Tom Tat Tieng Viet Hoan Chinh.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM MẪN HỒNG PHƯỚC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN BẤT HOẠT PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp ) Chuyên ng[.]

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS)

Phản biện 2: PGS.TS Kim Văn Vạn

Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại:

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam (VAAS) ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:

1 Thư Viện Quốc gia

2 Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngành nuôi trồng thủy sản được xem là một trong những ngành kinh

tế mũi nhọn của Việt Nam và liên tục tăng trưởng trong những năm gần đây cả về diện tích và sản lượng Tổng sản lượng thủy sản năm 2022 ước đạt 9.026,3 nghìn tấn, tăng 2,7% so với năm 2021, trong đó sản lượng thủy sản nuôi trồng ước đạt 5.163,7 nghìn tấn, tăng 6,3% so với năm 2021 Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới cũng như ở Việt Nam luôn phải đối mặt với những khó khăn và thách thức, đặc biệt trong những năm gần đây, các bệnh do vi rút trên động vật thủy sản như bệnh xuất huyết cá

trắm cỏ, bệnh vi rút mùa xuân trên cá chép, bệnh Iridovirus trên cá mú,

bệnh hoại tử tụy truyền nhiễm, hoại tử lách và thận truyền nhiễm, hoại tử

cơ quan tạo máu truyền nhiễm, tụ huyết trùng do vi rút gây thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế cho nuôi trồng thủy sản

Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrosis-VNN) được phát hiện

ở hầu hết các nước trên thế giới, gây ảnh hưởng đến hơn 120 loài cá biển, trong đó có nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao Bệnh đã được xác định

là do vi rút hoại tử thần kinh (Nervous necrosis virus-NNV) gây ra Cá mắc bệnh hoại tử thần kinh xuất hiện các triệu chứng đặc trưng: bơi lội không định hướng, thân sẫm màu, bỏ ăn, 80 -100% cá bị bệnh có thể chết sau 3-5 ngày

Dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản ngày càng có xu hướng gia tăng qua các năm, phạm vi lây nhiễm rộng, tỷ lệ mắc cao, chủng loại đa dạng, thời gian khởi phát kéo dài, vì thế, việc kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản là vấn đề cấp thiết Kiểm soát dịch bệnh bằng chế phẩm vi sinh, chất kích thích miễn dịch, vắc-xin ngày càng được ứng dụng nhiều trong các mô hình canh tác sinh thái Trong đó, sử dụng vắc-xin là một biện pháp phòng bệnh hiệu quả và an toàn để ngăn ngừa dịch bệnh gây ra bởi vi rút, vi khuẩn

Hiện tại, hầu hết các loại vắc-xin thủy sản thương mại vẫn là loại vắc-xin bất hoạt bởi tính an toàn Vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh nghiêm trọng ở giai đoạn ấu trùng, cá bột, cá hương, cá giống với tỷ lệ chết lên tới 100%, vì vậy, vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh thường được dùng cho

cá bằng đường ngâm

Xuất phát từ cơ sở lý luận và nhu cầu thực tiễn trên, đề tài: “Nghiên

cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú

(Epinephelus spp.)” được tiến hành nhằm tạo được vắc-xin bất hoạt

phòng bệnh hoạt tử thần kinh ở cá mú

2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung:

Nghiên cứu được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho

cá mú từ chủng vi rút phân lập tại miền Bắc, Việt Nam

Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

3.1 Ý nghĩa khoa học:

Luận án đã chế tạo được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú với các bước: phân lập, tuyển chọn chủng giống làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin, đánh giá chủng giống gốc, nhân nuôi vi rút trên tế bào, bất hoạt vi rút, xác định các điều kiện tạo vắc-xin bán thành phẩm và đánh giá chất lượng của vắc-xin bán thành phẩm Kết quả nghiên cứu là dữ liệu khoa học, cung cấp thêm tư liệu tham khảo cho các nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh cho các đối tượng cá biển có giá trị kinh

tế cao

3.2 Ý nghĩa thực tiễn:

Luận án đã nghiên cứu thành công vắc-xin bất hoạt keo phèn đạt chỉ tiêu an toàn và hiệu quả trong phòng bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu:

Các chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phân lập từ một số loài

cá mú nuôi ở một số tỉnh khu vực miền Bắc

4.2 Phạm vi nghiên cứu:

Các chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phân lập từ cá biển nuôi tại các vùng biển quanh đảo Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định)

5 Những đóng góp mới của luận án

Luận án đã nghiên cứu một cách toàn diện về các đặc điểm của chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh ở

cá mú, bao gồm tính thuần khiết, tính sinh miễn dịch bảo hộ, tính ổn định

về mặt di truyền và năng suất sau khi nhân nuôi trên tế bào GS01

Luận án đã chế tạo được vắc-xin bất hoạt keo phèn bằng chủng vi rút TB05 phân lập tại tỉnh Thái Bình, vắc-xin bất hoạt keo phèn được sử dụng cho cá bằng phương pháp ngâm, tỷ lệ an toàn 100%, tỷ lệ bảo hộ đạt 75,8% sau 3 tháng

6 Bố cục của luận án

Luận án gồm (1) Mở đầu 5 trang, (2) Tổng quan 27 trang, (3) Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 16 trang, (4) Kết quả nghiên cứu 53 trang, (5) Kết luận và kiến nghị 1 trang, 250 TLTK, 22 bảng, 18 hình

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá mú

Cá mú thuộc họ Serranidae, họ phụ cá mú (Epinephelinae), giống Epinephelus, tên tiếng Anh: groupers Có tất cả 87 loài được liệt kê trong chi Epinephelus (E.), riêng khu vực Ấn Độ, Thái Bình Dương đã phát hiện được 63 loài thuộc giống Epinephelus, cá mú là loài cá sống dưới đáy tại

những rạn san hô, đá cứng, vùng nước ấm, phân bố chủ yếu ở những vùng biển nhiệt đới, á nhiệt đới và ít thấy ở vùng biển ôn đới Nhiệt độ thích hợp cho các loài cá mú phát triển là 25-300C, độ mặn từ 11- 41‰ Hầu hết tất

cả các loài cá mú đều là loài lưỡng tính nguyên sinh Tuyến sinh dục ban đầu chưa được biệt hóa sau đó chúng được biệt hóa thành buồng trứng ở tất cả các cá thể Sau khi trưởng thành thành con cái, chúng trải qua quá trình thay đổi giới tính thành con đực, biến đổi buồng trứng thành tinh hoàn Sự thay đổi giới tính tự nhiên ở các loài cá mú xảy ra từ 3 đến 11 tháng tuổi tùy theo loài Cá mú có xu hướng đẻ trứng vào đầu mùa xuân và mùa hè Mặc dù một số loài như cá mú sinh sản quanh năm, còn lại hầu hết các loài cá mú sinh sản trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 5

1.2 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam

Bệnh hoại tử thần kinh đã được báo cáo chính thức trên toàn thế giới, ngoại trừ Nam Mỹ VNN xuất hiện ở các quốc gia khu vực châu Á như Ấn

Độ, Indonesia, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Việt Nam; Châu Đại Dương như Úc, Tahiti; vùng Địa Trung Hải như Pháp, Hy Lạp, Ý, Malta, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Tunisia hoặc

các quốc gia khác như, Vương quốc Anh, Na Uy, Quần đảo Caribe và Bắc Mỹ

Ở châu Á, tỷ lệ tử vong hàng loạt được ghi nhận ở giai đoạn ương

giống cá mú ở Singapore, cá mú chấm đỏ (E akaara) và cá háo sọc (Pseudocaranx dentex) ở Nhật Bản, cá đối đầu dẹt (Mugil cephalus) ở Trung Quốc, cũng như cá hồng mỹ (Sciaenops ocellatus) ở Israel Ở Bắc

Mỹ, bệnh VNN được phát hiện trên cá chẽm trắng (Atractoscion nobilisthe) và cá tuyết Đại Tây Dương Ngoài ra, bệnh bệnh hoại tử thần

kinh không chỉ lây nhiễm trên cá biển mà còn ở nhiều loại động vật thủy sinh nước ngọt

Ở Việt Nam đã phát hiện một số loài cá mú nhiễm bệnh hoại tử thần

kinh, bao gồm các loài: E coioides, E fuscogutatus, E tauvina, E lanceolatus, E malabaricus ở Khánh Hòa, E coioides ở Cát Bà (Hải

Phòng) và Cửa Hội (Nghệ An) Bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam được phát hiện lần đầu tiên vào năm 2002 ở các lồng nuôi tại Vân Đồn, Quảng Ninh

1.3 Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh

Tác nhân gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá được xác định là

Betanodavirus, Vi rút không có vỏ bọc, hình cầu, đường kính từ 25-30 nm,

có đối xứng hình tứ diện, vỏ protein bao gồm 180 protein với khối lượng

42 kDa Hệ gen của Betanodavirus có cấu trúc ARN mạch đơn, sợi dương

gồm 2 tiểu phần: Tiểu phần lớn của hệ gen chứa ARN1 (3.1 kb) và Tiểu phần nhỏ của hệ gen chứa ARN2 (1.4 kb), trên ARN2 chứa một khung đọc

mở (ORF) cho một protein vỏ đồng thời chứa hai vùng bảo thủ cao là T2

(870 bp) và T4 (420 bp) Giống Betanodavirus được phân thành 4 kiểu gen

chính, bao gồm: vi rút hoại tử thần kinh ở cá bơn sọc (SJNNV), vi rút hoại

tử thần kinh ở cá nóc hổ (TPNNV), vi rút hoại tử thần kinh ở cá mú đốm

đỏ (RGNNV) và vi rút hoại tử thần kinh ở cá bơn (BFNNV)

Vi rút xâm nhập vào tế bào vật chủ bằng phương thức lây truyền theo chiều ngang và chiều dọc và tạo ra sự lây nhiễm chính thức bằng cách xâm nhập vào các tế bào nhạy cảm của hệ thống thần kinh trung ương bao gồm não, tủy sống và võng mạc dẫn đến các biểu hiện lâm sàng của cá khi mắc bệnh như: bơi không định hướng, thân thẫm màu, mắt lồi, cong thân

1.4 Tổng quan về vắc-xin thủy sản

Vắc-xin trong nuôi trồng thủy sản được xem là một biện pháp phòng

ngừa hiệu quả đối với nhiều bệnh và gần đây đã trở nên phổ biến Theo tác nhân gây bệnh, vắc-xin thủy sản có thể được phân loại thành vắc-xin vi khuẩn, vắc-xin vi rút và vắc-xin ký sinh trùng, chúng cũng có thể được phân loại theo thành phần bao gồm vắc-xin đơn giá, vắc-xin đa giá hoặc vắc-xin hỗn hợp, hoặc phân loại theo bản chất chẳng hạn như vắc-xin sống giảm độc lực, vắc-xin bất hoạt hoặc vắc-xin tiểu đơn vị, vắc-xin axit nucleic, vắc-xin tái tổ hợp Cần lưu ý rằng mỗi loại vắc-xin đều có những

ưu điểm và nhược điểm, các loại vắc-xin khác nhau cần được phát triển và

sử dụng cho các tác nhân gây bệnh và động vật khác nhau

Phương pháp sử dụng vắc-xin trong thủy sản thường được dùng bằng

đường tiêm, vắc-xin ngâm và vắc-xin cho ăn Mỗi loại cũng có ưu và

nhược điểm và phù hợp với từng đối tượng các khác nhau

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Cá bệnh

Mẫu cá mú được thu thập ở vùng nuôi trồng thủy sản ven biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định)

2.1.2 Cá thí nghiệm

Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) dài 2-2,5 cm, cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) dài 2-2,5 cm và mú chuột (Cromileptes altivelis) dài 5,5-6 cm được cung cấp bởi Trung tâm Quốc gia Giống hải

sản miền Bắc, Xuân Đán, Cát Bà, Hải Phòng

2.1.3 Tế bào

Tế bào GS01 (tế bào lách cá mú) do trường Đại học Wageningen, Hà Lan cung cấp

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Phân lập và lựa chọn được chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần

kinh làm giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho

cá mú

2.2.2 Sản xuất được vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho

cá mú

2.2.3 Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.3.1 Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật - Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội và phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

2.3.2 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 04/2016 đến tháng 04/2020

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu

2.4.2 Kỹ thuật phân lập vi rút trên tế bào mẫn cảm GS01

2.4.3 Kỹ thuật tách chiết ARN tổng số

2.4.4 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

2.4.5 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

2.4.6 Phương pháp điện di trên gel agarose

2.4.7 Phương pháp giải trình tự ADN

2.4.8 Phương pháp xác định TCID50, LD50 của NNV

2.4.9 Xác định điều kiện nhân giống vi rút

2.4.10 Phương pháp bất hoạt vi rút

2.4.11 Phương pháp tạo vắc-xin keo phèn

2.4.12.Phương pháp trung hòa trên tế bào

2.4.13 Phương pháp gây miễn dịch

2.4.14 Phản ứng ELISA gián tiếp

2.4.15 Phương pháp thử thách cường độc

2.4.16 Đánh giá độ an toàn vắc-xin

2.4.17 Đánh giá hiệu quả vắc-xin ở điều kiện thực nghiệm

2.4.18 Phương pháp xử lý số liệu

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả phân lập, lựa chọn chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú

3.1.1 Phân lập vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh từ cá mú nghi nhiễm bệnh

ở 4 tỉnh miền Bắc, Việt Nam

Trong tổng số 60 mẫu cá mú có các triệu chứng của bệnh hoại tử thần kinh được thu thập từ các vùng biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định)

Hình 3.1 Mẫu cá mú nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh

A: cá mú khỏe mạnh; B và C: mẫu cá mú nghi mắc VNN

Bảng 3.1 Kết quả sàng lọc gen T4 trong các mẫu cá nghi nhiễm NNV

Địa điểm Số lượng

mẫu

Số mẫu dương tính gen T4

Tỷ lệ dương tính (%)

Giếng 1-5: các mẫu nghi nhiễm NNV; M: thang ADN

chuẩn 1kb 420 bp Kết quả sàng lọc bằng sinh học phân tử từ 60 mẫu cá mú nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh thì có 32 mẫu phát hiện thấy đoạn gen có kích thước 420 bp, tương ứng với kích thước của đoạn gen T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh Các mẫu dương tính với gen T4 được sử dụng để phân lập vi rút trên tế bào mẫn cảm GS01

Vi rút nhân lên trong tế bào và được đánh giá bằng hiệu ứng huỷ hoại

tế bào (cytopathic effects - CPE)

Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE)

theo thời gian (giờ)

Ghi chú: ++++: CPE > 98%; +++: CPE > 85%; ++: CPE > 50%; +:

CPE > 20%; +: nghi ngờ có CPE > 10%; -: không có CPE

Kết quả phân lập vi rút trên tế bào GS01 cho thấy, trong các đĩa nuôi cấy tế bào GS01, các mẫu bệnh phẩm bắt đầu gây ra hiệu ứng hủy hoại tế bào sau 72 giờ gây nhiễm, biểu hiện bệnh tích tế bào tăng trong các ngày tiếp theo và cao nhất từ 168 đến 192 giờ sau gây nhiễm

3.1.2 Xác định độc lực vi rút (TCID 50 và LD 50 )

Độc lực của vi rút được xác định bằng liều gây chết 50% tế bào nuôi cấy (Tissue culture infective dose - TCID50) và/hoặc liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (Lethal dose- LD50)

Bảng 3.3 Kết quả xác định TCID 50 trên tế bào GS01

STT

Ký

hiệu

mẫu

Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) (%) theo

các độ pha loãng vi rút TCID

50/mL

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9

Bảng 3.4 Kết quả xác định LD 50 trên cá mú giống

Kết quả xác định loài của hai mẫu TB05 và HP02 thông qua trình tự gen T4 với trình tự ARN2 của các chủng vi rút hoại tử thần kinh được công bố trên Genebank Kết quả này cho phép kết luận các mẫu TB05 và HP02 là vi rút hoại tử thần kinh

Bảng 3.5 So sánh mức độ tương đồng của trình tự đoạn gen T4 của mẫu HP02 và TB05 với các trình tự của GenBank

Mã số GenBank Tên chủng và gen xác định

trình tự

Phần trăm trình tự được

so sánh với GenBank (%)

Mức độ tương đồng (%) Mẫu TB05

KU705815.1

Mouse grouper nervous necrosis virus isolate VI37 segment ARN2, complete sequence

87 99,19