Bg thuc hanh hoa phan tich 2 6809

BÀI 1: KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH PHỔ UV-VIS CỦA DUNG DỊCH KALIPERMANGANAT TRONG MÔI TRƯỜNG ACID Mục tiêu học tập - Ứng dụng định luật Lambert – Beer trong việc định lượng thành phần hoạt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG TOẢN

Đơn vị:

Khoa Dược

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG TOẢN BÀI GIẢNG MƠN HỌC

Tên mơn học: Thực hành Hĩa phân tích 2

(Tên tiếng Anh:……….)

Trình độ: Đại học Dược

Số đơn vị học trình: 01 Giờ thực hành: 30

Thơng tin Giảng viên:

 Tên Giảng viên: VÕ NGỌC HÂN

 Đơn vị: Khoa Dược

 Điện thoại:

 E-mail: vnhan@vttu.edu.vn

NỘI DUNG BÀI GIẢNG

1 Điều kiện tiên quyết

Sinh viên đã học xong mơn học hĩa đại cương vơ cơ, hĩa hữu cơ và hĩa phân tích 1

2 Mục tiêu mơn học

Cung cấp cơ sở lý thuyết của các quá trình phân tích định tính cũng như định lượng bằng phương pháp dụng cụ, hướng dẫn tiến hành những phương pháp phân tích định lượng để sinh viên vận dụng tốt khi làm việc trong những lĩnh vực liên quan đến hĩa phân tích - kiểm nghiệm

3 Phương pháp giảng dạy

Thực hành tại phịng thí nghiệm

4 Đánh giá mơn học

- Bài báo cáo, kiểm tra trên lớp

- Thi thực hành

6 Tài liệu tham khảo

- Bộ Y tế (2012), Hóa phân tích, tập 2, NXB giáo dục

- Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh (2012), Giáo trình Hóa phân tích 2

- Đại học Y Dược Cần Thơ (2012), Giáo trình Hóa phân tích 2

- Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh (2012), Giáo trình Thực tập Hóa

phân tích 2

- Đại học Y Dược Cần Thơ (2012), Giáo trình Thực tập Hóa phân tích 2

5 Đề cương môn học

1 Khảo sát phổ UV – Vis của dung dịch kali permanganat trong

môi trường acid

4

2 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi và pH đến sự hấp thụ của

benzen và phenol trong quang phổ UV – Vis

BÀI 1: KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH PHỔ UV-VIS CỦA

DUNG DỊCH KALIPERMANGANAT TRONG MÔI TRƯỜNG ACID

Mục tiêu học tập

- Ứng dụng định luật Lambert – Beer trong việc định lượng thành phần hoạt

chất dựa vào hệ số hấp thu mol và đường thẳng hồi quy

- Nhận diện máy UV-VIS hai chùm tia Ứng dụng kỹ thuật quét phổ và đo điểm

của máy UV-VIS hai chùm tia

I NGUYÊN TẮC:

- Dựa vào tính năng quét phổ để xác định λmax của KMnO4/H2SO4 0,1N từ 400 – 650 nm

- Đo độ hấp thu của các dung dịch chuẩn tại λmax

- Từ đó tính toán hệ số hấp thu mol của tất cả các dung dịch ở λmax này Áp dụng định luật Lambert – Beer để tính toán nồng độ của mẫu thử

II HÓA CHẤT SỬ DỤNG

- Dung dịch KMnO4 0,1N pha trong H2SO4 0,1N

- Dung dịch H2SO4 0,1N

III TIẾN HÀNH

1 Xây dựng đường cong chuẩn:

- Pha dung dịch trung gian S1 0,01N:

KMnO4 0,1N trong H2SO4 0,1N 10ml

H2SO4 0,1N vđ 100ml

- Từ dung dịch trung gian S1 0,01N pha tiếp các dung dịch chuẩn từ 1-5 như sau:

Cách pha Dung dịch Nồng độ KMnO4 Lấy dung dịch S1 (ml) Thêm H2SO4 0,1N vđ (ml)

- Chọn Method photometry: chỉnh chiều dài sóng về λmax đã tìm được bên trên

- Đọc độ hấp thu (A) tương ứng với 5 nồng độ (C) của 5 dung dịch chuẩn từ 1 –

5 thử nghiệm (cốc đo 1cm, dùng mẫu trắng là H2SO4 0,1N)

- Đọc độ hấp thu (Ax) tương ứng dung dịch thử nghiệm X mà bộ môn pha

Xây dựng đường cong chuẩn độ của A theo C bằng chương trình Excel

IV TÍNH TOÁN KẾT QUẢ

Xác định nồng độ X bằng 2 cách:

- Tính hệ số hấp thu mol và áp dụng công thức định luật Lambert – Beer

- Vẽ đường thẳng hồi quy A=f(C) rồi ngoại suy ra nồng độ chất cần khảo sát

V CÂU HỎI

1 Có thể định lượng KMnO4 trong môi trường trung tính hay kiềm được không? Tại sao?

2 Nêu điều kiện cần và đủ để một chất có hấp thu UV-VIS

3 Nếu tìm dung dịch X có nồng độ ngoài khoảng C1 – C5 được không? Tại sao?

4 Tại sao quét phổ từ 450nm – 650nm mà không phải vùng khác?

BÀI 2: KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI VÀ pH ĐẾN SỰ HẤP THU CỦA BENZEN VÀ PHENOL TRONG PHỔ UV-VIS

Mục tiêu học tập:

- Trình bày được các định nghĩa về nhóm mang màu (chromophore), nhóm trợ

màu (auxochrome), hiệu ứng dịch chuyển sang đỏ (bathochrome), hiệu ứng dịch chuyển sang xanh (hypsochrome), hiệu ứng giảm màu (hypochrome), hiệu ứng tăng màu (hyperchrome)…

- Thực hiện các phép đo quang phổ tử ngoại của một số chất ở các môi trường

khác nhau

I NGUYÊN TẮC:

Phổ điện tử là 1 đường cong trình bày những biến đổi cường độ hấp thu (A) của chất khảo sát theo độ dài song (λ) Dạng phổ phụ thuộc vào bản chất của chất khảo sát, môi trường…

Ví dụ:

- Phổ hấp thu UV-VIS của Benzen thể hiện 3 dãy hấp thu được định tính như sau:

dãy E λmax = 202 nm εM = 7000 M-1cm-1 Chuyển dịch π  π*

dãy B λmax = 254 nm εM = 200 M-1cm-1

- Phổ hấp thu UV-VIS của Phenol sẽ gây ra những hiệu ứng dịch chuyển sang

đỏ hoặc dịch chuyển sang xanh của những dãy này

25 μl Phenol

0,5ml dd bình 2

0,5ml dd bình 3

0,5ml dd bình 3

Điền đến vạch với Cyclo

hexan

Cyclo hexan Nước cất Cyclo

hexan Nước cất NaOH

0,1N Nồng độ (mcg/ml) ? ? ? ? ? ?

*Chú ý: Lấy thể tích μl: bằng micropipet 10-100 μl và 100-1000 μl

- Đo phổ UV-VIS của các dung dịch 1, 2A, 3A, 3B trong khoảng bước sóng từ

200 – 400nm Sau đó nhận xét sự dịch chuyển và các hiệu ứng thể hiện trên phổ

đồ của các dung dịch chứa benzene và phenol trong các dung môi khác nhau như sau:

+ Benzen/cyclohexan (dung dịch 1) + Phenol/cyclohexan (dung dịch 2A) + Phenol/nước ( dung dịch 3A) + Phenol/dung dịch NaOH 0,1N (dung dịch 3B)

IV TRÌNH BÀY KẾT QUẢ:

- Ghi nhận phổ của benzene/cyclohexan từ 200 – 400nm

- Ghi nhận phổ của phenol từ 200 – 400nm trong các dung môi sau:

+ Trong nước

+ Trong cyclohexan

+ Trong dung dịch NaOH 0,1N

- Xác định bước song hấp thu cực đại (λmax) trong các dung dịch đo, nhận xét kết quả

V CÂU HỎI

1 Tên và công thức của các chất khảo sát

2 Phổ UV-VIS của dung dịch 1 và dung dịch 2A thấy có chuyển dịch gì? Giải thích?

3 Phổ UV-VIS của dung dịch 2A và dung dịch 3A, 3B thấy có chuyển dịch gì? Giải thích?

4 Cho biết λmax của các dung dịch 1, 2A, 3A, 3B?

5 Cốc đo sử dụng trong bài thực tập này làm bằng vật liệu gì? Giải thích?

BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI CHẤT MÀU BẰNG

PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-VIS

Mục tiêu học tập

- Thực hiện được việc định lượng đồng thời hai hoạt chất có màu trong dung

dịch bằng áp dụng định luật cộng tính mật độ quang trong phương pháp quang phổ UV-VIS

I NGUYÊN TẮC:

Có thể định lượng đồng thời 2 hoạt chất có màu trong dung dịch bằng cách xác định độ hấp thu của hỗn hợp tại 2 bước sóng khác nhau, tuy nhiên những chất này trong dung dịch phải đáp ứng những yêu cầu sau:

- Phổ hấp thu của 2 chất này chỉ chồng nhau lên từng phần

- Bước sóng được lựa chọn định lượng phải trùng với cực đại hấp thu

- Không có tương tác hóa học giữa 2 chất

- λmax của các chất phân tích phải cách nhau ít nhất 20nm

- Dung dịch (2): 50ml dung dịch KMnO4 4.10-4M trong hỗn hợp 2 acid H2SO4

và H3PO4 0,7M từ dung dịch KMnO4 4.10-3M đã pha sẵn

- Dung dịch (3): hỗn hợp đồng thể tích (1) và (2)

2 Đo quang:

- Chọn chế độ quét phổ: quét phổ UV-VIS từ 400 – 650 nm dung dịch (1) và (2) để tìm λmax1 của dung dịch 1 và λmax2 của dung dịch 2

- Chọn chế độ đo điểm: chỉnh bước sóng về λmax1 và λmax2 đã tìm được ở trên

Đo độ hấp thu của dung dịch 1, 2, 3 tại λmax1 và λmax2

- Xác định hệ số hấp thu mol , , , của dung dịch 1, 2 tại λmax1 và

λmax2 theo định luật Lambert-Beer A=C.ε.l

IV TÍNH TOÁN KẾT QUẢ:

 Như vậy, nồng độ của mỗi chất có thể suy ra từ độ hấp thu đo được dựa theo định luật cộng tính của mật độ quang Thật vậy, người ta có các phương trình:

Trong đó:

- , , , : hệ số hấp thu mol của chất 1 và 2 ở bước sóng λmax1 và

λmax2, được tính theo độ hấp thu của dung dịch có nồng độ đã biết

- , : mật độ quang của hỗn hợp (dung dịch X) được đọc ở 2 độ dài sóng λmax1 và λmax2

- C1, C2: nồng độ mỗi chất trong hỗn hợp (dung dịch X)

 Xác thực định luật cộng tính ở 2 bước sóng này bằng cách dùng giá trị độ hấp thu của hỗn hợp dung dịch ở các thể tích bằng nhau

Bảng 3.1 Xác thực định luật cộng tính của độ hấp thu ở λ1 và λ2

BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG DUNG DỊCH NITRIT BẰNG

QUANG PHỔ KẾ TỬ NGOẠI

Mục tiêu học tập

- Trình bày nguyên tắc của phép đo trong vùng tử ngoại

- Viết được cơ chế phản ứng Diazo hóa

- Thực hiện phản ứng Diazo hóa và tính được kết quả

sulfanilic 0,6 g/l A.sulfanilic 6 g/l 5ml Nước cất vđ 50ml

2 Khảo sát sự biến đổi theo thời gian:

Phải tuân theo thứ tự của thuốc thử thêm vào (nếu HCl thêm vào trước A.sulfanilic thì 1 phần Nitrit có thể bị oxy hóa thành Nitrat và do vậy sẽ không định lượng được)

- Điều chế 1 mẫu chứng (xem phần III, mục c, bình số 8)

- Điều chế mẫu chuẩn độ: trong bình định mức 100ml thêm vào

Nước cất 2 lần 50ml Dung dịch chuẩn độ NaNO2 0,02 g/l 20ml Acid sulfanilic 0,6 g/l 2ml

- Thêm nước cất 2 lần vào bình định mức đến khoảng 90ml tổng thể tích

- Điều chỉnh quang phổ kế đến λ = 270nm (λ này rất gần với sự hấp thu nhóm chức N=N)

- Chuẩn bị cốc đo dày 1cm chứa mẫu chứng và điều chỉnh độ hấp thu Abs = 0 Sau đó, thêm 2ml HCl 4N vào bình định mức 100ml (Phản ứng bắt đầu khởi động từ lúc thêm HCl 4N) Điền nước cất đến vạch 100ml Lắc đều, mở máy

đo lập tức, đọc độ hấp thu trong cốc dày 1cm

- Cứ mỗi phút đọc độ hấp thu 1 lần trong phút đầu tiên, rồi cứ 5 phút đọc 1 lần cho đến khi phản ứng bền (= độ hấp thu không đổi)

- Vẽ đường cong động học trên giấy kẻ ô ly Suy ra thời gian cần thiết để phản ứng bền hoàn toàn

3 Phổ hấp thu:

Mẫu thử: Sau khi thực hiện sự biến đổi của phản ứng theo thời gian (thời gian

mà độ hấp thu đạt đến tối đa), dùng cùng mẫu chứng bên trên để điều chỉnh Abs = 0

IV TÍNH TOÁN KẾT QUẢ

Vẽ đường cong chuẩn độ biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp vào nồng độ Nitrit A=f(C μg/ml), suy ra nồng độ của dung dịch X (μg/ml)

V CÂU HỎI

1 Thứ tự pha chế thuốc thử trong bảng trên không theo đúng được không?

2 Sử dụng phương pháp Time scan với mục đích gì?

3 Ở giai đoạn định lượng dung dịch có nồng độ X, tại sao sau khi bổ sung nước cất vừa đủ thì phải chờ thời gian t bằng tmax vừa xác định mới tiến hành đo độ hấp thu?

BÀI 5: TÁCH VÀ ĐỊNH TÍNH CÁC SULFONAMID

(PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG)

Mục tiêu học tập

- Trình bày nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng

- Thực hiện được các thao tác triển khai sắc ký lớp mỏng

- Giấy bão hòa bình sắc ký

- Chuẩn bị bình khai triển: rửa sạch bình, làm khô và bão hòa dung môi khai triển trong bình

- Đặt bản mỏng vào bình khai triển, những vết này phải được nằm trên mức dung môi trong bình Đậy bình lại và triển khai đến mức khoảng 10cm trên vết chấm, lấy ra và vạch tức khắc đường dung môi

4 Phát hiện

- Để khô bản đã triển khai ngoài không khí, sau đó phun thuốc thử PDAB thấy vết có màu vàng

- Tính Rf của mỗi vết Định danh hỗn hợp và xác định tên của từng vết chấm

IV CÂU HỎI

1 Viết cơ chế tạo màu của Sulfonamid và PDAB

2 Slicagel dùng trong sắc ký lớp mỏng phải là loại Silicagel gì? Thành phần?

BÀI 6: ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL VÀ CAFEIN

TRONG CHẾ PHẨM (PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO)

Mục tiêu học tập

- Hiểu được ý nghĩa của các thong số trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao

- Hiểu được các tính năng của đầu dò dãy diod quang (Photodiode Arry

Detector, PDA), UV-VIS

- Thực hành định lượng được paracetamol và cafein bằng phương pháp HPLC

theo Dược điển Việt Nam IV

I NGUYÊN TẮC:

Hỗn hợp Paracetamol và Cafein trong dược phẩm sau khi chiết có thể tách và định lượng bằng phương pháp HPLC với bộ phận phát hiện UV-VIS (hoặc bộ phận phát hiện PDA) do cấu trúc của 2 hoạt chất này có các nối đôi lien hợp, có các nhóm mang màu

II ĐỐI TƯỢNG, CHẤT ĐỐI CHIẾU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI, TRANG THIẾT BỊ

- Viên nén HAPACOL EXTRA chứa 500mg Paracetamol và 65mg Cafein do công ty cổ phần dược Hậu Giang sản xuất

- Hóa chất, dung môi:

 Acid acetic bang đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck, Đức)

 Methanol đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC (Merck, Đức)

 Nước cất đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC (độ dẫn điện 18MΏ)

- Trang thiết bị:

 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi Chromaster L-5000 (Nhật)

 Cột sắc ký: Cột pha đảo RP18

 Màng lọc Sartorius RC – Vliesverstaerkt 0,45μm (Sartorius, Đức)

 Hệ thống lọc pha động dưới áp suất giảm

III TIẾN HÀNH

1 Chuẩn bị pha động:

Sử dụng ống đong pha 500ml pha động gồm nước-methanol-acid acetic bang (40-36-4), trộn đều, lọc dưới áp suất giảm qua màng lọc 0,45μm Khử khí pha động bằng siêu âm trong 10 phút

2 Chuẩn bị các mẫu đối chiếu và mẫu thử:

- Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc: (Bình 1) (Bộ môn pha)

+ Cân chính xác khoảng 100mg Paracetamol đối chiếu và 13 mg Cafein đối chiếu vào bình định mức 50ml (bình 1) Thêm khoảng 35ml methanol, lắc ký, sau đó đem siêu âm Điền methanol đến vạch Dung dịch thu được có nồng độ Paracetamol là 2000 μg/ml và nồng độ Cafein là 260 μg/ml

- Chuẩn bị dung dịch mẫu đối chiếu để bơm vào máy: (Bình 2)

+ Hút 2ml dung dịch 1 cho vào bình định mức 20ml (bình 2) Điền pha động đến vạch, lắc kỹ Lọc qua màng lọc milipore 0,45μm Dung dịch mẫu đối chiếu bơm vào máy có nồng độ paracetamol là 200 μg/ml và nồng độ Cafein

là 26 μg/ml

- Chuẩn bị dung dịch mẹ của mẫu thử:

+ Cân 20 viên nén Tính khối lượng trung bình của 1 viên Nghiền trộn 20 viên này bằng cối chày cho đến khi thu được một hỗn hợp bột mịn và đồng nhất Cân chính xác khoảng một lượng bột bằng 1/5 khối lượng trung bình một viên nén, cho vào bình định mức 50ml (bình 3), hòa tan với methanol bằng cách lắc kỹ rồi siêu âm trong 10 phút Điền methanol đến vạch Lắc đều + Mẫu thử của bình 3 có nồng độ Paracetamol xấp xỉ 2000 μg/ml trong methanol và nồng độ Cafein xấp xỉ 260 μg/ml trong methanol

- Chuẩn bị dung dịch mẫu thử để bơm vào máy: (bình 4)

+ Lọc bình 3 qua giấy Bỏ khoảng 10-20ml dịch lọc đầu Lấy chính xác 2ml dịch lọc pha loãng trong bình định mức 20ml (bình 4) với pha động Lọc qua màng lọc milipore 0,45μm Mẫu thử của bình 4 có nồng độ paracetamol là

200 μg/ml và nồng độ Cafein xấp xỉ 26 μg/ml

- Hệ thống và điều kiện sắc ký

+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi Chromaster L-5000 (Nhật)

+ Pha động: nước – methanol – acid acetic băng (40:36:4)

+ Phenomenex Lunar RP C18 250 x 4,6 mm, 5 μm

+ Bước sóng phát hiện: 273 nm

+ Tốc độ dòng: 1ml/phút

+ Thể tích tiêm mẫu: 20μl

- Tiến hành sắc ký, đánh giá các thông số sắc ký

+ Lần lượt bơm dung dịch mẫu đối chiếu và mẫu thử Mỗi mẫu 6 lần

+ Ghi lại các thông số sắc ký như thời gian lưu, diện tích đỉnh, chiều cao đỉnh,

hệ số dung lượng, hệ số chọn lọc, số đĩa lý thuyết, độ phân giải, hệ số bất đối của dung dịch mẫu đối chiếu và mẫu thử

+ Xử lý thống kê các giá trị thu được:

Giá trị trung bình:

Độ lệch chuẩn (Standard deviation, SD):

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation, RSD)

Yêu cầu: RSD của các thông số trong cả 2 dung dịch mẫu đối chiếu và mẫu

thử phải nhỏ hơn 2%

 Với PDA detector: xác định các yếu tố sau đây:

+ Sắc ký đồ 2 chiều của Paracetamol và Cafein

+ Sắc ký đồ 2 chiều của Paracetamol và Cafein

+ Phổ UV tương ứng của peak Paracetamol và peak Cafein

+ Sắc ký đồ ứng với λ max cực đại của Paracetamol và Cafein

 Một số lưu ý:

+ Tất cả các dung dịch trước khi đưa vào hệ thống sắc ký đều phải được lọc qua màng lọc 0,45 μm

+ Pha động phải được khử bằng siêu âm trước khi tiến hành sắc ký

+ Trước khi tiến hành phân tích mẫu cần phải cân bằng hệ thống ít nhất 30 phút bằng pha động Giữa các lần tiêm mẫu nên rửa kim bằng methanol + Sau khi phân tích xong phải rửa cột bằng nước cất dùng cho HPLC trong 60’ và sau đó là methanol trong 30’, tốc độ dòng 1ml/phút

+ Cột sắc ký nên được bảo quản trong hỗn hợp dung môi methanol:nước (60:40) hoặc Acetonitril:nước (9:1)

IV TÍNH KẾT QUẢ:

Hàm lượng (mg) hoạt chất trong viên được tính theo công thức sau: