Thiet bi va ktcnsh 4 bis proteomics vn 2d bis

Proteomics bao gồm các công việc tương tự tìm trình tự di truyền bằng cấu trúc không gian ba chiều của protein và trong chức năng protein, phát triêûn các kỹ thuật tách chiết protein và

Công cụ và kỹ thuật khám phá

thế giới Protein

Giới thiệu về Proteomics

Thuật ngữ Proteome: các phần protein chuyên biệt về thời gian và về mặt tế bào được biểu hiện từ Genome

Bộ gen: khá ổn định, đồng nhất trong tế bào của một sinh vật và không có nhiều thay đổi trong loài Protein lại biến động theo thời gian và dễ dàng phản ứng với các yếu tố bên ngoài, và đặc biệt là khác nhau rất nhiều về căn bản giữa các loại tế bào khác nhau

Proteomics là quá trình nghiên cứu toàn bộ protein hay các phần protein bổ sung hình thành từ một mô hay một dòng tế bào

Ngày nay, proteomics có thể được chia thành proteomics kinh điển

(Classical) và Proteomics chức năng

Classical proteomics tập trung nghiên cứu vào toàn bộ hệ protein từ hai dòng tế bào được xử lý khác nhau, trong khi đó Proteomics chức năng nghiên cứu vào một nhóm protein giới hạn hơn

Có ba vấn đề chính được đặt ra cho Proteomics:

1) Các loại protein nào hiện diện?

2) Một protein đặc trưng có tương tác gì với các protein khác?

3) Protein đặc trưng đó như thế nào (về mặt cấu trúc)?

Giới thiệu về Proteomics

Thuật ngữ Proteomics bao hàm một sự nghiên cứu rộng nhằm mục đích tìm hiểu và giám sát hoạt động chức năng của các protein

Proteomics bao gồm các công việc tương tự tìm trình tự di truyền bằng cấu trúc không gian ba chiều của protein và trong chức năng protein, phát triêûn các kỹ thuật tách chiết protein và lập hồ sơ protein, nghiên cứu các tương tác giữa protein với protein

Proteomics hứa hẹn khám phá ra những mục tiêu mới cho nghiên cứu dược phẩm thông qua việc nghiên cứu chức năng của hàng ngàn protein chưa xác định mà người ta mong muốn sẽ được phát hiện trong nghiên cứu bộ gen người

Proteomics cung cấp dữ liệu nghiên cứu để cải thiện các chương ttrình phần mềm máy tính nhằm dự đoán cấu trúc protein từ các trình tự DNA; Nó cho phép chúng ta có thể giải thích thông tin có chứa trong toàn bộ gen

Giới thiệu về Proteomics

Bộ gen sẽ cung cấp những điều

kỳ diệu???

Tế bào (genes) DNA mRNA proteins

Nhưng, chỉ có 30,000 gene trong bộ gene người, mà có tới hơn 100,000 protein trong hệ Proteome người

Genomics đã cung cấp một lượng rất lớn dữ liệu, nhưng hầu hết chúng ta vẫn chưa giải thích được cho đến nay

Trong một số trường hợp, Genomics cho chúng ta nhiều câu hỏi hơn là câu trả lời

Các vấn đề nảy sinh của proteomics hứa hẹn trả lời cho một số câu hỏi đó bằng việc nghiên cứu có hệ thống tất cả các

protein được mã hóa bởi bộ gene

Bộ gen sẽ cung cấp những điều

kỳ diệu???

Điện di hai chiều - Two-dimensional electrophoresis (2-DE) là công cụ thí nghiệm truyền thống đáng tin cậy nhất trong phân tách hàng ngàn protein trên cùng một bản gel

Xác định Protein bằng khối phổ (mass spectrometry) là công cụ tốt nhất hiện nay trong phân tích protein và là một trong những kỹ thuật chủ yếu trong các lãnh vực nghiên cứu protein

Protein microarrays cung cấp một quá trình phân tích định lượng một lượng lớn các tương tác giữa các phân tử Nhiều thí nghiệm sử dụng Microarray thường thực hiện chung với khối phổ

Các phương pháp khác:

X-ray crystallography, NMR, Edman degradation, etc

CÁC PHƯƠNG PHÁP TRONG

PROTEOMICS

• Kết hợp giữa isoelectic focusing (IEF) và SDS-PAGE – cho kết quả có độ phân giải

cao hơn rất nhiều so với từng phương pháp

IPG

Sample Prep SDS-PAGE

2-D PAGE for Protein Separations

Ưùng dụng điện di hai chiều trong

nghiên cứu Proteomics

1) Phác thảo nên một phương pháp để khám

phá proteomics

2) Xác định các phương pháp để tối ưu hóa các

kết quả điện di hai chiều

3) Đưa ra các chọn lựa cho việc chuẩn bị mẫu

để phân tích các hệ thống phức tạp

4) Cho phép phân tích các biểu hiện phân biệt

trong Proteomics

ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2D-electrophoresis)

Bước đầu tiên trong phân tích 2-DE analysis là quá trình chuẩn bị mẫu; proteins có trong tế bào hay mô cần nghiên cứu phải được hòa tan và tất cả DNA và các chất tạp nhiễm phải được loại ra khỏi dung dịch

Các phương pháp chuẩn bị mẫu tùy thuộc vào mục đích của nghiên cứu và đây chính là chìa khoá để các thí nghiệm được thực hiện thành công

Các yếu tố như độ hòa tan, kích thước, điện tích và điểm đẳng điện (pI) của protein phải được tính đến trong quá trình chuẩn bị mẫu

ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2D-electrophoresis)

Điện di chiều thứ hai: quá trình điện di SDS-PAGE thông thường, các strip IPG được dùng như là mẫu điện di Việc chọn lựa gel sử dụng cho điện di chiều thứ hai tùy thuộc vào trọng lượng phân tử (MW) cần tách

Để có thể phân tích lượng lớn protein, có thể chạy nhiều gel cùng lúc

Các thang protein chuẩn được dùng để xác định trọng lượng phân tử của protein cần phân tích

ĐIỆN DI HAI CHIỀU

Quá trình chuẩn bị mẫu hiệu quả sẽ:

1 Hòa tan tất cả protein có trong mẫu

2 Ngăn cản sự tích tụ và giảm tính tan trong khi điện di

3 Ngăn cản việc giảm hoạt tính về mặt hóa học hay

enzyme của protein mẫu

4 Loại bỏ hoặc tiêu hủy hoàn toàn các acid nucleic hay

các phân tử gây ảnh hưởng khác

5 Hiệu suất thu hồi các protein mong muốn ở mức phát

hiện được

Chuẩn bị mẫu – chìa khóa thành công

ĐIỆN DI HAI CHIỀU

Hầu hết các protein đều cần thiết một số thí nghiệm để xác

định các điều kiện tối ưu cho điện di 2 chiều Sự khác nhau

về nồng độ các chất sử dụng có thể ảnh hưởng đến kết quả

phân tích

Urea và thiourea được dùng để giúp hoà tan protein, Urea

thường được sử dụng ở nồng độ 8M

Các chất tẩy khác cũng được sử dụng để làm tăng tính hòa

tan của protein ở điểm đẳng điện

Các chất mang lưỡng tính Ampholytes làm trung hòa và

giúp các protein không kết tủa trong quá trình điện di

Chuẩn bị mẫu – chìa khóa thành công

ĐIỆN DI HAI CHIỀU

Các chất khử như DTT hay TBP được sử dụng để phá vỡ

cầu nối disulfide

Nồng độ DTT quá cao sẽ ảnh hưởng đến gradient pH vì

pKa của DTT xấp xỉ 8

Bio-Rad cung cấp một giải pháp tối ưu cho quá trình chuẩn

bị mẫu Protein:

ReadyPrep sequential extraction Kit

Chuẩn bị mẫu – chìa khóa thành công

Residue 3

Dung dòch 3

Urea/thiourea/CHAPS/SB3-10 Tris/Bio-Lyte® / TBP

ReadyPrep  Sequential Extraction Kit

ÑIEÄN DI HAI CHIEÀU (2D-electrophoresis)

First Dimension IEF

• PROTEAN IEF Cell (Bio-Rad)

– Thiết bị chính của các PTN 2-D

• Thiết kế phù hợp dễ dàng sử dụng

– Khay có 12 kênh để focusing – Các khay hydrat hóa được tách riêng để đạt được lượng mẫu lớn – Có thể lập và lưu chương trình trong máy

• Các strip 7,11,17,18,& 24 cm

• 10,000 volts and Peltier cooling

• Bộ load mẫu có 12 kênh

Nhiều kết quả với khoảng pH hẹp

+ –

Điện tích

Kích thuớc

The 2nd Dimension: SDS-PAGE

Proteins di

chuyển qua gel

với tốc độ thích

Tất cả các loại hoá chất,

thuốc nhuộm, dung dịch

đệm và protein chuẩn

CRITERION Cell

Điện di trên gel lượng lớn Protein

• PROTEAN Plus Dodeca Cell

– Chạy cùng lúc 12 gels

– Độ lặp lại cao (Excellent reproducibility)

• Hệ thống làm lạnh

• Các điện cực dạng đĩa

– Có thể dùng hai kích thước gel khác nhau

với cùng một cell (18 và 20cm)

– Dễ dàng thao tác

• Gel chuẩn bị sẵn

A Complete Large-format Family

ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2D-electrophoresis)

Sau khi chạy điện di hai chiều, để quan sát protein ta có thể nhuộm protein bằng nhiều loại thuốc nhuộm khác nhau Tùy thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau bao gồm:

-Độ nhạy mong muốn

-Độ tiện dụng

-Giá thành

-Các loại thiết bị nhuộm sẵn có…

Một số loại protein có thể được nhuộm sau khi đã chuyển lên màng dùng trong lai protein

Các thuốc nhuộm thông thường sử dụng là: Coomasie Blue, Sybro Ruby hay nhuộm bạc

 Khay nhuộm

Tối ưu hóa hiệu quả nhuộm protein

 Kệ lắc

 Dung dịch nhuộm

 Mô tơ quay

Thiết bị lắc lý tưởng

để tối ưu hoá hiệu quả

nhuộm protein

Các thuận lợi khi dùng 2-DE

Các nguyên liệu (các chất phân giải từ tế bào, mô) có thể được áp dụng trực tiếp lên bản gel

• Có thể phát hiện gần như toàn bộ protein có trong mẫu

• Xem xét được sự thay đổi giữa mẫu chuẩn và mẫu cần

nghiên cứu

• Các protein được tách có thể chiết ra để thực hiện các

nghiên cứu tiếp theo trong việc tìm hiểu cấu trúc và chức năng protein

Differential Expression

E Coli grown at 30º C E Coli grown at 42º C

Ghi nhận và phân tích hình ảnh

• Nhân tố quan trọng nhất của 2-D là việc ghi lại hình ảnh

kỹ thuật số, một phương tiện thực tế để thu nhận các dữ liệu về protein

• Nó cho phép so sánh một cách khách quan thông tin về

proteome, chuyển giao thông tin giữa nhiều nghiên cứu khác nhau, và cho phép lập danh mục số lượng lớn dữ

liệu về protein

• Các hình ảnh được xử lý và so sánh trên các phần mềm

vi tính

Các hệ thống thu nhận hình ảnh

Molecular Imager® FX Pro Plus™

PDQuest 7.1: Nét mới ý nghĩa

• Tăng cường hình ảnh cho gel nhuộm bởi

SYPRO Ruby

• Hệ dữ liệu phân biệt mới

• Cải thiện tính năng cho các công cụ quan sát

protein

– Quan sát được không gian ba chiều

• Tăng cường độ nhạy cho các công cụ phân tích

thống kê

dụng có thể chọn lựa các mức độ phân tích khác nhau

Mass spec identification

Xác định Protein

Imaging systems

Image analysis

2-D array

gel / blot

Protein excision

OOO OO OOOOO OOOOO OOOOO OOOOO

• Tự động phát hiện và cắt

các điểm protein đã được tách trên bản gel

• Phân phối vào các giếng

hay các đĩa thu mẫu

• Hoạt động độc lập hay điều

khiển bởi phần mềm

Proteomics: Spot Cutter

Analysis image Spot Cutter image

Proteomics: Spot Cutter

Xác định Protein

• Các protein đã được phân lập từ gel được phân nhỏ để

giải phóng ra các phân tử peptide

xác định trình tự

• Xác định và phân loại protein

Micromass MassPREP Digestion Station

• Rửa sạch mẫu

• ZipTip microSPE

• Automated

M@LDI target

loading

MS in proteomics: protein sequencing