2. Tóm Tắt Tiếng Việt.pdf

1 MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết của đề tài Nguồn tài nguyên di truyền thực vật đóng một vai trò quan trọng đối với sản xuất nông nghiệp theo hướng đa dạng hóa, hiện đại hóa Trong công tác khai thác và sử dụ[.]

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nguồn tài nguyên di truyền thực vật đóng một vai trò quan trọng đối với sản xuất nông nghiệp theo hướng đa dạng hóa, hiện đại hóa…Trong công tác khai thác và sử dụng bền vững tài nguyên di truyền thực vật, việc đánh giá đặc điểm kiểu gene là công đoạn vô cùng quan trọng không chỉ phục vụ cho việc xác định, phân biệt các giống/loài khác nhau mà còn giúp tìm hiểu mối quan hệ di truyền của chúng Sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử đã tạo ra các công cụ hữu hiệu và nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu di truyền về kiểu gene Hiện nay, phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử trong việc định danh và nghiên cứu di truyền ngày càng được sử dụng phổ biến Sử dụng vùng gene chỉ thị DNA barcode là một công cụ mới, đang được ứng dụng rộng rãi trên thế giới, dựa trên sự tiến hóa và sự khác biệt trình tự của các nucleotide cho phép phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống/loài khác nhau

N nucifera là loài sen thuộc nhóm thực vật thủy sinh sống trong các ao

hồ, đầm lầy, được trồng ở nhiều nơi trên thế giới Ở Thừa Thiên Huế, hiện nay có nhiều giống sen màu sắc hoa khác nhau đang được trồng tại nhiều nơi

ở các khu vực ngoại thành và nội thành Sen Trắng Trẹt Lõm là giống sen Huế bản địa xưa, được biết đến như một giống sen cung đình rất nổi tiếng, đã được trồng từ xa xưa trên các hồ sen của khu vực nội thành, hồ lăng tẩm và các hồ sen thuộc vùng di tích của Cố đô Huế Giống sen này có hương thơm dịu dàng, hoa trắng thanh khiết, củ và hạt sen có hương vị và chất lượng đặt biệt, mang thương hiệu “sen Huế”, rất được du khách ưa chuộng

Trong những năm gần đây, phong trào trồng sen ở Huế đã được đầu tư

và phát triển mạnh Một số địa phương đã chuyển đổi diện tích trồng lúa kém hiệu quả sang trồng sen lấy hạt Do vậy, ngoài việc trồng các giống sen trắng có nguồn gốc lâu năm ở Huế, người dân cũng đã du nhập một số giống sen hồng từ các địa phương khác nhau về trồng ở Huế, đặc biệt là giống Sen Hồng Cao Sản - một giống sen chuyên cho hạt, mang nhiều đặc

2 tính vượt trội về điều kiện sống và cho năng suất cao hơn các giống sen địa phương Việc trồng nhiều loại sen nội nhập ở Huế đã dẫn tới hiện trạng gây lẫn giống, thoái hóa giống và có nguy cơ làm giảm đi số lượng các giống sen bản địa, quý hiếm ở Huế

Cây sen đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống như trang trí nghệ thuật, hoa cảnh, văn hóa tâm linh, ẩm thực và y học…Nhiều nghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy các bộ phận khác nhau của cây sen có thể được sử dụng làm món ăn và vị thuốc có giá trị trong y học cổ truyền do có chứa nhiều hợp chất có bản chất là alkaloid và flavonoid với nhiều hoạt tính dược lý như chống viêm, chống mất trí nhớ, chống oxy hóa và hoạt tính ức chế khối u, có tác dụng trong việc cải thiện sức khỏe của con người Vì thế, việc nghiên cứu sự sai khác di truyền giữa các mẫu sen trồng tại Huế dựa trên một số vùng gene chỉ thị, tuyển chọn giống có sự khác biệt di truyền về kiểu gene đặc trưng để đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất tách chiết từ hạt sen của giống sen được tuyển chọn là việc làm rất cần

thiết Xuất phát từ cở sở khoa học nêu trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

sự khác biệt trình tự nucleotide của các vùng gene chỉ thị ở các mẫu sen trồng tại Huế và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách

từ hạt sen” Nghiên cứu này sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu về cấp độ phân tử của

một số vùng gene chỉ thị, thiết lập mối quan hệ di truyền ở các mẫu sen khác nhau trồng tại Huế, cung cấp dữ liệu khoa học liên quan đến hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen của giống sen địa phương

2 Mục tiêu của đề tài

2.1 Mục tiêu chung

Nghiên cứu sự khác biệt di truyền giữa các mẫu sen trồng tại Huế dựa trên một số vùng gene chỉ thị và khảo sát hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ hạt sen giống sen địa phương

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Cung cấp dữ liệu khoa học về sự khác biệt trình tự các nucleotide của các vùng gene chỉ thị thu được từ các mẫu sen trồng ở các địa điểm khác nhau tại Huế, ký gửi dữ liệu và được cấp mã số trên GenBank

3

- Đánh giá việc ứng dụng một số vùng gene chỉ thị của hệ gene nhân và hệ gene lục lạp trong nghiên cứu phát hiện sự khác biệt trình tự các nucleotide của các vùng gene thu được từ các mẫu sen trồng ở các địa điểm khác nhau tại Huế Khảo sát qui luật khác biệt, thiết lập mối quan hệ phát sinh dựa trên các vùng gene chỉ thị có sự sai khác nucleotide giữa một số mẫu sen trồng ở Huế, làm cơ sở khoa học cho việc tuyển chọn giống khác biệt đặc trưng để nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học

- Nghiên cứu phân lập các hợp chất tinh khiết và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất tách chiết từ hạt sen của giống sen khác biệt đặc trưng được tuyển chọn, tạo tiền đề cho việc khai thác và sử dụng bền vững giống sen này tại Huế

3 Những đóng góp mới của đề tài

- Đề tài đã đóng góp một số kết quả mới sau đây:

1 Xây dựng được bộ dữ liệu về sự khác biệt trình tự các nucleotide của

1 vùng gene chỉ thị từ hệ gene nhân và 9 vùng gene chỉ thị từ hệ gene lục lạp của 33 mẫu sen trồng tại các địa điểm khác nhau ở Huế Từ đó đã ký gửi và được cấp mã số truy cập của 330 trình tự nucleotide của 10 vùng gene chỉ thị thu được từ 33 mẫu sen ở Huế trên GenBank

2 Bước đầu phát hiện được qui luật khác biệt trình tự các nucleotide của một số vùng gene chỉ thị giữa 33 mẫu sen trồng tại các địa điểm khác nhau ở Huế, xây dựng được cây quan hệ phát sinh giữa 33 mẫu sen dựa trên các vùng gene chỉ thị có sự sai khác nucleotide, và tuyển chọn được giống Sen Trắng Trẹt Lõm có sự khác biệt đặc trưng về trình tự các nucleotide để nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong hạt sen

3 Bước đầu phân lập được ba hợp chất tinh khiết từ phân đoạn Butanol của hạt Sen Trắng Trẹt Lõm có bản chất alkaloid: nuciferine (C19H21NO2), armepavine (C19H23O3N), và anonaine (C17H15NO2)

n-4 Bước đầu ghi nhận ba hợp chất này có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhưng không thể hiện hoạt tính gây độc lên ba dòng tế bào ung thư MKN7, SK-Mel-2 và KB ở các nồng độ được nghiên cứu

4

4 Cấu trúc lận án

Luận án gồm 139 trang Phần mở đầu 05 trang, kết luận và kiến nghị 02 trang, các công trình đã công bố 01 trang, tài liệu tham khảo 23 trang và phụ lục Nội dung chính của luận án chia làm 03 chương: Chương 1: Tổng quan gồm 44 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu gồm 18 trang

và Chương 3: Kết quả và thảo luận 46 trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phần tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu mới nhất trong và ngoài nước về các vấn đề ứng dụng chỉ thị phân tử vào phân tích đa dạng di truyền,

xác định loài ở thực vật nói chung và ở cây sen (N nucifera) nói riêng Các

nghiên cứu về chiết tách hợp chất từ các bộ phận khác nhau ở cây sen và thử hoạt tính sinh học của chúng

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu cây sen

Nguồn vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu di truyền: Lá của 33 mẫu sen được thu thập ở 33 địa điểm trồng sen khác nhau tại Huế Các mẫu sen được thu thập dựa trên kết quả công bố của Nguyễn Thị Quỳnh Trang và cs (2017) dựa trên đặc điểm hình thái tập đoàn 66 mẫu sen thu tại Huế

Nguyên liệu sử dụng chiết tách hợp chất: Hạt Sen Trắng Trẹt Lõm (ST02) thu tại hồ Tịnh Tâm, phường Thuận Lộc, thành phố Huế

2.1.2 Nguồn vật liệu sử dụng trong sinh học phân tử: Mười cặp mồi

barcode đặc hiệu cho 10 vùng gene chỉ thị DNA được tham khảo từ Dong

và cs (2012), Cuenoud và cs (2002), White và cs (1990)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp sinh học phân tử

2.2.1.1 Chiết tách lục lạp: Lá sen được bảo quản ở 4°C trong bóng tối khoảng 1 đến 2 ngày để loại bỏ tinh bột tồn tại trong mô lá Lục lạp được chiết tách và tinh sạch theo mô tả của Lang và cs (2011)

5 2.2.1.2 Chiết tách DNA từ hệ gene nhân và cpDNA từ lục lạp: Lá sen và lục lạp được sử dụng làm nguyên liệu chiết tách và tinh sạch DNA và cpDNA dựa trên phương pháp CTAB theo mô tả của Doyle (1987)

2.2.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA và cpDNA: Sử dụng phương pháp điện di trên agarose và phương pháp quang phổ trên máy Nanodrop ND1000 (Thermo Scientific)

2.2.1.4 Phản ứng PCR: Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt (MJ - MiniTM Persanol Thermal Cycle, Bio - Rad) theo chu trình nhiệt như sau: biến tính sợi đôi DNA/cpDNA ở 95oC/5 phút, tiếp đến là 30 chu kỳ:

2.2.1.7 Phương pháp tinh sạch plasmid:

DNA plasmid tái tổ hợp tinh sạch từ các dòng khuẩn lạc dương tính bằng kít EZ-10 Spin Column Plasmid ADN Minipreps kit, BS6141 (BioBase) 2.2.1.8 Phương pháp giải trình tự gene: Các gene mục tiêu được tiến hành giải trình tự dựa trên phương pháp Sanger trên hệ thống phân tích ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer

2.2.1.9 Phương pháp phân tích đa dạng di truyền: Các trình tự nucleotide được

sắp xếp dựa trên chương trình Clustals và hiệu chỉnh bằng phần mềm BioEdit

7.0.5 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA X trên phương pháp Maximum Like hood (ML) Trình tự nucleotide của các vùng gene được so sánh với các trình tự nucleotide được công bố trên GenBank bằng chương trình BLAST Phân tích đa hình DNA dựa trên các thông số bao gồm số lượng vị trí đa hình (S), tổng số đột biến (Eta), số lượng các kiểu đơn bội (h), đa dạng các kiểu đơn bội (Hd), số lượng các nucleotide khác biệt trung bình (k), đa dạng nucleotide (π), số lượng sự kiện tối thiểu để xảy ra quá trình tái tổ hợp (Rm) Tính trung lập được kiểm tra dựa trên 5 phương pháp bao gồm

6 Tajima’s D test, Fs, Fu’s statistic; S, Strobeck’s statistic; D * and F *, Fu and Li’s statistics dựa trên phần mềm DNASP 6.0 Thống kê phân hóa dân số FSTđược ước tính bằng cách sử dụng phương pháp của Hudson và cs (1992)

2.2.2 Phương pháp chiết tách hoạt chất và thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.2.2.1 Phương pháp thu cao phân đoạn: Xử lý mẫu, chiết mẫu bằng ethanol 70%, ngâm lạnh ở môi trường acid, chiết thu phân đoạn bằng các dung môi

có độ phân cực ethylacetate, n-Butanol Từ phân đoạn n-Bu của hạt Sen Trắng Trẹt Lõm (ST02) được thực hiện chiết tách và phân lập hợp chất bằng sắc ký cổ điển cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck) 2.2.2.2 Phương pháp xác định độ tinh khiết và cấu trúc hoạt chất

a Phương pháp sắc ký lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng các hợp chất phân lập được thực hiện theo mô tả của Bela và Khale (2011)

b Phương pháp phân tích phổ HPLC-MS/MS: Phân tích phổ khối lượng MS/MS trên hệ thống Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer Dữ liệu phổ MS/MS của các hoạt chất được so sánh với dữ liệu phổ chuẩn trên NIST2017 và những công bố liên quan

2.2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

a Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết thô và các hoạt chất tinh khiết được thực hiện bằng phương pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) theo mô tả của Vuong và cs (2013)

b Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro: Các dòng tế bào ung thư được

nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có

bổ sung 10% fetal bovine serum-FBS Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2

c Xác định tính độc tế bào ung thư đối với tế bào nuôi cấy dạng đơn lớp: Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD-Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB, Sigma, Mỹ)

d Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào đối với các dòng tế bào nuôi cấy hỗn dịch (HL-60): Phương pháp sử dụng muối tetrazolium (MTT-(3-(4,5-

7 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) làm thuốc thử trong phép so màu, qua đó đánh giá sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm thực nghiệm được lặp lại

3 lần Các giá trị phân tích có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Tất cả các

phân tích thống kê đều được thực hiện bằng phần mềm SPSS (Version 20)

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả khuếch đại PCR và phân tích trình tự nucleotide một số

vùng gene chỉ thị

Kết quả sản phẩm khuếch đại PCR 10 vùng gene chỉ thị thể hiện trên điện di

đồ ở hình 3.1 cho thấy tất cả các mẫu sen sử dụng nghiên cứu đều cho tỷ lệ khuếch đại PCR 100%, băng DNA rõ nét, có nồng độ cao đảm bảo chất lượng làm nguyên liệu thực hiện các thí nghiệm tiếp theo (hình 3.1)

Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm PCR M1: Kích thước thang chuẩn DNA;

Hình A-K lần lượt là kết quả PCR các vùng gene chỉ thị DNA ITS4-5, rbcL, matK, trnH-psbA, accD-psaI, ndhA, psbE-petL, Rpl32-trnL, trnW-psaJ và trnS GCU -trnG GCC ; NC: Kết quả PCR đối chứng âm; Giếng 01 đến 11 kết quả

PCR các mẫu sen trắng; Giếng 12 đến 33 kết quả PCR các mẫu sen hồng Kích thước của 10 vùng gene chỉ thị thu được đối với 33 mẫu sen dao

động từ 350 bp đến 1667 bp Trong đó vùng gene ITS4-5 và trnH-psbA thu

được kích thước nucleotide có sự khác biệt giữa các mẫu sen, dao động từ

8 Trình tự nucleotide của mỗi một vùng gene chỉ thị DNA thu được từ 33 mẫu sen so với trình tự nucleotide công bố ở GenBank cho kết quả tương

đồng cao với loài sen N nucifera (Mã số: FJ599761.1 và KF009944.1),

mức độ tương đồng dao động từ 96,89-100% và độ bao phủ vùng gene đạt 98-100% Trình tự nucleotide của 10 vùng gene chỉ thị DNA thu được từ

33 mẫu sen được ký gửi ở GenBank với các mã số tham chiếu lần lượt là

ITS4-5 (MT903421-MT903453), rbcL (MN011708-MN068956), matK (MN011719-MN068978), trnH-psbA (MN011730-MN086252), accD-psaI (MN086253-MN086285), psbE-petL (MT901764-MT901796), Rpl32-trnL (MT901731-MT901763), trnW-psaJ (MT905225-MT905257), trnS GCU - trnG GCC (MT905258-MT905290) và ndhA (MZ611976 -MZ612008)

3.2 Kết quả phân tích đặc tính di truyền một số mẫu sen trồng tại Huế

dựa trên 10 vùng gene chỉ thị

3.2.1 Kết quả phân tích đặc tính phân tử 10 vùng gene chỉ thị thu được

từ một số mẫu sen trồng tại Huế

Vùng gene ITS4-5 thu được từ 33 mẫu sen khác nhau cho thấy Cystein

(C) chiếm tỷ lệ cao nhất (trung bình = 30,538%) và thấp nhất là Timin (Uracin) (trung bình = 20,521%), tỷ lệ % (G+C) giữa các mẫu sen đạt trung bình 55,111% Các vùng gene chỉ thị lục lạp, nucleotide loại A chiếm tỷ lệ

cao nhất đối với các vùng gene rbcL, trnH-psbA và psbE-petL, trung bình lần lượt là 28,802%, 45,980% và 33,413% Timin (Uracil) chiếm tỷ lệ cao nhất đối với các vùng gene còn lại như matK, accD-psaI, ndhA, Rpl32-trnL, trnW-psaJ, trnS GCU -trnG GCC , trung bình thu được lần lượt là 34,612%, 34,724%, 34,922%, 35,072%, 33,396% và 35,137%. Tỷ lệ % (G+C) ở mỗi

vùng gene chỉ thị lục lạp đạt trung bình dao động từ 24,121% (trnH-psbA) đến 43,476% (rbcL) và tỷ lệ này đối với các vùng gene accD-psaI, ndhA, psbE-petL và Rpl32-trnL không có sự sai khác giữa các mẫu sen (bảng 3.1)

3.2.2 Kết quả phân tích đặc tính di truyền 10 vùng gene chỉ thị thu được

từ một số mẫu sen trồng tại Huế

9

Bảng 3.1 Kết quả phân tích đặc tính phân tử và đặc tính di truyền 10

vùng gene chỉ thị thu được từ một số mẫu sen trồng tại Huế

thước

(bp)

Số lượng vị trí nucleotide đơn hình

S Eta Tỷ lệ % vị trí

nucleotide đa hình

Trung bình

Ghi chú: S: Số lượng vị trí nucleotide biến đổi; Eta: tổng số đột biến nucleotide

Kết quả phân tích trình tự nucleotide cho thấy có năm vị trí nucleotide

đa hình (S) được tìm thấy trong vùng gene ITS4-5 giữa 33 mẫu sen, chiếm

tỷ lệ 2,688% và một trình tự nucleotide khuyết từ vị trí 133 đến 147 gồm có

15 nucleotide ACGTCCAGCATTCCA (hình 3.2 và bảng 3.1) Số lượng các nucleotide khác biệt trung k = 2,688, tương ứng với hệ số đa dạng nucleotide π = 3,140 x10-3

(bảng 3.1 và bảng 3.2)

Hình 3.2 Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide vùng gene

chỉ thị ITS4-5 giữa một số mẫu sen

Vùng gene ITS4-5 có chứa 5 vị trí đột biến (Eta) góp phần phân chia 33

mẫu sen thành 2 kiểu đơn bội khác nhau với hệ số đa dạng các kiểu đơn bội

Hd = 0,458 (bảng 3.1 và bảng 3.2) Các vị trí nucleotide có sự sai khác giữa

10 các mẫu sen trắng và các mẫu sen hồng là: 404 (C-T), 625 (G-A) và 626 (A-G), 408 (G-T) và 576 (C-A) (hình 3.2)

Các vùng gene thuộc hệ gene lục lạp có số lượng các vị trí nucleotide biến đổi trong tổng chiều dài vùng gene thu được ở 33 mẫu sen có sự khác nhau, dao động từ 0 đến 75 vị trí, tương ứng với tỷ lệ % các nucleotide đa hình xuất hiện trên trình tự nucleotide ở các vùng gene dao động từ 0 đến 8,013% (bảng 3.1)

Vùng gene matK có số lượng các vị trí nucleotide biến đổi lớn nhất (75 vị trí),

trong đó có 74 vị trí nucleotide đa hình, chiếm 8,013% (bảng 3.1 và hình 3.3) Kết quả phân tích đặc tính di truyền dựa trên các thông số k, π, S, Eta giữa

33 mẫu sen ở mỗi vùng gene lục lạp có sự khác nhau, dao động từ 0,061 đến 20,563 (k), 0,080 x10-³ đến 21,970 x10-³ (π), 0 đến 75 (S) và 0 đến 76 (Eta)

(bảng 3.1 và bảng 3.2) Vùng gene rbcL cho thấy các thông số này thu được

giá trị thấp nhất (k = 0,061 và π = 0,080 x10-³, S = 1 và Eta = 1), tiếp đến lần

lượt là các vùng gene trnH-psbA (k = 0,117 và π = 0,330 x10-³), Rpl32-trnL (k

= 0,424 và π = 0,340 x10-³), trnS GCU

-trnG GCC (k = 0,504 và π = 0,460 x10-³),

trnW-psaJ (k = 0,511 và π = 0,700 x10-³) và vùng gene matK các giá trị này

thu được cao nhất (k = 20,563 và π = 21,970 x10-³) (bảng 3.1 và bảng 3.2)

Hình 3.3 Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide vùng gene

chỉ thị matK giữa một số mẫu sen trồng tại Huế

11 Các mẫu sen phân chia về các kiểu đơn bội ở mỗi vùng gene chỉ thị dao động từ 1 đến 5 kiểu đơn bội, tương ứng với Hd thu được dao động từ 0

đến 0,822 (bảng 3.2) Trong đó vùng gene matK các giá trị này thu được

đạt cao nhất tương ứng là h = 5, Hd = 0,822 (bảng 3.2) Các vùng gene chỉ

thị lục lạp như rbcL, trnW-psaJ và trnS GCU -trnG GCC có chứa 1 đến 2 vị trí nucleotide biến đổi trong trình tự vùng gene Tỷ lệ % các nucleotide đa hình của các vùng gene lần lượt là 0,135%, 0,137% và 0,182% (bảng 3.1)

Bảng 3.2 Kết quả phân tích đặc điểm di truyền 10 vùng gene và tổ hợp các vùng gene chỉ thị thu đƣợc từ một số mẫu sen trồng tại Huế

Ghi chú: π: Đa dạng nucleotide (cho mỗi vị trí); k: Số lượng nucleotide khác biệt

trung mình; Rm: Số sự kiện tối thiểu xảy ra quá trình tái tổ hợp; h: số lượng các kiểu đơn bội; Hd: hệ số đa dạng các kiểu đơn bội (gene)

Mẫu Sen Hồng Cao Sản SH09 có 7 vị trí nucleotide sai khác trong trình

tự vùng gene Rpl32-trnL so với các mẫu sen còn lại Tỷ lệ % vị trí các

nucleotide đa hình chiếm 0,562% (hình 3.4B và bảng 3.1) Vùng gene

Rpl32-trnL có 7 vị trí đột biến được hình thành với sự phân bố các mẫu sen

về các kiểu đơn bội không giống nhau, xuất hiện kiểu đơn bội chỉ chứa một

12 mẫu Sen Hồng Cao Sản SH09 (bảng 3.1) Kết quả sự sai khác nucleotide ở

trình tự mỗi vùng gene rbcL, trnW-psaJ và trnS GCU

-trnG GCC đã làm cho các mẫu sen có màu sắc hoa khác nhau phân chia về các kiểu đơn bội không rõ

ràng Trong đó vùng gene rbcL xuất hiện kiểu đơn bội có sự khác biệt chỉ

chứa 1 mẫu Sen Trắng Trẹt Lõm ST02 (hình 3.4)

Hình 3.4 Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide các vùng gene

chỉ thị giữa một số mẫu sen trồng tại Huế A: vùng gene rbcL, B: vùng

gene Rpl32-trnL, C: vùng gene trnW-psaJ và D: vùng gene trnS GCU -trnG GCC Vùng gene trnH-psbA với trình tự lặp lại TAAAA có sự khác biệt giữa

các mẫu giống sen từ vị trí 242 đến 300, dao động từ 7 đến 19 lần Trong

đó mẫu giống Sen Trắng Trẹt Lõm (ST02) có 13 lần lặp lại trình tự TAAAA trong vùng gene Số lần lặp lại này không xuất hiện ở các mẫu giống sen khác sử dụng trong nghiên cứu (hình 3.5)

Hình 3.5 Kết quả phân tích và so sánh trình tự nucleotide vùng gene

chỉ thị trnH-psbA giữa một số mẫu sen trồng tại Huế

Sự sai khác về số lượng trình tự lặp lại ATAAA trong vùng gene psbA góp phần phân chia 33 mẫu sen thành 2 kiểu đơn bội khác nhau, và

A B C D