Thiet bi va ktcnsh 3 bis electrophoresis blotting

Các loại gel 3.Các phương pháp diện di 4.Ứng dụng Trang 4 Các Phương pháp điện di và chuyển lên màng lai Trong Phân tích Trang 5 Điện di trên Gel Gel Electrophoresis - Tách các phân

Các Phương pháp điện di và chuyển lên

màng lai trong phân tích

Electrophoresis and Blotting methods in

Analysis of Biomolecules

Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Mục đích

1.Trang bị kiến thức về điện di 2.Kiến thức về Blotting

Các bạn sẽ hiểu được:

1 Khái niệm cơ bản về điện di

2 Các loại gel

3 Các phương pháp diện di

4 Ứng dụng

5 Kiến thức về Blotting

Các Phương pháp điện di và chuyển lên

màng lai Trong Phân tích

Khái niệm cơ bản

Điện di trên Gel

Gel Electrophoresis

- Tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, Protein) bằng

cách cho đi qua chất nền là Gel trong một điện trường Người ta thường sử dụng các loại gel agarose hay polyacrylamide

- DNA hay RNA thường tích điện âm Trong điện di trên

gel, mẫu được cho vào những giếng nằm gần diện cực âm và DNA hay RNA sẽ di chuyển về phía cực dương Sự di chuyển tỉ lệ nghịch với kích thước phân tử, phân tử càng nhỏ càng di chuyển nhanh

- Protein có khá nhiều điện tích trên bề mặt, cho nên

chúng thường được xử lý với SDS để chuyển sang dạng tích điện âm

Ñieän di treân Gel

Điện di trên Gel

z: Điện tích của protein

f: Hệ số ma sát, tùy thuộc vào khối lượng và hình dạng protein và độ nhớt của môi trường

• GEL

Điện di trên Gel

Gel Electrophoresis

Gel: Trạng thái trung gian giữa hai pha rắn và lỏng Các vật liệu dùng làm gel:

Starch, Agarose, Acrylamide…

Cấu trúc của gel Agarose tương tự Acrylamid: Mạng lưới cấu trúc ba chiều

Agarose: cầu nối hydrogen giữa các thành phần

Polyacrylamide: các nối chéo đồng hóa trị giữa các fiber và acrylamide

Điện di trên Gel

Gel Electrophoresis

Agarose: polysaccharide tự nhiên được phân lập từ tảo biển, có kích thước lổ gel lớn, thích hợp cho phân tách các phân tử có kích thước lớn và điện di dựa trên độ tích điện

Dùng để phân tách các protein > 500kDa và các DNA có kích thước > 2000bp

Các loại agarose khác nhau dựa trên các đặc tính lý hóa như nhiệt độ đông đặc, độ dai, kích thước lổ gel, và độ điện thẩm

Ñieän di treân Gel

Điện di trên Gel

Gel Electrophoresis

Gel polyacrylamide được hình thành bởi quá trình đồng trùng hợp giữa acrylamide (CH 2 = CH-CO-NH 2 ) và cross linker,

thông thường là N,N’-methylenebisacrylamide

(bis acrylamide – CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH-CO-CH=CH 2 )

+

Điện di trên Gel

Gel Electrophoresis

Gel Polyacrylamide (PAGE)

a) Chức năng: Lưới

phân tử

b) Kích thước lổ gel được

xác định theo nồng độ

của acrylamide và

Điện di trên Gel

Gel Electrophoresis Quá trình hình thành gel được khởi động khi thêm

vào (NH4)2SO4 và chất gia tốc (accelerator) là

tetramethylethylenediamine (TEMED)

TEMED làm tăng tốc độ phân hủy (NH4)2SO4 thành

2 nhóm sulfate tự do, các gốc tự do này khởi động

quá trình tạo thành gel

Sự polyme hóa acrylamide sẽ là ngẫu nhiên nếu không có crosslinker, là một dung dịch nhớt

=> Crosslinker = kích thước các lổ trong gel

Điện di trên Gel

Gel Electrophoresis

Tốc độ hình thành gel phụ thuộc vào ba yếu tố:

- Nồng độ của các monomer và các gốc tự do

- Nhiệt độ

- Độ tinh khiết của hóa chất sử dụng

Chú ý: - TEMED phải ở dạng các base tự do nên không chuẩn bị gel

ở pH thấp

- Oxy là tác nhân ức chế sự tạo thành bản gel Loại khí các dung dịch trước khi chuẩn bị gel

Polyacrylamide gels (PAA)

Theo quy ước, PAA được mô tả dựa trên 2 giá trị xác định kích thước các lỗ trong gel:

%T hay % khối lượng các monomer

Polyacrylamide gels (PAA)

Protein: 30%T và 2.7%C

Bằng cách: 29.2g acrylamide

0.8g bisacrylamide 100ml 72.5ml nước cất

* Có thể lọc dung dịch monomer này và cất giữ lạnh để sử dụng

Nucleic Acid: 30%T và 3.3%C

29g Acrylamide 1g Bisacrylamide

* Acrylamide là hóa chất độc, tránh tiếp xúc trực tiếp

Polyacrylamide gels (PAA)

Phản ứng tạo thành gel

Nồng độ APS và TEMED 0.05% đủ để gây đông gel đối với gel bình thường Quá trình đông thành gel xảy ra sau 15 – 20 phút sau khi cho hai chất này vào dung dịch monomer Gel đông hoàn toàn sau 90 phút

1% APS và TEMED dùng cho stacking gel

Gel không ổn định ở pH từ 4 – 6

Gel bị thủy phân khi lưu trữ: nhóm carboxamide (-CO-NH 2 ) bị thủy phân giải phóng nhóm carboxyl (-COO-)

=> Tốt nhất sử dụng gel mới cho mỗi lần thí nghiệm

Các hệ dung dịch đệm dùng trong điện

di protein

Buffer xác định điều kiện dòng điện và có ảnh

hưởng lên sự phân tách và độ phân giải protein

trong quá trình điện di

Continuous Buffer system (hệ đệm liên tục) trong gel và buffer có ion như nhau (ở pH ổn định): thường sử dụng trong điện di các acid nucleic và protein có nồng độ 1mg/ml hay cao hơn

Mẫu được tra trực tiếp vào gel, và tách ra khi điện

di Đối với gel có kích thước lổ gel không đổi, hệ đệm liên tục cần sử dụng mẫu có nồng độ cao để cho kết quả tốt hơn

Các hệ dung dịch đệm dùng trong điện

di protein

 Discontinuous buffer system (hệ đệm không

liên tục) ion khác nhau giữa gel và buffer: cần độ phân giải cao

Trong kỹ thuật này, mẫu được tra vào một lớp gel (stacking gel) có vai trò như là một môi

trường giúp cho toàn bộ lượng mẫu tập trung trên bề mặt resolving gel, giúp cho kết quả

điện di có độ phân giải cao

Các hệ dung dịch đệm dùng trong điện

di protein

Hệ buffer không liên tục sử dụng phổ biến nhất là

Laemmli buffer, trong buffer có chứa 0.1% SDS và cần phải làm biến tính protein thành các chuỗi polypeptide phần tử trước khi điện di

Khi hỗn hợp protein được làm nóng lên trong dung dịch buffer có chứa SDS (2%) và một chất khử thiol như 2 – Mercaptoethanol, protein sẽ bị biến tính hoàn toàn

thành các chuỗi polypeptide và SDS bao bọc các

polypeptide thành dạng thẳng

Các hệ dung dịch đệm dùng trong điện

di protein

Hệ đệm liên tục:

Thông thường sử dụng là Tris/Glycine (pH 8.3 - 9.5); Tris/borate (pH 8.3 – 9.3); Tris/acetate (pH 7.2 –

8.5)

Các chất tẩy rửa và chất biến tính

Phá vỡ tương tác protein – lipid, protein:

- SDS (sodium dodecyl sulfate)

- LDS (lithium dodecyl sulfate)

- Uréa

- Formamide

Các chất tẩy rửa và chất biến tính

SDS

 Gắn vào chuỗi polypeptide, 1SDS : 2AA’s

 phá vỡ hầu hết các tương tác không đồng hóa trị, khi thêm vào mercaptoethanol bẻ gãy cầu nối disulfite

 Tạo cấu trúc dạng thẳng trong hợp chất SDS-Protein

 Mỗi phân tử SDS cung cấp một điện tích

Các chất tẩy rửa và chất biến tính

Được sử dụng thường xuyên như là một hóa chất

phân ly trong điện di trên gel

Phá vỡ cầu nối hydro

Là chất biến tính thích hợp cho Nucleic acid, duy trì DNA và RNA ở dạng mạch đơn

Không gắn kết với protein như SDS nên phải

được có trong dung dịch trong quá trình điện di

Không dùng trong gel agarose vì uréa bẻ gảy

cầu nối hydro gắn kết agarose với nhau

URÉA

Các chất tẩy rửa và chất biến tính

Hòa tan nhiều hơn SDS khi ở nhiệt độ thấp, cho phép điện di ở 40C

Đã được dùng thay cho SDS trong điện di

SDS-PAGE

LDS

Formamide

Dùng để biến tính RNA và DNA (ít khi)

Giống uréa: bẻ gãy cầu nối hydro

Chuẩn bị mẫu

 Mẫu cho SDS-PAGE: 0.0625M Tris, pH 6.8; 2% SDS; 5% mercaptoethanol, 10% glycerol và 0.025%

brommophenol blue

 Tốt nhất là chuẩn bị sẵn tất cả và thêm

mercapto-ethanol ngay trước khi điện di

 Brommophenol blue: theo dõi quá trình điện di

Các thiết bị dùng trong điện di

Các điều kiện về điện thế

Ổn định điện thế, cường độ và một số điều kiện khác là yếu tố quan trọng trong điện di

Phát hiện sau khi điện di

Hầu hết protein được nhuộm bằng thuốc nhuộm

- Coomassie Brilliant Blue là loại thường sử

dụng nhất, hay có thể dùng để nhuộm các gel điện di polypeptide có khối lượng phân tử thấp

- Bạc, nhạy nhất trong nhuộm protein và nucleic acid, thường dùng đánh giá độ tinh khiết của

quá trình chuẩn bị mẫu

- Đồng, cho phép phát hiện sớm và nhạy các

band protein trong SDS-PAGE mà không cần phải cố định gel

Phát hiện sau điện di

DNA khi điện di trên gel agarose hay polyacrylamide đều được nhuộm bằng ethidium bromide, sau đó được thu nhận hình ảnh nhờ Transilluminator

Methyl blue cũng được dùng để nhuộm RNA và DNA khi điện di trên gel polyacrylamide

Bạc cũng được dùng trong nhuộm DNA và RNA

Xác định khối lượng phân tử

Thông thường được so sánh

với sự di chuyển của một

chuẩn protein đã biết trước

Các loại gel đặc biệt

1 Gel theo gradient của kích thước lổ gel: là loại gel có sự thay đổi liên tục trong kích thước các lổ gel theo chiều điện

di, thường được dùng trong phân tách các hổn hợp có chứa nhiều kích thước khác nhau

2 Gel Điện di hai chiều:

Các loại gel đặc biệt

3 Gel dùng trong xác định trình tự Nucleic acid

Thông thường mỏng (≤ 4mm) TBE buffer có chứa 7M uréa các đoạn polynucleotic phải ở dạng sợi đơn

Electrophoresis

Isoelectric Focusing (IEF)

Là phương pháp điện di phân tách các phân tử lưỡng tính ion

Isoelectric Focusing (IEF)

IEF là công cụ phân tích, sử dụng gel polyacrylamide có kích thước lổ lớn (5%T, 3%C) hay gel agarose (1%)

Được polymer hóa với chất khởi động có cả riboflavin để thúc đẩy quá trình quang polymer hóa

=> gel được polymer hóa hoàn toàn hơn gel thông thường

Tỉ lệ các chất khởi động thường là:

0.015% Ammonium sulfate 0.05% TEMED

5mg/ml riboflavin

Phân tích dùng IEF

Isoelectric Focusing (IEF)

IEF là công cụ dùng trong phòng thí nghiệm dùng để thu nhận các mẫu từ một gam đến hàng trăm gam protein với độ thu nhận > 90% lượng mẫu

Thích hợp trong chuẫn bị ở từng giai đoạn nhưng chủ yếu là giai đoạn trứơc của quá trình tinh sạch protein

Chuẩn bị mẫu dùng IEF – Hệ Rotofor

Immunoelectrophoresis (IEP)

IEP là công cụ để nghiên cứu kháng nguyên và kháng thể Kháng nguyên trước hết được tách các thành phần bằng điện di trên gel agarose, sau đó được dò với kháng thể khi vẫn

ở trên gel cho phép xác định các kháng nguyên thông qua các kháng thể đặc hiệu chuyên biệt

Xác định và đo nhiều loại kháng nguyên có thể thực hiện trên điện di miễn dịch 2 chiều (2D rocket IEP) Điện di agarose để tách kháng nguyên sau đó tách line điện di hợp nhất với gel có chứa sẵn kháng thể và chạy điện di lần thứ hai

=> antigen – antibody

Điện di miễn dịch

Phương pháp này hiện nay dần được thay thế bởi cơ chế immunoblotting

Kỹ thuật chuyển lên màng lai

(Blotting Techniques)

Protein từ một môi trường tách (gel Agarose hay Acrylamide) lên một bản khô, mỏng để thuận lợi cho nghiên cứu

Kỹ thuật chuyển lên màng lai

(Blotting Techniques)

1 Điện di trên Gel (agarose hay acrylamide)

2 Chuyển lên màng để cố định như là phiên bản

của các band trên gel

3 Các vị trí gắn protein trên màng được bão hòa

để ngăn các gắn kết không chuyên biệt

4 Dò với các mẫu dò chuyên biệt các phân tử

5 Phát hiện các mẫu dò

Phương pháp mao dẫn cổ điển

Pulsed-Field Gel Electrophoresis

(Điện di đa chiều)

Phân tách các phân tử DNA có kích thước lớn

(hàng triệu base)

Capillary Electrophoresis

(Điện di mao dẫn)

Phân tích điện di tự động

Capillary Electrophoresis

(Ñieän di mao daãn)

Capillary Electrophoresis

(Ñieän di mao daãn)

Capillary Electrophoresis

(Ñieän di mao daãn)

Hệ thống điện di tự động - Experion

Một số ứng dụng

1 Khoa học

2 Casein

3 Nước giải khát

Trong khoa học

1 Giám sát quá trình tinh sạch protein

Protein tinh cho một band đơn

2 Xác định khối lượng phân tử tương đối của

protein

Điện di phân tích Casein

1 Cải thiện sự phân tách, xác định và định

lượng tương đối các đoạn của casein có trong sữa bò và sự thủy phân casein

2 Hiểu biết nhiều hơn về thành phần và sự

phân phối của protein sữa để xác nhận sự gian lận

Nước giải khát

1 Ảnh hưởng của chất lượng Malt lên tính ổn định của bia

2 Sự tạo thành các chất vẫn đục trong quá trình lưu trữ

và vận chuyển

3 Các kết quả từ sự tương tác giữa protein có proline cao

với polyphenol hiện diện trong bia

4 SDS-PAGE kết hợp với Immunoblotting xác định các

peptides hiện diện trong lúa mạch và Malt chính là

nguồn gốc gây nên sự vẩn đục trong bia

Tài liệu tham khảo

1 SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis: SDS-PAGE,

Ed Rybicki and Maud Purves, Dept Microbiology,

University of Cape Town