự do:

Probe đặc hiệu có gắn chất phát huỳnh quang chỉ phát sáng khi có bắt cặp với trình tự đích: Beacon, Taqman…

BẰNG CÁCH NÀO ĐỂ CÓ TÍN HIỆU REAL TIME PHẢN ỨNG PCR ĐANG DIỄN RA ?

5’

5’ 3’ 3’

d NTPs Taq DNA Polymerase Primers

PHẨM NHUỘM CHÈN SỢI ĐÔI DNA

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

Taq

Taq

3’

5’ 3’

SYBR GREEN 1

kích thích 490nm

Phat quang 530nm

Số lượng DNA gia tăng

Không có DNA

kích thích

490nm

Phat quang 530nm

SYBR GREEN 1, tuy nhiên …

DNA cần tìm

Các phẩm nhuộm chèn sợi đôi DNA không cho kết quả đặc hiệu

DNA không cần tìm

GỈAI PHÁP

PROBE PHÁT HUỲNH QUANG

Đặc hiệu

Phát sáng khi gắn bổ sung với DNA đích

PROBE PHÁT HÙYNH QUANG

• Vòng mang trình tự bổ sung với DNA đích

• Nhánh đôi mang fluorophore

(F-chất phát huỳnh quang) ở một

đầu, và quencher (Q- chất hấp

thu) ở đầu kia

• Khi probe tự do tồn tại dưới cấu trúc này thì tín hiệu huỳnh quang

từ F sẽ bị Q hấp thu = KHÔNG

PHÁT HUỲNH QUANG

MOLECULAR BEACONS

Fluorophore & Quencher

FRET: Fluorescence (Förster) Resonance Energy Transfer

MOLECULAR BEACONS

\ \bioraddownload\Video\Beacon.swf

Nối dài

\ \bioraddownload\Video\Fret.swf

PROBE DỰA TRÊN PHÂN CẮT - TAQMAN 

 Tín hiệu huỳnh quang được phát ra khi probe gắn vào bản mẫu DNA đoạn giữa cặp primer bị phân cắt trong giai đoạn nối dài mạch do DNA polymerase

 Lũy tích độ mạnh tín hiệu huỳnh quang

 Thí nghiệm phổ biến nhất trong các tài liệu về Real-Time PCR

 Tuy nhiên, cần phải đảm bảo:

- Chất phát huỳnh quang được chọn làm Reporter phải có phổ phát sáng tách biệt với Quencher

- Reporter phát sáng trong khoảng kích thích Quencher

- Quencher phải nằm gần Reporter để hấp thu hiệu quả

5’

5’ 3’ 3’

dNTPs DNA Polymerase beàn nhieät

PROBE GẮN VỚI PRIMER: AMPLIFLUOR

Both SYBR Green &

fluorescent probes hoac primers

Chuẩn bị mẫu, ly trích

DNA/RNA

Thực hiện phản ứng

PCR và phân tích, báo

cáo kết quả trên hệ

thống real time PCR

iCycler iQ

QUI TRÌNH THỰC HIỆN REAL TIME PCR

Ly tâm và đun nóng

Chọn chương trình real-time PCR

Theo dõi phản ứng PCR đang xảy ra

GIẢI PHÁP REAL TIME PCR 1

Ten-fold dilution series of plasmid DNA: 10 7 - 10 1 copies

Định lượng nồng độ DNA mẫu trước phản ứng bằng cách so sánh Ct mẫu với Ct của các chuẩn đã biết trước nồng độ

GIẢI PHÁP REAL TIME PCR 2

x copies tạo x copies ở chu kỳ đầu tiên

BẮT ĐẦU BẰNG MỘT TÍNH TOÁN LÝ THUYẾT

2x copies tạo 2x copies ở chu kỳ thứ hai

4x copies tạo 4x copies ở chu kỳ thứ ba

tạo 16,777,216x copies ở chu kỳ thứ 25

tạo 536,870,912x copies ở chu kỳ thứ 30

Hiệu quả phản ứng không bao giờ 100%

Enzyme mệt mỏi

Primer giảm khả năng gắn lên trình tự đích

THỰC TẾ KHÔNG ĐÚNG NHƯ VẬY !

96 mẫu lập lại của cùng một nồng độ DNA xác định cho tín hiệu huỳnh quang cuối cùng rất khác nhau

So sánh kết quả điện di trên gel sản phẩm sau PCR của cùng một nồng độ DNA đích ban đầu

MỘT SO SÁNH KHÁC

SỐ LƯỢNG DNA BAN ĐẦU SỐ LƯỢNG DNA BAN ĐẦU

SỐ CHU KỲ

Ở phase log, 96 giếng của cùng một nồng độ DNA xác định cho tín hiệu hoàn toàn giống nhau, chỉ khác nhau đáng kể ở phase bình nguyên

Vấn đề là chúng ta không biết khi nào thì phase log kết thúc

ĐÂU LÀ THỜI ĐIỂM TỐT NHẤT ĐỂ CÓ KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG ?

Chu Kỳ Ngưỡng (Threshold Cycle), Ct !

ĐÂU LÀ THỜI ĐIỂM TỐT NHẤT ĐỂ CÓ KẾT QUẢ

ĐỊNH LƯỢNG

 Chu kỳ ngưỡng tương quan chặt chẽ với số lượng DNA đích ban đầu

Ít DNA ban đầu

Nhiều DNA ban

Số Chu Kỳ

 Chu Kỳ Ngưỡng Threshold Cycle (C T )

Nơi mà tín hiệu huỳnh quang cao hơn tín hiệu nền một cách

thấy rõ

CT

ĐÂU LÀ THỜI ĐIỂM TỐT NHẤT ĐỂ CÓ KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG

Số lượng bản DNA đích ban đầu càng nhiều thì thời điểm (Ct) phát hiện tín hiệu sản phẩm khuếch đại càng sớm

ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ DNA MẪU

SỐ LƯỢNG DNA BAN ĐẦU LÀ BAO NHIÊU ?

SỐ LƯỢNG DNA BAN ĐẦU

CỦA MẪU CẦN XÁC ĐỊNH

Dùng Melt Curve để xác định đặc tính của sản phẩm khuếch đại

GIẢI PHÁP REAL TIME PCR 3

TĂNG NHIỆT ĐỘ

GIẢI PHÁP REAL TIME PCR 4

Phân tích end-point, xác định dương tính hoặc âm tính

Đây là phương pháp PCR định lượng chính xác

nhất

Độ nhậy cao nhất

Độ đặc hiệu

Có thể định lượng nhiều hơn 1 loại gene cùng một lúc

Có thể dùng melt curve để xác định đặc tính của sản phẩm khuếch đại

Toàn bộ qui trình nhân bản và phát hiện diễn ra trong 1 tube kín: rút ngắn thời gian, hạn chế

nhiễm chéo

VÌ SAO PHẢI SỬ DỤNG REAL TIME PCR ?

Định lượng Nhậy nhất Đặc hiệu Hiệu quả Nhanh, qui trình đơn giản Giảm nguy cơ ngoại nhiễm

ƯU ĐIỂM CỦA KỸ THUẬT REAL TIME PCR

TÓM TẮT QUI TRÌNH VÀ THIẾT BỊ

1 Chuẩn bị mẫu

2 Nhân bản DNA (PCR)

3 Điện di/ hoặc Elisa

4 Đọc kết quả

1 Chuẩn bị mẫu

2 Real Time PCR

3 Biện luận kết quả

CHUẨN BỊ MẪU

Tủ lạnh sâu Máy ly tâm/ ly tâm lạnh

Cân Stomacher Máy trộn Máy nhiệt khô Tủ thao tác PCR Micropipette âDụng cụ thủy tinh

NHÂN BẢN DNA, PCR / REAL-TIME PCR

The World Largest Thermal Cycler manufacturer

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA HỆ THỐNG REAL-TIME PCR

NGUỒN SÁNG ĐẦU ĐỌC

MẪU

MÁY LUÂN NHIỆT

NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA HỆ THỐNG REAL-TIME PCR

ĐIỆN DI NGANG VÀ ĐỌC KẾT QUẢ

PHÒNG THÍ NGHIỆM PCR

Trạm ly trích nucleic acid

PHÒNG THÍ NGHIỆM PCR

PCR và phân tích kết quả

 Nghiên Cứu Biểu Hiện Gene

CÁC ỨNG DỤNG CỦA REAL TIME PCR

Số lượng các ứng dụng của Real Time PCR được công bố ngày một tăng

Nhưng Các Gene Hoạt Động Như Thế Nào?

• TÌM HIỂU VỀ CHỨC NĂNG CỦA GENE

• - Những gene nào liên quan đến các bệnh tật hay hoạt động nào đó của cơ thể …

• - Những gene nào hoạt động hay bất hoạt đáp ứng với tác động từ môi trường …

Bieåu hieän gene

BIEÅU HIEÄN GENE

Genome-DNA

Proteome

2-D elec MS Protein-protein interactions

Transcriptome

Real Time PCR

Bioinformatics

REAL-TIME PCR ĐỐI VỚI NGHIÊN CỨU

BIỂU HIỆN GENE

Cho kết quả không những gene nào đang hoạt

động mà còn định lượng mức độ biểu hiện của

NHU CẦU REAL-TIME PCR ĐỐI VỚI CHẨN

ĐÓAN VIÊM GAN SIÊU VI

hiệu và theo dõi điều trị

hiệu và theo dõi điều trị

THỰC HIỆN REAL TIME PCR

VỚI SYBR 490 , HỆ THỐNG IQ BIORAD

QUI TRÌNH KỸ THUẬT: Thực hiện 18 giờ

THEO DÕI TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ QUA XN

Một vài trường hợp HCV – RNA

(số liệu của BS Nguyễn Văn Thịnh, BV Hoàn Mỹ)

Ngày Số lượng

ag/ml Ngày lượng Số

Ng Thị H 24/10/02 7.620 21/01/03 5.080 Vuong B.D 01/11/02 44.360 28/01/03 00 Trần Thị M 07/11/02 100.200 10/02/03 14.050

100 bệnh nhân SXH

So sánh kết quả giữa PCR và IgM theo ngày bệnh

0 20 40 60 80 100

PCR có khả năng phát hiện SXH ngay

trong những ngày đầu của bệnh

Nguyễn Văn Thịnh và CS., 2004

Vì sao phải dùng kỹ thuật PCR

Kiểm tra nhanh Aùp dụng phù hợp cho cả nguyên liệu và kiểm soát qui trình

Trong số các phương pháp kiểm tra nhanh thì PCR là phương pháp đáp ứng cao các chỉ tiêu quan

PHÁT HIỆN NHANH VI SINH VẬT GÂY BỆNH

TRONG THỰC PHẨM

PHÁT HIỆN NHANH VI SINH VẬT GÂY BỆNH

TRONG THỰC PHẨM

Định danh dựa vào kiểu hình sinh vật

hóa học biểu hiện từ các kiểu gen Xác định dựa vào kích thước đoạn gen hay một trình tự đặc hiệu của

đoạn gen

Nuôi cấy là khuếch đại bộ

VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM

Campylobacter sp (C jejuni, C coli, and C lari )gây tiêu chảy ra

nước, máu.

Clostridium botulinum tạo các độc tố type A, B, E và F

Clostridium perfringen tạo nội độc tố đường ruột gây các triệu chứng: đau bụng, đầy hơi, buồn nôn, tiêu chảy

Escherichia coli: EHEC, EIHEC, ETEC & EPEC,

Enterohemorrhagic E coli (EHEC) tạo độc tố verotoxin gây

chảy máu ruột kết do gen stx-1 and stx-2 E coli O157:H7

thuộc nhóm này

Enteroinvasive E coli (EIEC) gây bệnh tiêu chảy tương tự như shigella

Enterotoxigenic E coli (ETEC) chủ yếu gây tiêu chảy ở những người đi du lịch và ở trẻ do các độc tố heat-labile

toxin (LT) và/hoặc heat-stable toxin (ST)

Enteropathogenic E coli (EPEC) gây bệnh tiêu chảy ở trẻ

Listeria monocytogenes viêm màng não, sẩy thai có thể dẫn đến tử vong

Salmonella: buồn nôn, nôn mửa đau bụng từng cơn, tiêu chảy và đau đầu

Shigella bao gồm 4 loài S dysenteriae (subgroup A), S

flexneri (subgroup B), S boydii (subgroup C và S sonnei

(subgroup D) gây bệnh lỵ

VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM

VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM

Staphylococcus aureus tạo độc tố đường ruột bền nhiệt do các gen A, B, C, D, E, H

Vibrio chorelae tạo độc tố gây tiêu chảy do gen cholerae

toxin (ctx)

Virio parahaemolyticus và Vibrio vulnificus gây bùng nổ ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là thủy sản

Hepatitis A Virus vàng da, viêm gan

cơn.

PHÁT HIỆN NHANH VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT KHUẾCH ĐẠI GEN MỤC TIÊU

Vi khuẩn Gen mục tiêu khuếch đại (*)Tham chiếutheo

Campylobacter coli

Shiga-like toxins

PHÁT HIỆN NHANH VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT KHUẾCH ĐẠI GEN MỤC TIÊU

(*) BAM - Bacterial analytical manual, Food and Drug Aministration, 2001

iQ Check, QUI TRÌNH

REAL TIME PCR

AMPLIFICATION (1h 30min)

PHÁT HIỆN VÀ

ĐỌC KẾT QUẢ

Cho mẫu đã ly trích vào PCR iQ mix

ĐÁNH GIÁ TEST VÀ BIỆN LUẬN KẾT QUẢ

Xác định Ct, phân tích kết quả

GMO LÀ GÌ Sinh vật biến đổi gen - Genetically modified organ isms - GMO là sinh vật

một hoặc nhiều đoạn DNA (gọi là DNA chèn) làm bộ gen của sinh vật bị biến đổi, nhằm làm tăng các đặc tính ưu việt có chọn

REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN GMO

TẠI SAO PHẢI KIỂM GMO

Công nghệ sinh học phát triển, ngày càng nhiều thực phẩm có nguyện liệu là GMO

Quan điểm xã hội: chưa quen

Ích lợi và tác hại chưa xác định rõ: mất cân bằng tự nhiên

QUI LUẬT MỚI Ở CHÂU ÂU

Đối tượng kiểm GMO:

Thực phẩm GMO

Thức ăn gia súc GMO fee

Thực phẩm chế biến từ GMOs

Gia vi

European Directive 2001/18/EC: nếu thành phần GMO > 1%, sản phẩm phải được dán nhãn

CE/ 1829/2003 Novel Food Novel Feed

0.9% GMOs đã đăng ký ở EU

0.5% GMOs chưa đăng ký nhưng đã qua kiểm tra an toàn

0% GMOs chưa đăng ký và chưa qua kiểm tra an toàn

• Toàn bộ mọi công đoạn trong dây chuyền sản xuất thực phẩm hoặc thức ăn gia súc có GMO đều phải khai báo

– Đòi hỏi phải truy cứu trên toàn bộ dây chuyền

• Phải dán nhãn nếu

– Là GMOs

– Chứa GMOs (ví dụ sản phẩm sữa chứa vi sinh)

– Chế biến trực tiếp từ GMOs: ketchup cà chua, dầu đậu nành…

• Không dán nhãn nếu được sản xuất dưới sự giúp đỡ của GMO

– Thịt, sữa từ động vật nuôi bằng GMO

– Chất gia vị sản xuất bởi vi sinh GMO

DÂY CHUYỀN KIỂM CƠ BẢN

Công ty giống  Nông dân  Công nghiệp bột  Chế biến

 Phân phối

Hầu hết là nguyên liệu

Toàn bộ công nghiệp thực phẩm có liên quan

• Bắp và đậu nành

GMO cấu tạo như thế nào?

Gene quan tâm

Định lượng GMO :

% GMO DNA / DNA Thực Vật

CÁC TIÊU CHUẨN QUỐC TẾ

 Đã xuất bản

quantification by real-time PCR

 Đang thảo luận

 NF EN ISO/DIS 24276 : General requirements

 NF EN ISO/DIS 21568 : Sampling

 NF EN ISO/DIS 21571 : DNA extraction

 NF EN ISO/DIS 21569 : Detection by real-time PCR

 NF EN ISO/DIS 21570 : Quantification by real-time PCR

 NF ISO 24274 : Detection of GMOS in oil seeds

PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN GMO

Phương pháp miẽn dịch Phương pháp PCR

 Dựa trên protein

 Nguyên liệu

 Test định tính

 Không đủ nhậy và đặc

hiệu

 Không mắc tiền

 Dựa trên DNA/ cDNA

 Nguyên liệu và thành

PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN GMO

• Real-Time PCR là phương pháp chuẩn để kiểm tra GMO ở châu Âu

• Khuyến cáo bởi AFNOR và CEN

• áp dụng cho hầu hết các phòng thí nghiệm

Quy trình hoàn chỉnh kiểm tra GMO

Sàng lọc sản phẩm GMO

Định lượng sản phẩm GMO

Tỷ lệ % chuyển gen Định lượng chính xác gen chuyển nạp

Các biện pháp quản lý

(+) (-)

ĐỊNH LƯỢNG GMO, TÍNH TÓAN

Ly trích DNA

Định lượng GMO thông qua so sánh Ct mẫu

và các chuẩn

2.5-3 h

Real Time PCR

Kết quả tự động tính: %GMO

Thí nghiệm sử dụng multiplex 4 màu và các TaqMan probe để phát hiện cùng lúc các biến thể allele từ hai đột biến hemochromatosis phổ biến nhất (H63D, C282Y)

PHÁT HIỆN SNP

Ugozzoli LA et al., Fluorescent multicolor multiplex homogeneous assay for the simultaneous analysis of the two most common

hemochromatosis mutations Anal Biochem 307, 47–53 (2002)

 Hai đột biến SNP liên quan với hemochromatosis đã được tìm thấy trên gene hemochromatosis (HFE): Cys282Tyr and His63Asp

ACG T G C CAG ACG T AC CAG

GAT C AT GAG GAT GAT GAG

 Một nghiên cứu ban đầu, 37 mẫu DNA đã biết HFE genotype được phân tích bằng real-time PCR với thí nghiệm multiplex-multicolor TaqMan

 Kết quả của phương pháp này được so sánh với kết quả từ phương pháp thứ hai (PCR-RFLP dùng Rsa I cho C282Y và DPN II cho H63D)

Và các triển vọng ứng dụng khác

Cái nhìn của Leader …