Thiet bi va ktcnsh 8 elisa

Trang 1 KỸ THUẬT ELISA ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY TS.. Huỳnh Văn Biết Viện Nghiên cứu CNSH-MT Trang 2 ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên

KỸ THUẬT ELISA

(ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)

TS Huỳnh Văn Biết Viện Nghiên cứu CNSH-MT

TP HCM, 12/12/2014

ELISA

(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme

– Kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích

– Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone…

– được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu

như y học, thực phẩm, nông nghiệp

- Sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể,

trong đó kháng thể được gắn với một enzyme

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

- Cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) được cho vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu

- Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên

Kháng nguyên, kháng thể

và chất tạo màu

- Phản ứng miễn dịch học: KN + KT

- Phản ứng hóa học:

enzyme xúc tác làm giải phóng oxy nguyên tử [O]

từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu

Kháng

nguyên

Cơ chất

Kháng thể phát hiện gắn enzyme

Kháng thể bắt

Ag Ag

Các dạng phản ứng gắn kết

1 ELISA trực tiếp 2 ELISA gián tiếp

3 Sandwich ELISA trực tiếp

Hai kháng thể DAS ELISA

4 Sandwich ELISA gián tiếp

Ba kháng thể TAS ELISA

E

E

E

E

E

E

E

E

E Enzyme

Kháng nguyên

Ag

Ag Ag

E

Sandwich direct ELISA (DAS ELISA)

E

Cơ chất

Cơ chất

Cơ chất

Cơ chất

Sandwich indirect immunodetection (TAS ELISA)

E

Cơ chất

Cơ chất

Cơ chất

Cơ chất

Sandwich ELISA

1 Phủ kháng thể sơ cấp lên đĩa

2 Thêm kháng nguyên (mẫu dịch thực vật cần xét nghiệm) vào đĩa

4 Thêm cơ chất, để phản ứng diễn ra, thay đổi màu

5 Dừng phản ứng, đọc kết quả bằng mắt thường hoặc

Máy đo quang phổ ELISA

3 Phủ tiếp kháng thể sơ cấp lần hai và kháng thể thứ cấp có gắn Enzyme vào mỗi giếng

Các yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phản ứng ELISA

- Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng

- Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên

- Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên

Biện luận kết quả

- Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả ELISA

* Đối chứng âm xuất hiện màu

*Đối chứng dương không xuất hiện màu

*Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng thể được gắn enzyme

và nồng độ của chất tạo màu

- Lập đường chuẩn đối với ELISA định lượng

Real-world

Applications of

Antibodies

Agricultural Uses

– Crop-specific disease diagnosis

– Animal disease diagnosis – Detection of GM crops – Basic research

Applications

– Dipstick tests/ELISA

– Immunostaining

– Western blotting

Bio-Rad’s TSE ELISA Kit

ELISA to test

for GMOs

• ELISA can help farmers separate their GMO grain lots from non-GMO grain lots

• ELISA tests are used to identify specific proteins

- Delta-endotoxin Cry1Ab from Bt11

- glyphosate from Round-up (RR)

“Genetically Modified Organism (GMO)"

an organism in which the genetic material has been altered in a way that does not occur naturally by mating and/or natural

recombination

DNA RNA Protein

How to test for

Test for presence of proteins expressed from genetic

modifications Pro: Quick, inexpensive, low tech Con: Crop specific, protein stability

Test for presence of inserted foreign DNA

Pro: ID different GM crops, DNA stability

Con: Expensive, timely