Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp

Trong những năm gần đây việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp phytaza hoạt lực cao cũng như việc nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp cho năng suất cao v

VIỆN CƠ ĐIỆN NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHỆ STH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI:

HOÀN THIỆN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYM PHYTAZA

ĐỂ BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ PHỤC VỤ

MỘT SỐ NGÀNH CÔNG NGHIỆP

CNĐT: NGUYỄN THÙY CHÂU

8115

HÀ NỘI – 2010

cá [3]… Vì vậy cần phải bổ sung những hợp chất chứa photpho vô cơ vào thức

ăn để đáp ứng đủ nhu cầu của chúng Lượng axit phytic và phytat không được tiêu hóa này theo phân của gia cầm thải ra ngoài là nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường và gây ra hiện tượng bùng phát của các vi sinh vật sinh độc tố [18,19]

Chính vì vậy, để tận dụng nguồn phospho có sẵn trong thành phần của các nguyên liệu thực vật, tăng hệ số sử dụng thức ăn của vật nuôi, giảm lượng axit phytic thải ra ngoài môi trường thì việc chuyển các hợp chất phospho ở dạng khó phân hủy này thành các chất đơn giản hơn là rất quan trọng Để đạt được điều đó

người ta sử dụng phytaza để thủy phân axit phytic Phytaza (myo - inositol hexan

photphat photphohydrolaza) là một enzym có khả năng xúc tác phản ứng thủy phân axit phytic (và các muối của axit này), giải phóng ra một hoặc nhiều gốc

photphat vô cơ tự do và myo - inositol phân tử thấp, là các dạng chất dễ tiêu hóa

hơn các hợp chất ban đầu Phytaza cũng như tất cả các enzym khác đều có sẵn trong mô, cơ quan của động, thực vật và tế bào vi sinh vật[29, 38, 39] Tuy nhiên khi nghiên cứu để tách và sản xuất phytaza, đặc biệt là sản xuất với quy mô công nghiệp thì nguồn vi sinh vật là nguồn để sản xuất enzym có ưu thế hơn cả Có

nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp phytaza như Aspegillus niger, Aspegillus ficcum, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Escherrichia coli, Rhizopus microsporus, Saccharomyces serevisie…[15, 37]

Phytaza được phát hiện đầu tiên vào năm 1907, đến năm 1994 thì những

phytaza dưới dạng các chế phẩm dạng bột, hoặc dạng nước dùng bổ sung vào thức ăn gia súc và gia cầm, nhằm tăng hệ số sử dụng thức ăn của vật nuôi khi thêm phytaza vào thức ăn chăn nuôi từ 250IU/kg đến 1000IU/kg có thể thay thế hoàn toàn việc bổ sung photpho Hiệu quả của việc ứng dụng này đã được kiểm định Tại Mỹ, người ta dự tính rằng nếu phytaza được sử dụng trong thức ăn cho tất cả các loài động vật dạ dày đơn thì sẽ giải phóng được một lượng photpho tương ứng với giá trị 168 triệu USD và loại trừ được 8,23x104 tấn photphat thải

ra môi trường hàng năm Ở Hà Lan, phytaza của nấm mốc A niger được bổ sung

vào thức ăn chăn nuôi đã làm giảm ô nhiễm photphat từ 30 đến 40% Vì những tính chất rất ưu việt của phytaza, nên số công trình nghiên cứu về enzym này hàng năm tăng lên rõ rệt Trong những năm gần đây việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp phytaza hoạt lực cao cũng như việc nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp cho năng suất cao và hoàn thiện công nghệ sản xuất đã được các nhà khoa học của rất nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Pháp, Đức…đặc biệt quan tâm

Ở nước ta, việc nghiên cứu về phytaza còn rất mới mẻ và chưa có nơi nào sản xuất enzym phytaza Hàng năm nước ta vẫn phải nhập một lượng lớn phytaza từ các công ty nước ngoài như Novo của Đan Mạch, Roche của Thụy Sĩ Năm 1998, Khoa Chăn nuôi, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành thử nghiệm sản phẩm phytaza dưới tên thương mại là Ronozyme P bổ sung vào khẩu phần thức ăn nuôi lợn giống, lợn thịt và nuôi gà

đẻ tại các trại chăn nuôi Bảo Lộc, Đông Hiệp Kết quả cho thấy Ronozyme P có tác dụng làm tăng khả năng hấp thụ thức ăn của lợn, tăng tỷ lệ đẻ trứng và khối lượng trứng của gà đẻ Tác giả Nguyễn Thị Hoài Trâm [1] cũng đã thông báo về khả năng ứng dụng chế phẩm Ronozyme P do Thuỵ Sĩ sản xuất vào thức ăn chăn nuôi Kết quả chế phẩm này đã làm tăng tỷ lệ đẻ trứng lên 2% và tăng năng suất trứng sau 12 tuần là 1,86-1,99 quả/gà mái Ngoài ra Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam cũng đã nghiên cứu đưa phytaza vào thức ăn cho lợn, gà trong chương trình sản xuất thịt sạch của thành phố Hồ Chí Minh Chính từ những nghiên cứu trên, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã quyết định đưa phytaza vào danh mục các thức ăn chăn nuôi được nhập khẩu vào Việt Nam thời kỳ 2001 - 2005 theo quyết định số 55/2001/QĐ/BNN-KNKL

Trong khuôn khổ của đề tài cấp Nhà nước KC-04-20 phòng Vi sinh vật sau thu hoạch, Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tiến hành nghiên cứu đề tài nhánh: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym phytaza

từ nấm mốc” Hội đồng nghiệm thu đề tài cấp Nhà nước đã có biên bản đề nghị

đề tài nhánh này được chuyển thành dự án sản xuất thử nghiệm

Kết quả của đề tài là đã tuyển chọn được các chủng A niger có hoạt lực

phytaza cao, hoạt lực của các chủng phân lập dao động từ 9 đến 13IU/ml Chúng tôi cũng đã tiến hành nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza theo phương pháp lên men chìm sục khí Kết quả cho thấy phương pháp nuôi cấy lên men chìm sục khí đã cho hoạt lực phytaza là 13,5IU/ml Chế phẩm đã được đánh giá trên lợn,

gà, và bước đầu đã cho những kết quả tốt

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, trong hai năm 2007-2009 Bộ môn Nghiên cứu công nghệ sinh học sau thu hoạch, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch đã được Bộ khoa học công nghệ và môi trường hỗ trợ

dự án: “Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp”

1.2 Xuất xứ của dự án

Là kết quả của đề tài cấp Nhà nước KC-04-20: “Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh hiện đại để sản xuất chế phẩm giàu axit amin và enzim từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp và thủy hải sản ở quy mô bán công nghiệp” được nghiệm thu cấp Nhà nước ngày 18/4/2006 Hội đồng nghiệm thu đề tài đã đề nghị xây dựng

đề tài nhánh “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym phytaza” thành dự án sản xuất thử nghiệm

1.3 Mục tiêu của dự án

™ Có được dây chuyền công nghệ và thiết bị sản xuất chế phẩm phytaza qui mô

50 tấn/năm Hoạt tính phytaza thô hoạt tính đạt 2500IU/g

™ Phát triển sản xuất enzym phytaza dùng trong chăn nuôi và một số ngành công nghiệp khác

1.4 Luận cứ về tính cấp thiết, khả thi và hiệu quả của Dự án

1.4.1 Làm rõ về công nghệ lựa chọn của Dự án

1.4.1.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất phytaza trên thế giới

1.4.1.2 Những nghiên cứu về axit phytic

Axit phytic là một axit hữu cơ, phân tử của nó có chứa các gốc photphat, tồn tại chủ yếu trong các loại ngũ cốc và hạt có dầu Axit phytic có công thức phân tử C6H18O24P6 và phân tử lượng là 660,04 Danh pháp quốc tế của axit

phytic được gọi là myo-inositol 1,2,3,4,5,6 - hexan dihydro photphat Thực tế,

axit phytic thường tồn tại dưới dạng muối của các kim loại hóa trị I, II (thường là kali- magiê- canxi) Các muối này được gọi là phytat và chúng được xem như là kho dự trữ photpho lớn trong các hạt thực vật

Phytaza là một enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic inositol hexan photphat) thành các myo - inositol photphat phân tử thấp và các monophotphat vô cơ Khi phản ứng thủy phân xảy ra hoàn toàn sẽ giải phóng toàn

(myo-bộ các gốc photphat trong phân tử axit phytic và tạo thành các myo - inositol tự do

* Ứng dụng của enzim phytaza trong chăn nuôi

Những điều tra đầu tiên về ứng dụng enzim trong dinh dưỡng động vật đã được thực hiện từ những năm 1920 Tuy nhiên đến năm 1950, ngành công nghiệp sản xuất enzim mới thực sự được bắt đầu Tác giả Cromwell G.L.[ 9] cho rằng trước đây enzim không được sử dụng trong khẩu phần thức ăn gia súc

mà chỉ sử dụng trong thực phẩm cho người nhưng từ giữa thập niên 1990, sản phẩm enzime sử dụng trong công nghiệp chế biến thức ăn gia súc của thế giới đã phát triển mạnh Chúng được sử dụng khá phổ biến ở các nước tiên tiến và được xem như là một chuẩn mực về dinh dưỡng trong khẩu phần ăn gia súc Người ta nhận thấy rằng việc bổ sung enzim vào thức ăn chăn nuôi làm tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng từ thức ăn và làm giảm lượng muối khoáng thừa thải ra trong quá trình chăn nuôi [32] Để có thể thu được những kết quả tốt như vậy, có một số lý

do chính để giải thích như sau:

+ Enzim có khả năng cắt một số liên kết đặc hiệu trong thức ăn chăn nuôi

để giải phóng các muối khoáng và axit amin Việc bổ sung một lượng enzim thích hợp vào thức ăn hàng ngày cho gia súc, gia cầm đã tạo ra các chất dễ tiêu hóa như là glucoza từ các polysacharit

+ Enzim ngoại bào có thể giúp cho các động vật non tiêu hóa tốt hơn Bởi

vì cơ thể chúng sản xuất ra một lượng enzim không đáp ứng đủ nhu cầu của bản thân Chính vì vậy việc bổ sung thêm các enzim đã giúp cho động vật dễ tiêu hóa

và hấp thu được một lượng lớn dinh dưỡng từ thức ăn

+ Một số enzim được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã phân hủy các tác nhân kháng dinh dưỡng trong thức ăn và làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn

Tóm lại, enzim thức ăn đã làm tăng tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và năng suất động vật theo hai cơ chế:

Một là kết hợp với enzim nội sinh phân giải các hợp chất thành những chất

đủ nhỏ để cơ thể hấp thụ Hai là enzim thức ăn phải giảm được độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa thức ăn vì chính độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa cản trở sự hấp thu thức ăn Một vài hợp chất khi giải phóng khỏi vách tế bào đã hình thành các gel làm tăng độ nhớt trong ruột Thường các khẩu phần chứa nhiều polysaccharit không phải tinh bột gây ra hiện tượng này Động vật non đặc biệt là gia cầm rất nhạy cảm với sự biến đổi độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa Vì vậy để khắc phục được hiện tượng trên, trong phương pháp chăn nuôi hiện đại người ta đã bổ sung enzim vào thức ăn chăn nuôi Enzim này có khả năng làm tăng sự hấp thụ và tiêu hóa các thành phần chứa năng lượng và protein của thức ăn, tăng tỷ lệ tăng trọng của đàn gia súc, gia cầm Điều đó sẽ tiết kiệm được chi phí sản xuất giảm giá thành sản phẩm

Một trong số những enzim quan trọng phục vụ cho chăn nuôi là phytaza - enzim có khả năng phân giải axit phytic trong ruột của động vật dạ dày đơn thành phân tử photphat.[26] Trên thế giới có nhiều chế phẩm phytaza để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Điển hình nhất trong số các chế phẩm được thương mại hóa là Natuphos của công ty Gist Brocades- Hà Lan Enzim này được sản xuất bằng cách biểu hiện gen Ngoài ra chế phẩm ZY-phytaza II của công ty Lohman

Animal Health cũng được sản xuất từ chủng A oryzae biến đổi gen

Bên cạnh việc sử dụng từng chế phẩm enzim đơn lẻ thì xu hướng chung hiện nay lại tập trung vào sử dụng các chế phẩm đa enzim (multienzyme) có chứa hỗn hợp enzim để phân giải đồng thời nhiều hợp chất Ví dụ: Nếu dùng β-glucanaza thì chỉ phá vỡ được vách nội nhũ của hạt đại mạch mà không phân

chất Theo tác giả Vũ Duy Giảng [2] để phân giải được protein trong lớp tế bào chất và axit phytic thì cần phải thêm cả phytaza và xellulaza và pentosanaza

Một số chế phẩm thương mại gồm hỗn hợp các enzim được sử dụng trong chăn nuôi nhằm giúp cho gia súc, gia cầm tăng tỷ lệ tăng trọng đang có mặt trên thị trường như: RONOZYME VP, RONOZYME B, RONOZYME A và chế phẩm AQUAZYME, Allzym SSF của Mỹ Các chế phẩm này ngoài thành phần chính là phytaza còn có các enzym khác như amylaza, pectinaza… đã giúp tăng cường khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng, khoáng chất và vitamin trong thức

ăn gia cầm, gia súc… Trong đó, chế phẩm Allzym SSF của công ty Altech được

tạo ra khi lên men chủng nấm mốc A niger tự nhiên ở cơ chất rắn trên môi

trường cám mỳ ngoài enzim phytaza chủ yếu ra còn có 6 enzim khác như: amylaza, xelulaza, xylanaza, β-glucanaza, pectinaza và proteaza cũng được tạo

ra từ chính chủng nấm mốc trên Điều đó sẽ tiết kiệm được chi phí sản xuất

Vào cuối thế kỷ XX ngành chế biến đậu tương đã mở rộng thành công trên thị trường Theo tác giả O’Quinn [23] đậu tương và các loại ngũ cốc đã được tăng cường sử dụng làm thức ăn cho động vật nhằm mục đích giảm giá thành bằng cách thay thế một phần protein động vật trong thức ăn bằng protein thực vật Nhưng trong đậu tương có chứa một lượng lớn các axit phytic và các chất kháng dinh dưỡng do đó đã gây hạn chế khi sử dụng chúng làm thức ăn chăn nuôi

Đối với động vật nhai lại, sự có mặt phytaza trong hệ enzim tiêu hoá do các vi sinh vật trong dạ cỏ và ruột kết của chúng sinh ra có khả năng giải phóng photpho vô cơ từ axit phytic Tuy nhiên, đối với các loài động vật có dạ dày đơn như gia cầm, lợn và cá sản xuất rất ít hoặc không có mặt phytaza trong hệ tiêu hoá thì chúng không có khả năng chuyển hoá axit phytic Vì vậy, photphat vô cơ

đã được bổ sung vào khẩu phần ăn hàng ngày của các động vật này để đảm bảo lượng photpho cần thiết Hậu quả đã dẫn đến việc ô nhiễm photpho ở những nơi chăn nuôi gia cầm và lợn.[11]

Việc sử dụng chế phẩm phytaza để bổ sung vào khẩu phần thức ăn cho vật nuôi không những cho phép các vật nuôi đồng hoá tốt thành phần photpho sẵn có trong thức ăn, tăng sự hấp thu protein và các nguyên tố khoáng mà còn giảm được sự ô nhiễm môi trường, do hạn chế được lượng photphat khó tiêu

được thải ra theo phân của động vật (Leesen et al [14] Lei và Stahl [15],

Mohanna và Nys [17] Phytaza có khả năng thuỷ phân phytat và khi thêm phytaza vào thức ăn chăn nuôi từ 250IU/kg đến 1000IU/kg có thể thay thế hoàn toàn việc bổ sung photpho Hiệu quả của việc ứng dụng này đã được kiểm định Tại Mỹ, người ta dự tính rằng nếu phytaza được sử dụng trong thức ăn cho tất cả các loài động vật dạ dày đơn thì sẽ giải phóng được một lượng photpho tương ứng với giá trị 168 triệu USD và loại trừ được 8,23x104 tấn photphat thải ra môi trường hàng năm.[11]

Phytaza Finase R được bổ sung vào thức ăn có chứa đậu tương cho lợn đã chuyển hoá được một phần ba dạng phosphat không có giá trị thành dạng dễ sử dụng Cũng bằng cách như vậy, các thực nghiệm với enzim phytaza R và Natuphos đã chứng minh rằng phytaza cải thiện được khả năng chuyển hoá

phytat của lợn và gà (Cromwell et al 1993, Cromwell et al [11] Cromwell et al 1995b[11], O’Quinn et al [22] Ở Hà Lan, phytaza của nấm mốc A niger được

bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã làm giảm ô nhiễm photphat từ 30 đến 40% Việc sử dụng phytaza trong chăn nuôi cần đòi hỏi một số tính chất như là enzim phải chịu được nhiệt độ cao, bởi vì thức ăn cho gia cầm và lợn hầu hết ở dạng viên để đảm bảo rằng động vật có một khẩu phần ăn cân bằng và thuận lợi cho quá trình bảo quản các sản phẩm có chứa enzim trong công nghiệp thức ăn chăn nuôi Theo Wyss [43], trong suốt quá trình chế biến viên nhiệt độ có thể lên đến

90 0C và đó là nguyên nhân giảm hoạt tính của enzim trong quá trình bảo quản Chi phí sử dụng phytaza bổ sung vào thức ăn chăn nuôi sẽ giảm đi nếu như tính

chịu nhiệt của enzim tăng lên trong quá trình chế biến thức ăn từ thực vật

Để ứng dụng phytaza vào chăn nuôi ở mức độ công nghiệp, đặc tính quan trọng nhất của phytaza cần được quan tâm là khả năng hoạt động của nó ở phạm

vi pH thường thấy trong hệ tiêu hoá Đột biến trực tiếp vị trí đã xác nhận rằng

việc thay đổi Gly-277 và Tyr 282 của phytaza tự nhiên từ chủng nấm mốc A fumigatus bằng gốc Lys và His đúng với phytaza của nấm A niger đã làm tăng

pH hoạt động của nó từ 2,8 lên 3,4 Hơn thế nữa đột biến gốc Arg-274 thành

Gln và Gln 27 thành Leu/Thr/Ile của phytaza A niger T213 và A fumigatus đã

lần lượt làm tăng tính đặc hiệu của chúng lên nhiều lần.[27]

Việc sử dụng chế phẩm enzim phytaza bổ sung vào thức ăn cho chăn nuôi ngày càng được tăng cường, bởi vì qua các nghiên cứu đã cho thấy rằng việc bổ sung chế phẩm sinh học nói chung và chế phẩm enzim nói riêng vào thức

ăn cho gia súc, gia cầm đã đưa sản lượng lên rất cao với giá thành hạ Những nghiên cứu cho thấy bổ sung tối ưu 227 đơn vị phytaza trên pound thức ăn (1 pound = 0,454 kg) đã thay thế khoảng 0,1% lượng photpho trong bột ngô, đậu tương Ronozym P = 2500 FYT/g và cho vào 0,4 lb/tấn thức ăn (225 g/tấn thức ăn)

Những năm gần đây, ngành chăn nuôi của Việt Nam đã có nhiều tiến bộ đáng kể Cùng với việc nghiên cứu lai tạo giống và hoàn thiện các quy trình chăm sóc nuôi dưỡng thì khâu chế biến thức ăn cho chúng cũng là một nhân tố quyết định đến hiệu quả trong chăn nuôi Chính vì vậy, người ta đã sử dụng chế phẩm enzim để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm tăng khả năng chuyển hoá thức ăn của chúng

Xuất phát từ những lợi ích mà phytaza có thể mang lại cho con người đã khiến cho có ngày càng nhiều những ứng dụng của loại enzim này ở các lĩnh vực khác nhau Người ta đã không ngừng nghiên cứu nhằm mục đích nâng cao tính chất ưu việt của phytaza để những ứng dụng của chúng đạt hiệu quả hơn

1.4.1.3 Ứng dụng trong sản xuất thực phẩm

Trong khẩu phần ăn hàng ngày của con người cũng rất giàu hàm lượng ngũ cốc đồng nghĩa với lượng phytat trong thức ăn rất cao Đặc biệt khẩu phần thức ăn của những người ăn chay, những người lớn tuổi và người dân ở những nước nghèo luôn bị ám ảnh bởi sự mất cân bằng thực phẩm với một lượng ngũ cốc quá cao Trong khẩu phần ăn của trẻ em cũng được sử dụng rất nhiều đậu tương, loại thức ăn này có hàm lượng phytat cao khiến cho trẻ rất khó hấp thu tốt nguồn dinh dưỡng sẵn có trong thức ăn ở trẻ con, phytat không được tiêu hoá có mặt trong ruột đã ngăn cản sự hấp thu các ion kim loại như Zn2+, Ca2+, Mg2+,

Fe2+, ngoài ra nó còn kìm hãm protein cũng như các enzim tiêu hoá

Đứng trước một thực tế như vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng phytaza vào thức ăn cho người nhằm trợ giúp bộ máy tiêu hoá của con người trong quá trình đồng hoá các thức ăn chứa nhiều phytat cũng đã được đề cập đến Bên cạnh đó việc bổ sung phytaza vào thức ăn đã làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm

có nguồn gốc từ thực vật bằng cách làm tăng sự tiêu hoá của protein và khả năng hấp thụ các vitamin trong quá trình thuỷ phân phytat khi tiêu thụ hoặc chế biến thức ăn [35]

Ngoài những ứng dụng đã nêu trên, công nghiệp thực phẩm cũng quan tâm đến việc sử dụng phytaza một mặt để thúc đẩy sự hấp thu muối khoáng hoặc bằng việc làm giảm phytat có trong thành phần thực phẩm, mặt khác để sản xuất thức ăn chức năng Theo tác giả Sandberg [36] các nấm mốc sử dụng trong lên men sản phẩm truyền thống có khả năng sinh phytaza Tempeh là thức ăn lên

men truyền thống bằng cách nuôi cấy nấm Rhizopus oligosporus trên đậu tương

và chính bản thân chủng nấm mốc này đã sinh phytaza và làm cho sản phẩm đậu tương lên men trở nên dễ tiêu hoá hơn Anno và đtg [3] đã loại bỏ phytat trong sữa đậu nành trước khi sử dụng bằng việc bổ sung phytaza của lúa mỳ của hãng Sigma Phytaza Finase S đã được sử dụng để sản xuất sữa đậu nành không có phytat Phytat trong sữa đậu nành đã được thủy phân thành công bằng việc sử dụng phytaza của lúa mỳ được cố định

Khi sử dụng phytaza ngoại bào từ nấm A ficuum NRRL 3135 cũng đã

tạo ra các sản phẩm không có phytat từ các loại đậu Theo tác giả Han thì 78%

phytat trong bột đậu tương bị mất đi khi cho phytaza của nấm A niger vào sản phẩm Bổ sung photphataza axit dạng thô từ nấm A niger vào đậu tương và ủ vài giờ đã làm giảm đáng kể lượng phytat.Và khi thêm phytaza của nấm mốc A niger vào bột mỳ cũng đã làm tăng khả năng hấp thụ ion trong cơ thể người

[35,36]

Tuy nhiên việc thêm phytaza vào thực phẩm cần phải trải qua nhiều thử nghiệm và chứng minh những tác dụng của nó đối với cơ thể con người, đồng thời cũng phải chứng minh được nó không có nhưng tác dụng phụ có hại cho con người hoặc ảnh hưởng đến vị của thức ăn trước khi nó được chấp nhận như là chất phụ gia thực phẩm

1.4.1.4 Trong sản xuất myo-inositol trisphotphat

Myo-inositol trisphotphat được đề xuất ứng dụng vào dược phẩm nhằm

mục đích giảm những mối nguy hiểm của bệnh tim mạch, sự tạo thành sỏi thận

và một số dạng ung thư [42, 20] Tuy nhiên để tổng hợp các myo-inositol

được thực hiện ở nhiệt độ và áp suất rất cao Từ khi phytaza được phát hiện có hoạt tính thuỷ phân myo-inositol hexan photphat thành các dẫn xuất khác nhau thì việc sản xuất myo-inositol trisphotphat được thực hiện bằng con đường sinh học để tạo ra các sản phẩm có độ tinh khiết cao thay thế cho phương pháp tổng

hợp hoá học (Richardson et al [31], Ohkwa et al [25]

1.4.1.5 Tiềm năng trong nuôi trồng thủy sản

Có rất nhiều nghiên cứu đã hướng dẫn sử dụng đậu tương làm thức ăn cho các loài thuỷ sản như là cho cá hồi Nguồn thức ăn này được sử dụng để thay thế nguồn protein đắt tiền từ cá Tuy nhiên cũng giống như gia cầm và lợn, trong hệ tiêu hoá của cá không có mặt phytaza để sử dụng có hiệu quả axit phytic (hay phytat) có trong thức ăn này, chính điều đó đã dẫn đến một lượng lớn phytat

bị thải ra ngoài theo phân Hơn nữa đây là những loài động vật sống dưới nước

vì vậy lượng photpho thải vào trong nước sẽ làm ô nhiễm nguồn nước gây hậu quả rất nghiêm trọng Bởi vậy việc thêm phytaza vào thức ăn cho cá đã làm giảm lượng phytat thải vào trong nước tới mức cho phép đồng thời đảm bảo giá thành thấp trong ngành công nghiệp nuôi trồng thuỷ sản Đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của phytaza trong thức ăn cho cá có nguồn gốc từ thực vật [33]

Chamberlain [7] đã nghiên cứu và cho rằng việc tiêu thụ hải sản toàn cầu sẽ tăng 35% vào năm 2025 Ngành công nghiệp nuôi trồng thuỷ sản sẽ ngày càng phát triển để đáp ứng nhu cầu về hải sản của toàn thế giới Điều này cho thấy một tiềm năng lớn để mở rộng thị trường phytaza vào sản xuất thức ăn sử dụng cho nuôi trồng thuỷ sản Trong khi hiện nay thị trường chủ yếu của phytaza là sử dụng như chất phụ gia thực phẩm để bổ sung cho thức ăn gia cầm

và lợn

1.4.1.6 Tình hình nghiên cứu, sản xuất phytaza và ứng dụng ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cho đến nay chưa có nơi nào sản xuất enzim phytaza Hàng năm nước ta vẫn phải nhập một lượng lớn phytaza từ các công ty nước ngoài như Novo của Đan Mạch, Roche của Thụy Sĩ Nguồn phế phụ phẩm nông sản của nước ta rất dồi dào là cơ sở thuận lợi cho việc sản xuất enzym này ở trong nước Việc nghiên cứu sản xuất phytaza ở Việt Nam là rất cần thiết nhằm giảm giá thành enzim này

Việc sử dụng enzym chăn nuôi ở nước ta mới chỉ được ứng dụng trong một vài năm gần đây với việc sử dụng các chế phẩm enzim của nước ngoài ở các đơn vị sản xuất lớn như công ty Liên doanh thức ăn gia súc Mỹ, Công ty thức ăn gia súc con cò

Năm 1998, Khoa Chăn nuôi, trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành thử nghiệm sản phẩm phytaza dưới tên thương mại là Ronozyme P bổ sung vào khẩu phần thức ăn nuôi lợn giống, lợn thịt và nuôi gà

đẻ tại các trại chăn nuôi Bảo Lộc, Đông Hiệp Kết quả cho thấy Ronozyme P có tác dụng làm tăng khả năng hấp thụ thức ăn của lợn, tăng tỷ lệ đẻ trứng và khối lượng trứng của gà đẻ [2] Tác giả Nguyễn Thị Hoài Trâm [1] cũng đã thông báo

về khả năng ứng dụng chế phẩm Ronozyme P do Thuỵ Sĩ sản xuất vào thức ăn chăn nuôi Kết quả chế phẩm này đã làm tăng tỷ lệ đẻ trứng lên 2% và tăng năng suất trứng sau 12 tuần là 1,86-1,99 quả/gà mái Ngoài ra Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam cũng đã nghiên cứu đưa phytaza vào thức ăn cho lợn, gà trong chương trình sản xuất thịt sạch của thành phố Hồ Chí Minh Chính từ những nghiên cứu trên, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã quyết định đưa phytaza vào danh mục các thức ăn chăn nuôi được nhập khẩu vào Việt Nam thời kỳ 2001 - 2005 theo quyết định số 55/2001/QĐ/BNN-KNKL

Trong khuôn khổ của đề tài cấp Nhà nước KC-04-20 phòng Vi sinh vật sau thu hoạch, Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tiến hành nghiên cứu đề tài nhánh: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym phytaza

từ nấm mốc” Hội đồng nghiệm thu đề tài cấp Nhà nước đã có biên bản đề nghị

đề tài nhánh này được chuyển thành dự án sản xuất thử nghiệm

Kết quả của đề tài là đã tuyển chọn được các chủng A niger có hoạt lực

phytaza cao, hoạt lực của các chủng phân lập dao động từ 9 đến 13IU/ml Chúng tôi cũng đã tiến hành nghiên cứu công nghệ sản xuất phytaza theo phương pháp lên men chìm sục khí Kết quả cho thấy phương pháp lên men chìm sục khí đã cho hoạt lực phytaza là 13,5IU/ml Tuy nhiên phương pháp lên men bề mặt là phương pháp cho sản lượng phytaza cao hơn so với phương pháp lên men chìm sục khí nhưng chưa được nghiên cứu trong khuôn khổ của đề tài câp Nhà nước KC-04-20 Vì vậy việc nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ sản xuất phytaza

bằng phương pháp lên men bề mặt là rất cần thiết trong khuôn khổ của dự án sản xuất thử nghiệm này

1.4.1.7 Những xu hướng mới trong lên men cơ chất rắn

Các tác giả Ashok Pandey[ 4], Author B Bogar [ 5] đã nghiên cứu và kết luận rằng lên men cơ chất rắn có thể tiến hành trực tiếp với các nguyên liệu rẻ tiền như tinh bột, cellulose, lignin, hemicellulose và chitin đã xử lý hoặc tiền xử

lý Quá trình lên men cơ chất rắn là tương đối đơn giản, ít sử dụng năng lượng và

nó có thể cung cấp vi môi trường đồng nhất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật và các hoạt tính trao đổi chất Hiện nay lên men cơ chất rắn đang được các nhà khoa học hết sức quan tâm và xem như là một sự đổi mới trong nghiên cứu các quá trình lên men sinh học, trước tiên là do lên men cơ chất rắn có nhiều thuận lợi

Các công trình nghiên cứu của các tác giả Ashok Pandey[4], Author B Bogar [ 5] đã có bài viết tổng quan về lên men cơ chất rắn cho sản xuất các enzym công nghiệp Các tác giả này đã kết luận rằng lên men cơ chất rắn giữ vị trí quan trọng trong việc sản xuất các enzym ở qui mô công nghiệp Điều đặc biệt quan tâm trong quá trình này là các sản phẩm lên men thô có thể sử dụng trực tiếp như các nguồn enzym

Author B Bogar B et al [5] đã nghiên cứu sản xuất phytaza bởi 3 loại nấm

bất toàn (A ficuum NRRL 3135, Mucor racemosus NRRL 1994 và Rhizopus oligosporus NRRL 5905) trên 4 thành phần thức ăn gia súc tự nhiên (bột hạt cải,

bột ngô, bột đậu tương, cám mì) đã được lên men bằng phương pháp lên men cơ

chất rắn (solid state fermentation-SSF) làm thức ăn gia súc Chủng A ficuum có

sản lượng cao nhất (15 IU phytaza/g chất khô trên môi trường cám mì Ngoài ra, việc kết hợp giữa cám gạo và tinh bột với (NH4)2SO4 sản lượng phytaza đã nâng lên 25 IU/g chất khô Việc tối ưu hoá môi trường đã được tiến hành để nâng cao

sản lượng phytaza Chủng nấm mốc A ficuum khi lên men trên khay bằng

phương pháp SSF đã tạo ra ngoài enzym phytaza với hoạt tính đạt 20 IU/g còn tạo ra một số enzym khác như: phytaza, phophatase, alpha-amylase và xylanase[27] Author Sarvesh Kumar [6] đã chỉ ra được hoạt tính tối đa của enzym là 41,47 IU/ml ở pH 2.5 và 10,71 IU/ml ở pH 4 Hoạt tính tăng gần 13 lần khi bổ sung phosphate ở dạng KH PO (0,004g/100ml) Hoạt tính enzym giảm từ

451 còn 187IU/kg (58,5%) và từ 287 còn 165IU/kg.Việc bổ sung các ion canxi vào môi trường lên men đã làm tăng hoạt tính phytaza [ 24, 40] Việc tạo cầu nối disulfide ở chủng có gắn gene mangan peroxidase đã làm tăng tính chịu nhiệt của các chủng sinh phytaza [41] Sajidan A et al đã nghiên cứu tách dòng phân tử và

xác định tính chất của 3-phytaza từ vi khuẩn KlebsiellaASR1[34]

Hai chế phẩm phytaza đã được thương mại hoá và sử dụng rộng rãi đó là

Natuphos và Ronozym P Trong đó Natuphos là phytaza từ Aspergillus niger và

là 3-phytaza, có hoạt tính từ pH 6,5 đến 5,5 Ronozym P là phytaza từ

Peniophora lycii và là 6-phytaza của hãng Roche, có hoạt tính tối ưu ở pH 4,5[21] Phytaza ngoại bào sản sinh bởi chủng Aspergillus niger ATCC 9142 có

hoạt tính chịu nhiệt ở 800C hơn 2 phytaza thương mại

Chủng A niger chịu nhiệt được sử dụng cho sản xuất phytaza ngoại bào

trên các phế phụ phẩm nông nghiệp: cám mì, khô đậu tương, khô dừa, khô bông, bột đậu đen bằng công nghệ lên men cơ chất rắn (solid state fermentation phytaza) Hoạt tính cực đại đạt 108IU/g cám mốc khô khi lên men trên khô đậu đũa [16] Trong quá trình lên men, axit phytic được thuỷ phân hoàn toàn đi kèm với sự tăng sinh khối và hoạt tính phytaza trong 7 ngày Trong các hoạt tính bề mặt bổ sung, Trixton X-100 ở liều 0,5% đã làm tăng hoạt tính phytaza 30%

KH2PO4 (10 mg/100g môi trường phế phụ phẩm nông sản) đã làm tăng hoạt tính phytaza pH và nhiệt độ tối ưu của enzym thô là 5,0 ở nhiệt độ 500C Hoạt tính phytaza (86%) còn lại trong dung dịch đệm ở pH 3,5 trong 24 giờ Enzym còn lại 75% hoạt tính của nó khi ủ ở 550C trong 1 giờ Trong sự có mặt của 1 mM K+ và

Zn2+ hoạt tính của enzym còn lại 95% và 55% theo thứ tự Ngoài việc lên men cơ chất rắn không đòi hỏi yêu cầu trang thiết bị đắt tiền và có thể tận dụng được các phế phụ phẩm nông nghiệp, thì các tác giả Park, J.S , Lachman M.D., Carter SD [28] còn thấy rằng phytaza được sản xuất bằng lên men cơ chất rắn đã nâng cao hiệu suất phát triển của lợn, sử dụng có hiệu quả lượng photpho trong thức ăn có chứa ngô, đậu tương và giảm lượng photpho thải ra ngoài môi trường

1.4.1.8 Tạo chế phẩm enzym

Tạo chế phẩm enzym là một vấn đề quan trọng sau quá trình lên men sinh tổng hợp enzym Công nghệ sấy phun enzym đã được miêu tả trong một số

của Mỹ số 4617272 của tác giả Kirkwood K Marda và Ưhite Bear, 1986 [13] Hoạt tính enzym, bao gồm cả phytaza được ổn định bằng việc bổ sung một số chất phụ gia như polyalkylene glycols, polyvinylpyrrolidone, polyoxylenethylene, vinylpyrolidone Hỗn hợp enzym và các chất phụ gia được sấy phun ở nhiệt độ xung quanh 550C, hàm ẩm của sản phẩm đạt 5,0%, trong đó nhiệt độ đầu vào ở vòi phun là 140oC và đưa vào buồng phun qua đầu phun quay vòng Bên cạnh đó trong patent quốc tế WO 2006056469, công nghệ tạo chế phẩm phytaza lại được thực hiện bằng cách trộn dịch lỏng chứa enzym với protein đơn bào (nấm men) và sấy phun hoặc ép đùn ở áp suất thấp[12]

1.4.1.9 Lợi ích kinh tế, khả năng thị trường và cạnh tranh của sản phẩm Dự

án

Các nguyên liệu chính cho sản xuất phytaza là các phế phụ phẩm nông nghiệp như cám gạo, cám mì, bột ngô Ở Việt Nam, những nguyên liệu này rất dồi dào và có giá rất rẻ Giá nhân công ở Việt Nam là rất thấp so với các nước phát triển như Thụy Sĩ, Đan Mạch… mặt khác do sản xuất trong nước nên sẽ giảm chi phí vận chuyển hơn so với sản phẩm cùng loại phải nhập từ nước ngoài

Vì vậy, theo tính toán của chúng tôi enzim phytaza thô dùng trong chăn nuôi do

dự án sản xuất sẽ có giá khoảng 60.000 đồng/kg, trong khi đó giá phytaza Ronozym của hãng Novozymes hiện bán trên thị trường Việt nam có giá 72000đ vì vậy giá enzim phytaza thô của dự án có khả năng cạnh tranh với enzim phytaza dùng trong chăn nuôi ngoại nhập

Những điều kiện trên đây là cơ sở quan trọng cho việc triển khai sản xuất thử và tiến tới sản xuất qui mô công nghiệp enzim phytaza để cung cấp cho chăn nuôi và các ngành công nghiệp khác và dự án là hoàn toàn có tính khả thi

Ở nước ta nhu cầu thức ăn gia súc trong những năm qua là 8 triệu tấn/năm, vậy lượng chế phẩm enzim cần bổ sung vào thức ăn chăn nuôi là 160 nghìn tấn/năm (với liều là 200g/ 1tấn thức ăn) Riêng nhu cầu sử dụng enzim phytaza trong thức ăn chăn nuôi ước khoảng 500 tấn mỗi năm nhưng enzim này đang phải nhập toàn bộ từ nước ngoài Chính vì vậy, để đáp ứng được nhu cầu phytaza

bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nói trên thì dự án cần được mở rộng ra gấp nhiều lần

* Chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm phytaza nước ngoài

- Tên sản phẩm: Ronozym của hãng Novozymes hiện bán trên thị trường Việt

Vi sinh vật tổng số, CFU/g không vượt quá 5.104 4,5 x 104

1.4.1.10 Tác động của kết quả Dự án đến kinh tế-xã hội, an ninh, quốc

1.5 Nội dung của dự án

1 Xác định tính chất của enzym phytaza của tập đoàn vi sinh vật sinh enzym do

đề tài chọn tạo và sưu tập

- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus niger ATCC 9142 (pH tối

ưu, khả năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)

- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus ficcuum NRRL 3135 (pH

tối ưu, khả năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)

- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus niger MP2 (pH tối ưu, khả

năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)

- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus niger NCIM 563 (pH tối

ưu, khả năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)

- Xác định tính chất của phytaza từ chủng Rhizopus microsporus (pH tối ưu, khả

năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)

2 Hoàn thiện qui trình nhân giống cho sản xuất phytaza qui mô 1000l/mẻ

3 Hoàn thiện qui trình lên men cơ chất rắn sản xuất phytaza qui mô 1,4 tấn/mẻ (50 tấn/năm)

- Kỹ thuật khử trùng phòng nuôi cấy bề mặt bằng hóa chất

- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dịch khoáng đến khả năng sinh phytaza

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất cảm ứng đến khả năng sinh phytaza

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số nguồn cơ chất khác nhau đến quá trình lên men cơ chất rắn thu nhận phytaza

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh phytaza

- Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh phytaza

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến khả năng sinh phytaza

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh phytaza

- Tối ưu hóa quá trình sinh tổng hợp phytaza bằng phương pháp lên men cơ chất rắn

4 Hoàn thiện qui trình công nghệ tách chiết phytaza dạng thô 1,4 tấn/mẻ (50 tấn/năm)

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các dung dịch đệm đến khả năng chiết enzym

- Xây dựng quy trình tách chiết phytaza từ cơ chất lên men

5 Hoàn thiện qui trình công nghệ tạo chế phẩm phytaza dạng bột

- Nghiên cứu tuyển chọn các chất phụ gia thích hợp để tạo chế phẩm

- Nghiên cứu ổn định hoạt tính của enzym

- Nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của enzym

- Nghiên cứu tạo chế phẩm bằng sấy phun

- Nghiên cứu tạo chế phẩm bằng ép đùn

6 Đánh giá chất lượng phytase do dự án sản xuất được( hoạt tính enzym, độ ổn định của enzym)

7 Sản xuất thử phytaza thô qui mô 50 tấn/năm

8 Đánh giá hiệu quả sử dụng enzim phytaza sản xuất được trên lợn, gà

- Đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm phytaza trên lợn

- Đánh giá hiệu quả sử dụng chế phẩm phytaza trên gà

9 Đào tạo cán bộ và công nhân kỹ thuật để nắm vững thành thạo qui trình tạo chủng giống có hoạt lực cao và qui trình sản xuất enzim phytaza ở qui mô 50 tấn/năm

10 Tập huấn cho nông dân và các cơ sở chăn nuôi biết sử dụng enzim phytaza vào chăn nuôi một số gia súc, gia cầm như lợn, gà

II NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC HIỆN

2.1 Mô tả công nghệ, sơ đồ quy trình công nghệ (là xuất xứ của Dự án) để triển khai trong Dự án

QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ NHÂN GIỐNG ĐỂ SẢN XUẤT ENZIM

PHYTAZA

Chủng A niger giữ giống trên ống

thạch nghiêng

Nhân giống trên bình tam giác nuôi cấy lắc

ở vận tốc 200 v/phút trong 20 giờ trên môi

trường PDA, nhiệt độ 300C

Nhân giống trên hệ thống lên men 100l/mẻ trong 20 giờ trên môi trường PDA, pH=5,5, nhiệt độ 300C, vận tốc cánh khuấy 200V/phút,

DO=90%

Lên men trên hệ thống lên men 1000 l/mẻ trong 24 giờ trên môi trường PDA pH=5.5, nhiệt độ 300C, vận tốc cánh khuấy 200V/phút,

DO=90%

QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN BỀ MẶT VÀ TẠO CHẾ PHẨM

PHYTAZA THÔ Ở QUY MÔ CÔNG NGHIỆP

Giống A niger đã được nhân giống trên

hệ thống lên men chìm sục khí 1000

lit/mẻ trong 48 giờ

Lọc thu dịch nổi chứa hỗn hợp enzym

Cô đặc enzym bằng thiết bị lọc luân

hồi qui mô 1000 l/ mẻ

Phối trộn để ổn định và bảo quản hỗn hợp enzym

Sấy phun hoặc sấy chân

2.2 Phân tích những vấn đề mà Dự án cần giải quyết về công nghệ

Để sản xuất enzim phytaza, trong khuôn khổ của đề tài KC- 04-20 chúng

tôi đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng A niger có khả năng sinh tổng

hợp phytaza Tuy nhiên hoạt lực của các chủng tự nhiên còn chưa ổn định và có

xu hướng giảm đi trong quá trình bảo quản, vì vậy chưa đáp ứng cho nhu cầu sản xuất enzim phytaza ở qui mô công nghiệp cho các cơ sở sản xuất

Chúng tôi cũng đã nghiên cứu công nghệ lên men chìm sục khí và thu hồi phytaza bằng thiết bị li tâm liên tục và kết tủa enzim bằng sunfat amon để sản xuất phytaza ở qui mô 1000 lít/ mẻ Nhưng qui mô này còn nhỏ, giá thành sản phẩm còn cao và công nghệ tạo chế phẩm phytaza ở dạng bột mới chỉ giữ được hoạt tính enzim trong thời gian từ 3 đến 6 tháng cho nên chưa đáp ứng được nhu cầu sử dụng phytaza trong chăn nuôi của nước ta

Để có thể tận dụng được nguồn nguyên liệu là phế phụ phẩm nông nghiệp như là cám gạo, bột ngô… phương pháp lên men bề mặt (lên men cơ chất rắn) sản xuất phytaza được sử dụng trong dự án này

* Những vấn đề cần hoàn thiện trong khuôn khổ của dự án sản xuất thử

+Về chủng giống

Để có được bộ chủng giống A niger có hoạt tính cao và ổn định phục vụ

cho sản xuất enzim phytaza ở quy mô công nghiệp, chúng tôi thấy cần tiếp tục

tuyển chọn các chủng A niger có hoạt tính phytaza cao, có khẳ năng chịu nhiệt

cao và có độ ổn định cao để có thể sản xuất phytaza ở mức độ thương mại

+Về công nghệ lên men

Để sản xuất phytaza ở lượng lớn phục vụ sản xuất, chúng tôi thấy cần hoàn thiện công nghệ lên men bề mặt (lên men cơ chất rắn) cho sản xuất phytaza thô qui mô 120 tấn/năm

+ Về công nghệ thu hồi và tạo chế phẩm

Để có thể sản xuất phytaza ở lượng lớn phục vụ sản xuất, chúng tôi thấy cần nâng cao công suất của hệ thống thu hồi enzim bằng việc sử dụng thiết bị lọc luôn hồi công suất 1000l/ mẻ Đây là thiết bị hiện đại dùng để cô đặc enzim ở qui

mô công nghiệp, vì vậy chúng tôi thấy cần phải đầu tư kinh phí và thời gian để

nắm vững phương pháp sử dụng và rút ra các thông số kỹ thuật cho công nghệ cô đặc enzim bằng hệ thống này

Một vấn đề nữa cần hoàn thiện trong dự án là hoàn thiện công nghệ tạo chế

phẩm phytaza dạng bột nhằm kéo dài thời gian bảo quản trên 1 năm

Việc nghiên cứu các thiết bị thích ứng để cơ giới hóa sản xuất nhằm đáp ứng được sản xuất enzim phytaza ở qui mô sản xuất 12 tấn mẻ (tức là 120 tấn/năm) trở lên là vấn đề rất cần được hoàn thiện trong khuôn khổ của dự án

2.3 Phương pháp

2.3.1 Phương pháp nhân giống chủng A niger DL1 quy mô 1000l/mẻ

Tiến hành theo phương pháp của phòng Công nghệ sinh học sau thu hoạch - Viện Cơ điện NN và Công nghệ STH

¾ Quá trình khử trùng toàn bộ hệ thống lên men

Trước khi khử trùng, toàn bộ tăng lên men và hệ thống ống dẫn khí, dẫn hơi được làm sạch, sau đó đóng chặt nắp tăng và cho hơi dẫn trực tiếp vào tăng Hơi dẫn vào khử trùng tăng phải đảm bảo sạch và áp suất nồi hơi luôn giữ ở 2 atm

áp suất trong tăng khi khử trùng là 1,5 atm, khi bắt đầu dẫn hơi vào tăng thì phải

hé mở tất cả các van để hơi được lưu thông, đồng thời kết hợp khử trùng hệ thống phin lọc khí và hệ thống trục chèn kín với chế độ khử trùng giống khử trùng tăng là 1,5 atm Khi kim đồng hồ trong tăng chỉ 1,5 atm thì bắt đầu tính giờ

và áp suất này được giữ trong suốt thời gian khử trùng là 1 giờ

¾ Quá trình điều chế môi trường

Sau khi kết thúc quá trình khử trùng toàn bộ hệ thống lên men chúng tôi tiến hành bơm nước lạnh vào vỏ áo của tăng lên men để làm nguội môi trường Bơm nước vào tăng và cân đầy đủ các hóa chất trong thành phần môi trường lên men đồng thời bổ sung dầu phá bọt Đóng nắp tăng và mở van dẫn hơi vào vỏ tăng đồng thời bật cánh khuấy với tốc độ là 250 vòng/phút để đảo trộn đều môi trường nuôi cấy Khử trùng môi trường ở 1 atm trong 1 giờ Sau khi khử trùng xong thì ngắt hơi và bơm nước từ bể lạnh để làm nguội môi trường, khi nhiệt độ môi trường trong tăng giảm xuống còn 300C thì tiến hành tiếp giống

¾ Quá trình tiếp giống

Chủng A.niger DL1 nghiên cứu được nhân giống trên máy lắc trên môi

7 %- 10 %

¾ Điều khiển oxy hòa tan, nhiệt độ và pH trong quá trình nhân giống

chủng A.niger ở qui mô 3000l/mẻ

Lượng oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy chìm sục khí được giữ ở nồng độ 90 - 100% tùy vào thời các điểm nuôi cấy Nồng độ oxy hòa tan trong tăng nuôi cấy được điều khiển bằng hệ thống điều khiển oxy hòa tan tự động Nhiệt độ nuôi cấy được điều khiển bằng hệ thống điều khiển nhiệt độ đến nhiệt

độ thích hợp cho chủng A niger pH của môi trường nuôi cấy được điều khiển bằng hệ thống điều khiển pH tự động đến pH 6 thích hợp cho chủng A niger

2.3.2 Các phương pháp khử trùng phòng nuôi cấy bề mặt

- Xông hơi Formon nồng độ 1lít dịch trong phòng lên men bề mặt thể tích 10m3thời gian xông hơi 24h

- Dùng dung dịch Javen nồng độ 8% để lau hoặc phun lên bề mặt phòng nuôi cấy (bao gồm sàn nhà, tường nhà, bề mặt các đồ dùng và trang thiết bị, cửa, …)

- Dùng dung dịch Cloramin B nồng độ 5% (pha 5g bột cloraminB trong 1 lít nước) để lau hoặc phun lên bề mặt bị ô nhiễm (bao gồm sàn nhà, tường nhà, bề mặt các đồ dùng và trang thiết bị, cửa, bồn rửa ) Lượng dung dịch hóa chất phun lên tường cần tính đến sức hấp thụ của tường đó (trong đó từ 150 ml – 300 ml/m2 đối với loại tường đất, 100ml/m2 đối với các loại tường xi măng, tường

gỗ và tường vôi) Dung tích thích hợp đối với sàn nhà là 200 ml – 300 ml/m2 Đối với sàn nhà, trước hết phun/lau từ ngoài vào trong, rồi sau đó từ trong ra ngoài Thời gian tiếp xúc với hóa chất để có tác dụng diệt vi trùng không dưới 60 phút

- Dùng đèn cực tím để khử trùng không khí trong các phòng nuôi cấy bề mặt trong thời gian 24 giờ Đặt bề mặt khử trùng vuông góc với tia chiếu của đèn, duy trì khoảng cách giữa đèn và vật được chiếu không quá 2,5m

- Trước khi khử trùng và sau khi khử trùng bằng các phương pháp khử trùng ở trên để hộp petri có chứa môi trường thạch thường- glucoza đặc vô trùng trong phòng nuôi cấy bề mặt trong thời gian 30 phút sau đó đậy nắp hộp lại Để các hộp peptri trên vào tủ ấm 300C, sau 48 giờ đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch

Từ đó tính ra số vi sinh vật trong 100 cm2 không khí của phòng nuôi cấy bề mặt

2.3.3 Phương pháp lên men bề mặt chủng A.niger DL1

Môi trường P3 gồm cám gạo, cám ngô, và trấu được làm ẩm đến 65% bằng dung dịch khoáng, cho môi trường vào túi nilon (4kg môi trường/túi nilon), hấp khử trùng 1at trong 60 phút Để nguội môi trường, phân môi trường vào khay

nhựa kích thước 50cmx40cmx10cm, độ dày môi trường khoảng 5cm Chủng A niger DL1 được lên men hiếu khí trên môi trường P3 tại nhiêt độ 280C – 300 C, với tỷ lệ tiếp giống là 8%, lên men cho sản xuất phytaza trong thời gian từ 7 ngày đến 10 ngày đến khi các bào tử của chủng A niger xuất hiện dày trên mặt khay lên men

2.3.4 Xác định hoạt độ phytaza theo phương pháp của F.C Van der Heeft

Nguyên tắc :

Phương pháp dựa trên cơ sở sự thuỷ phân phytat natri (cơ chất của phytaza) bằng dịch chế phẩm phytaza rồi sau đó làm vô hoạt enzym và tạo phản ứng màu bằng hỗn hợp dung dịch Amoni heptamolybdat tetrahydrat và amoni monovanadat Định lượng sản phẩm – các gốc photphat vô cơ - được tạo thành trong phản ứng thuỷ phân bằng phản ứng tạo phức có màu vàng với thuốc thử là hỗn hợp dung dịch trên Cường độ màu của phức tạo thành được xác định bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng λ = 415 nm Sau đó dựa vào đồ thị đường cong chuẩn của natri dihydrophotphat để tính lượng sản phẩm tương ứng

do enzym xúc tác tạo nên

Hoạt độ phytaza (tạm ký hiệu là: HđF) của chế phẩm enzym đặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải hợp chất phytat (myo – inositol hexakis photphat) thành các myo – inositol photphat phân tử thấp hơn và các gốc photphat vô cơ Hoạt độ phytaza được biểu thị bằng số đơn vị hoạt độ trong một 1 ml (hay 1g) chế phẩm

Định nghĩa đơn vị hoạt độ enzym: Một đơn vị hoạt độ phytaza là lượng enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân để giải phóng ra 1µmol phosphat vô cơ trong thời gian một phút từ dung dịch phytat – natri ở 37°C, pH = 5,5 và trong các điều kiện của phương pháp này

2.3.5 Phương pháp xác định tính chất của phytaza

Enzym dùng trong nghiên cứu tính chất là enzym đã được cô đặc bằng cồn

a) Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của phytaza: Dung dịch

cơ chất natri phytat 3 mM được pha trong các dung dịch đệm có pH khác nhau như sau: đệm 0,1M Glycin-HCl (pH 2,0 ; 2,5 ; 3,0), đệm 0,1M natri axetat (pH 3,0 ; 3,5 ; 4,0 ; 4,5 ; 5,0 ; 5,5 ; 6,0); đệm Tris-HCl 100 mM (pH 6,0 ; 6,5 ; 7,0 ; 8,0) Sau đó hoạt độ enzym được xác định với dung dịch cơ chất trên ở 50oC trong 20 phút Hoạt độ enzym thể hiện mạnh nhất ở pH nào thì coi đó là pH tối thích cho hoạt độ enzym và được tính là 100% Hoạt tính ở các pH khác được tính theo pH tối thích

b) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của phytaza :

Enzym phản ứng với cơ chất ở các nhiệt độ khác nhau: 50; 55, 60; 65; 70 ; 75 ;

80o 90 o C trong thời gian 20 phút ở pH 5,5, sau đó xác định hoạt độ enzym để tìm ra nhiệt độ thích hợp nhất cho enzym hoạt động

c) Nghiên cứu ảnh hưởng của pepsin, tripsin đến phytaza

ủ pepsin và phytaza với tỷ lệ 0,1%, 1% (w/w) trong dung dịch HCl 0,1 N; trypsin với phytaza cũng với tỷ lệ trên, ở 37oC trong 2 giờ Các hỗn hợp enzym trên sau đó được bổ sung cơ chất natri phytat rồi xác định lượng photpho vô cơ giải phóng ra và hoạt độ còn lại của enzym

2.3.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH dịch khoáng của môi

trường lên men đến khả năng sinh phytaza của chủng A.niger DL1

Cám gạo, cám ngô, trấu được làm ẩm đến 65% bằng những dung dịch khoáng có giá trị pH khác nhau từ 3.0 – 7.0 Sau khi thanh trùng kiểm tra lại pH

nhằm tìm ra giá trị pH thực của môi trường rồi tiến hành lên men chủng A niger

DL1 trong các khay nhựa kích thước 50cmx40cmx10cm, độ dày môi trường khoảng 5cm , tỉ lệ tiếp giống là 8% ở 28- 300C trong 7 ngày Sau 7 ngày tiến hành chiết cơ chất lên men rắn bằng đệm natri axetat đệm 0,1M; theo tỉ lệ 1 : 1,5 Sau 24 giờ dùng vải màn vắt kiệt thu dịch enzym phytaza Dịch thu được sau đó được ly tâm 14000v/p trong 20 phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi để xác định hoạt độ enzym phytaza sinh tổng hợp được

2.3.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng của chất cảm ứng đến khả năng

sinh phytaza từ chủng A niger DL1

Chất cảm ứng Na- phytat được pha ở các nồng độ khác nhau từ 0 - 200µmol/l (bước nhảy 50µmol/l)

Quá trình lên men chủng Aspergillus niger DL1 được thực hiện trên môi

trường cám gạo đã được làm ẩm đến 65% bằng dung dịch khoáng trong 7 ngày ở nhiệt độ 28- 300C Sau đó xác định hoạt độ enzym phytaza sinh tổng hợp được ở các nồng độ chất cảm ứng khác nhau Sau 7 ngày tiến hành chiết cơ chất lên men rắn bằng đệm natri axetat đệm 0,1M; theo tỉ lệ 1 : 1,5 Sau 24 giờ dùng vải màn vắt kiệt thu dịch enzym phytaza Dịch thu được sau đó được ly tâm 14000v/p trong 20 phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi để xác định hoạt độ enzym phytaza sinh tổng hợp được

2.3.8 Phương pháp xác định ảnh hưởng của một số nguồn cơ chất khác nhau đến quá trình lên men cơ chất rắn thu nhận phytaza

Quá trình lên men chủng Aspergillus niger DL1 được thực hiện trên các môi

trường chứa các nguồn cơ chất khác nhau là cám gạo, bột ngô, bột đậu tương, khô lạc đã được làm ẩm đến 65% bằng dung dịch khoáng ở nhiệt độ 28-300C Sau 7 ngày tiến hành chiết cơ chất lên men rắn bằng đệm natri axetat đệm 0,1M; theo tỉ lệ 1 : 1,5 Sau 24 giờ dùng vải màn vắt kiệt thu dịch enzym phytaza Dịch thu được sau đó được ly tâm 14000v/p trong 20 phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi để xác định hoạt độ enzym phytaza sinh tổng hợp được

2.3.9 Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả

năng sinh phytaza của chủng A niger DL1

Nuôi cấy chủng Aspergillus niger DL1 trên môi trường cám gạo đã làm ẩm

tới 65% bằng dung dịch khoáng pH 5.0 nuôi cấy ở 300C trong thời gian 7 ngày Trong quá trình lên men, chúng tôi tiến hành lấy mẫu lên men từng ngày, bắt đầu

từ ngày thứ 2 tiến hành chiết cơ chất lên men rắn bằng đệm natri axetat đệm 0,1M; theo tỉ lệ 1 : 1,5 Sau 24 giờ dùng vải màn vắt kiệt thu dịch enzym phytaza Dịch thu được sau đó được ly tâm 14000v/p trong 20 phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi để xác định hoạt độ enzym phytaza sinh tổng hợp được Từ đó xác định được thời gian nuôi cấy thích hợp cho lên men sinh tổng hợp phytaza

2.3.10 Phương pháp xác định ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng

sinh phytaza từ chủng A niger DL1

Để xác định độ ẩm phù ban đầu phù hợp cho quá trình lên men, chúng tôi tiến

hành lên men chủng Aspergillus niger DL1 trên môi trường cám gạo được làm

300C Sau 7 ngày lên men tiến hành chiết cơ chất lên men rắn bằng đệm natri axetat 0,1M; theo tỉ lệ 1 : 1,5 Sau 24 giờ dùng vải màn vắt kiệt thu dịch enzym phytaza Dịch thu được sau đó được ly tâm 14000v/p trong 20 phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi để xác định hoạt độ enzym phytaza sinh tổng hợp được Từ đó xác định được độ ẩm thích hợp cho lên men sinh tổng hợp phytaza

2.3.11 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến khả năng

sinh phytaza của chủng A niger DL1

sử dụng một số nguồn nitơ thông dụng dựa trên môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp phytaza của một số tác giả đã công bố Nguồn nitơ được sử dụng trong sản xuất phytaza là bột nấm men, bột đậu tương, bột ngô, NH4NO3, (NH4)2SO4 ở

các nồng độ thích hợp Lên men chủng A niger DL1 trên các môi trường có

chứa các nguồn nitơ kể trên ở điều kiện nhiệt độ 28-300C Sau 7 ngày tiến hành chiết cơ chất lên men rắn bằng đệm natri axetat đệm 0,1M; theo tỉ lệ 1 : 1,5 Sau

24 giờ dùng vải màn vắt kiệt thu dịch enzym phytaza Dịch thu được sau đó được ly tâm 14000v/p trong 20 phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi để xác định hoạt độ enzym phytaza sinh tổng hợp được Từ đó xác định được nguồn nitơ tối

ưu cho lên men sinh tổng hợp phytaza

2.3.12 Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả

năng sinh phytaza từ chủng A niger DL1

Môi trường P3 được làm ẩm bằng dung dịch khoáng Sau khi thanh trùng,

để nguội môi trường rồi tiến hành lên men Chủng A niger DL1 trong các khay

nhựa kích thước 50cmx40cmx10cm, độ dày môi trường khoảng 5cm , tỉ lệ tiếp giống là 8% trong 7 ngày ở nhiệt độ từ 200C- 400C

Cơ chất lên men rắn được chiết bằng đệm natri axetat đệm 0,1M; theo tỉ lệ

1 : 1,5 Sau 24 giờ dùng vải màn vắt kiệt thu dịch enzym phytaza Dịch thu được sau đó được ly tâm 14000v/p trong 20 phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi để xác định hoạt độ Từ đó xác định được nhiệt độ tối ưu cho lên men sinh tổng hợp phytaza

2.3.13 Tối ưu hóa sinh tổng hợp phytaza bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Nội dung của phương pháp này là tìm các giá trị của các yếu tố ảnh hưởng (X) để tại đó quá trình tiến hành có hiệu quả nhất, nghĩa là hàm mục tiêu (Y) đạt

giá trị cực đại Phương pháp này cho phép dẫn các biến số đến vùng tối ưu khi các biến số này thay đổi cùng một lúc

Quá trình này gồm hai giai đoạn: 1) Thiết lập mô hình toán học mô tả quan hệ giữa hàm mục tiêu (Y) và các yếu tố ảnh hưởng (Xi); 2) Trên cơ sở mô hình toán học thiết lập được tiến hành tối ưu hóa

¾ Thiết lập mô hình toán học

Mô hình toán học biểu diễn mối liên hệ giữa hàm mục tiêu và các yếu tố ảnh hưởng dưới dạng một đường đồng mức Các dạng đồng mức có thể là:

Y = b0 + b1X1 + b2X2 + … + bnXn (1)

Y = b0 + b1X1 + b2X2 + … + bnXn + b12X1X2 + b13X1X3 = bn-1nXn-1Xn (2) Trong đó:

Y: hàm mục tiêu; X1: các biến mã số (chỉ nhận các giá trị -1; 0; +1); B1: các hệ số diễn tả mức độ ảnh hưởng của biến Xi đến hàm mục tiêu

Có thể sử dụng hai mô hình trên để mô tả quá trình Để tối ưu hóa thì mô hình phải ở dạng tuyến tính (1) và các hệ số của mô hình đều phải có nghĩa (hệ

số nào không có nghĩa thì phải loại khỏi mô hình) Để thiết lập mô hình toán học theo phương pháp này, phải tiến hành các bước sau:

- Xác định chỉ tiêu tối ưu (hàm mục tiêu): Hàm mục tiêu là hoạt độ phytaza, đơn vị làIU/ml

- Xác định các yếu tố ảnh hưởng: Thiết lập mô hình với ba yếu tố: nồng độ cacbon, nitơ và lượng giống cấy

¾ Thực nghiệm tìm điều kiện tối ưu theo Box-Willson

Ở giai đoạn này phải sử dụng mô hình đã tìm được để tổ chức thí nghiệm theo hướng gradient tiến tới vùng tối ưu Giai đoạn này gồm hai bước:

Sau 7 ngày lên men, môi trường lên men rắn chủng A niger DL1 trên môi

trường P3 được giữ trong túi nilon và nén chặt cơ chất đã lên men để sao cho

trong túi tuyệt đối không có không khí Sau đó môi trường lên men rắn được chiết bằng các loại đệm như sau:

a/ Chiết enzyme bằng dung dịch đệm (Acetat-Na, tris-HCl, glycerin-HCl)

Cơ chất lên men rắn được chiết bằng các đệm 0,1M Glycin-HCl; đệm 0,1M natri axetat; đệm Tris-HCl 100 mM theo tỉ lệ 1 : 1,5 Sau 24 giờ dùng vải màn vắt kiệt thu dịch enzym phytaza Dịch thu được sau đó được ly tâm 14000v/p trong 20 phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi để xác định hoạt độ

b/ Chiết enzyme bằng dung dịch oxy già ( H 2 O 2 5%)

Cơ chất lên men rắn được chiết bằng nước oxy già 5% và được để ổn định tại nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ, sau đó dung dịch được thu lại bằng vải lọc Sau 24 giờ dùng vải màn vắt kiệt thu dịch enzym Dịch thu được sau đó được ly tâm 14000v/p trong 20 phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi để xác định hoạt độ Dung dịch nước oxy già ngoài ra còn có khả năng tiêu diệt các bào tử nấm mốc gây hại qua đó hỗ trợ cho quá trình tinh sạch và nâng cao độ bền của enzyme

c/ Chiết enzym phytaza bằng nước 45 0 C

Cơ chất lên men rắn được chiết bằng nước 450C và được để ổn định tại nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ, sau đó dung dịch được thu lại bằng vải lọc Sau 24 giờ dùng vải màn vắt kiệt thu dịch enzym Dịch thu được sau đó được ly tâm 14000v/p trong 20 phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi để xác định hoạt độ

2.3.15 Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn các chất phụ gia thích hợp để tạo chế phẩm

Chủng A niger DL1 được lên men trên nguồn cơ chất rắn, sau thời gian 7

ngày đem chiết enzym phytaza bằng cách: lấy 10kg cơ chất sau lên men cho vào thùng nhựa 160l, bổ sung 15 l nước oxy già 5% Chiết trong 24giờ, dùng vải màn vắt bỏ phần bã, lấy phần dịch chiết có chứa enzym phytaza Dịch chiết được

ly tâm liên tục với tốc độ 14.000 vòng/phút để loại xác tế bào, thu dịch nổi Dịch nổi được tủa bằng cồn 960, sau đó ly tâm liên tục 14000vòng/phút, kết tủa thu được có chứa enzym phytaza Chế phẩm enzym phytaza thô được bổ sung một

số chất phụ gia PEG, ZnS04, bột bã men bia để ổn định hoạt tính enzym

Bố trí công thức phối trộn chế phẩm như sau:

Polyethylene glycol: 4% Nước 3,5%

2.3.16 Phương pháp nghiên cứu tính chịu nhiệt của chế phẩm enzym phytaza

Chế phẩm enzym phản ứng với phytate natri ở các nhiệt độ khác nhau: 60; 70 ; 75 ; 80; 850C trong thời gian 15 giây ở pH 5,5, sau đó xác định hoạt độ enzym còn lại sau khi xử lý trong 15 giây ở các nhiệt độ trên

2.3.17 Phương pháp nghiên cứu tạo chế phẩm enzym phytaza bằng sấy phun

Tiến hành sấy phun phytaza theo patent của Mỹ số 4233405 có cải tiến, thí nghiệm được tiến hành như sau:

Chế phẩm enzym phytaza phối trộn theo công thức CT1 (có thành phần gồm bột ngô: 5%dịch phytaza: 8%, bột nấm men: 1,4%, ZnSO4: 0,5%, polyethylene glycol: 1%) có hoạt độ enzym ban đầu là 2551IU/g được đưa vào buồng sấy phun rồi điều kiển nhiệt độ đầu vào từ 1200C – 1800C, nhiệt độ đầu ra

là 680C – 850 C áp suất trong buồng phun sấp xỉ 4,25 bar Thời gian sản phẩm chạy qua máy xấp xỉ 30 giây Sau đó xác định hoạt độ của enzym phytaza còn lại sau khi sấy phun ở các điều kiện nhiệt độ đầu vào và đầu ra khác nhau

2.3.18.Phương pháp xác định khẳ năng tạo độc tố ochrratoxin A của chủng A niger DL1

Tiến hành xác định khẳ năng tạo độc tố ochrratoxin A của chủng A niger DL1 theo phương pháp của Tanaka và cộng sự [ 43 ] Các bước được tiến hành như sau:

Chuẩn bị ngô làm môi trường nuôi cấy nấm mốc A.niger spp

Chọn các mẫu ngô không nhiễm ochrratoxin A được chiết xuất ochrratoxin A từ các mẫu ngô này theo phương pháp của Shimomura và Ishikuro [ 42] Cân 30g mẫu ngô (đã đựơc xác định là không có ochratoxin A), cho vào bình tam giác, trộn với 1,5ml nước cất lắc thật đều Khử trùng 121°C trong 30 phút

Cấy chủng A.niger spp phân lập được với nồng độ 109 bào tử/ml vào môi

trường ngô không nhiễm ochratoxin A đã được khử trùng Nuôi cấy A niger spp ở

28°C trong 9 ngày Mỗi ngày đều lấy ra lắc

Chiết xuất ochratoxin A từ các chủng A.niger spp nuôi cấy Xác định định tính

ochratoxin A bằng sắc ký bản mỏng theo AOAC có cải tiến Xác định định lượng ochratoxin A bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp theo phương pháp của Shimomura

- Làm sạch: 10ml toluen được cho vào vi cột Sep-pak silica cartridge để rửa cột 2ml dung dịch mẫu được đưa vào Sep-pak silica cartridge Sau đó cột được rửa với 10ml toluen và 6ml cloroform-metanol (97:3) Ochratoxin A được chiết rút với 10ml toluen-axit axetic (9:1) và làm khô dưới dòng khí nitơ cho đến khi hết mùi axit axetic Phần cặn được hoà tan vào 100µl metanol, giữ ở 40C cho đến lúc tiến hành định tính và định lượng

- Định tính ochratoxin A

Dùng micropipet (0,5-10 µl) nhỏ lên bản sắc kí lớp mỏng 2µl, 6µl và hai lần 10µl mẫu phân tích Các vết nhỏ của dung dịch được chấm vào bản mỏng cách mép dưới của bản mỏng 2cm và 1,5 – 2cm từ mỗi cạnh bên Việc chấm phải thực hiện với những lượng nhỏ sao cho các vết có đường kính không quá 5 mm trên đường bắt đầu Nhỏ 2, 6, 10 µl chuẩn AFB1 với nồng độ 5µg/ml trên cùng một phiến bản mỏng Hệ dung môi khai triển là chlorofom : axeton tỷ lệ 9:1

Giới hạn độ phát hiện của phương pháp là 5µg ochratoxin A/kg sản phẩm, hệ số dao động là 0,3-0,5 Phát hiện ochratoxin A bằng sự phát quang của các vết trên bản

mỏng ở buồng tối dưới đèn cực tím ở bước sóng 365nm Phát hiện bằng mắt thường trên sắc kí đồ của mẫu chiết cường độ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tích cho việc định lượng ochratoxin A

- Định lượng ochratoxin A

Ochratoxin A được phát hiện trong mẫu thử được định lượng bằng cách: Nhỏ 10µl chất chiết với đường kính của vết không quá 5mm, ở góc dưới, bên phải của bản mỏng, 1,5cm cách mép ở góc dưới bên trái 1,2 và 3cm cách mép và 1,5 từ mép dưới của bản mỏng, nhỏ 2µl, 4µl, 6µl theo thứ tự dung dịch chuẩn ochratoxin A Nhỏ 6µl dung dịch chuẩn lên phía bên phải góc trên, 1,5 cách mép phiến mỏng

Thực hiện sắc kí bản mỏng hệ dung môi chloroform : axeton (9:1) so sánh cường độ phát quang của các chuẩn aflatoxin khác nhau trên bản mỏng với các vết mẫu thử, bằng mắt thường định lượng ochratoxin A ở vết mẫu thử theo công thức sau:

=

M V2 V4

V1 V3 X

X : Hàm lượng ochratoxin A ứng với đỉnh của mẫu trên sắc ký để tính theo đường cong chuẩn (ng)

V1: Lượng dung môi để chiết suất ochratoxin A của mẫu tính theo lượng cloroform (ml)

V2: Lượng dịch mẫu lấy để làm bay hơi ở máy cô chân không quay (ml)

V3: Lượng metanol để hòa cắn (ml)

V4: Lượng mẫu dùng (ml)

M : Lượng ngô để lấy phân tích (g)

2.3.19 Phương pháp đánh giá chất lượng phytaza do dự án sản xuất được (hoạt tính enzym, độ ổn định)

Chế phẩm enzym thô được đánh giá chất lượng thông qua xác định hoạt tính enzym còn lại sau các khoảng thời gian bảo quản 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng,

4 tháng, 5 tháng và 6 tháng

2.3.20 Phương pháp đánh giá chế phẩm phytaza trên đàn lợn

- Đối tượng nghiên cứu: lợn lai F2 (3/4 giống ngoại) , số lượng 63 con (60 ngày

Hàm lượng

- Vật liệu: Enzym Phytaza VSI 2500 IU/g của viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch bổ sung 400g/1 tấn thức ăn thay thế cho 84 - 94 kg phốt phát vô cơ trong khẩu phần ăn của vật nuôi và Enzym Phytaza Ronozym

5000 IU/g của Thụy sĩ bổ sung 200g/1 tấn thức ăn thay thế 84-94 kg phốt phát

vô cơ trong khẩu phần ăn của vật nuôi

- Thời gian nghiên cứu: bắt đầu từ 10/8/2008 kết thúc 16/8/2008

- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Thực nghiệm và Bảo tồn vật nuôi

- Nội dung nghiên cứu

Đánh giá tỷ lệ nuôi sống, khả năng tăng trọng và tiêu tốn thức ăn/kg tăng trọng của các lô thí nghiệm

ăn

Lô 3(TN2) 21 con ăn theo khẩu phần cơ sở, cung cấp khoáng không cho DCP(hỗn hợp dicanxiphotphat), được thay bằng bột đá và trộn men Ronozym của Thụy sỹ với tỷ lệ 200g/ 1 tấn thức ăn

+ Lợn thí nghiệm được nuôi khảo sát tại chuồng sàn mỗi chuồng nhốt 7 con, tỷ

lệ đực cái các lô như nhau và được cho ăn tự do

2.3.21 Phương pháp đánh giá chế phẩm phytaza trên đàn gà

- Đối tượng nghiên cứu: Gà Lương phượng 35 ngày tuổi, số lượng 90 con

- Vật liệu: Enzym Phytaza VS1 2500IU/g của viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch bổ sung 200g/1 tấn thức ăn thay thế cho 42 - 47 kg phốt phát vô cơ trong khẩu phần ăn của vật nuôi và Enzym Phytaza Ronozym 5000IU/g của Thụy sĩ bổ sung 100g/1 tấn thức ăn thay thế 42 - 47 kg phốt phát

vô cơ trong khẩu phần ăn của vật nuôi

- Thời gian nghiên cứu: 5 tuần bắt đầu từ 10/7/2008 kết thúc 16/8/2008

- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Thực nghiệm và Bảo tồn vật nuôi

- Nội dung nghiên cứu

Đánh giá tỷ lệ nuôi sống, khả năng tăng trọng và tiêu tốn thức ăn/kg tăng trọng của các lô thí nghiệm

ăn

Lô 3(TN2) 30 con ăn theo khẩu phần cơ sở, cung cấp khoáng không cho DCP(hỗn hợp dicanxiphotphat), được thay bằng bột đá và trộn men Ronozym của Thụy sỹ với tỷ lệ 100g/ 1 tấn thức ăn

+ Gà thí nghiệm được nuôi khảo sát tại chuồng lồng mỗi chuồng nhốt 10 con, tỷ

lệ trống mái các lô như nhau và được cho ăn tự do

2.4 Phương án triển khai dự án

a) Phương thức tổ chức thực hiện:

- Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã có kế hoạch hợp tác với các cơ quan có năng lực trong việc triển khai thực hiện dự án Sau khi bàn bạc, các bên tham gia thực hiện dự án đã thống nhất nhiệm vụ của các đơn

vị thực hiện dự án như sau:

Nhiệm vụ của các đơn vị tham gia dự án:

1 Nhiệm vụ của Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch:

- Nâng cao hoạt tính và khả năng ổn định của các chủng A niger sinh tổng

hợp phytaza cao

- Hoàn thiện công nghệ nhân giống cho sản xuất phytaza quy mô 1,4 tấn/mẻ (tức 50 tấn/năm)

- Hoàn thiện công nghệ lên men cơ chất rắn phytaza quy mô 1,4 tấn/mẻ (tức 50 tấn/năm)

- Hoàn thiện công nghệ tách chiết phytaza dạng thô 1,4 tấn/mẻ (tức 50 tấn/năm)

- Hoàn thiện công nghệ tạo chế phẩm phytaza dạng bột 1,4 tấn/mẻ (tức 50 tấn/năm)

- Nghiên cứu quá trình cơ giới hoá sản xuất phytaza quy mô 1,4 tấn/mẻ (tức 50 tấn/năm)

- Đào tạo cán bộ và công nhân cho công ty Vĩnh Hà nắm vững vận hành thiết

bị và làm chủ công nghệ sản xuất phytaza

- Tập huấn cho các cơ sở chăn nuôi biết sử dụng phytaza vào chăn nuôi lợn, gà

2 Nhiệm vụ của công ty TNHH Công nghệ xanh Thành Châu

- Tổ chức sản xuất phytaza qui mô 50 tấn/năm

- Tiêu thụ phytaza sản xuất được

- Để bổ sung vào sản xuất thức ăn chăn nuôi phục vụ các trang trại của các tỉnh ở miền Bắc, miền Trung và miền Nam

b) Phương thức phân chia lợi nhuận:

Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch sẽ hưởng 60% tổng số lãi của dự án Số tiền lãi này nhằm mục đích để trả lại Nhà nước phần dự

án phải thu hồi

Công ty TNHH công nghệ xanh Thành Châu: 40% tổng số lãi của dự án

c) Mô tả, phân tích và đánh giá các điều kiện triển khai Dự án:

1 Địa điểm thực hiện dự án:

+ Phòng nghiên cứu vi sinh vật, Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch là nơi sẽ tiến hành các thí nghiệm nhằm nâng cao hoạt tính và ổn định chủng giống vi sinh vật phục vụ cho dự án tổng diện tích phòng thí nghiệm

là 200m2

+ Xưởng sản xuất của Công ty TNHH công nghệ xanh Thành Châu là nơi có diện tích 500 m2 nhà xưởng thuận tiện cho việc xây dựng hệ thống lên men chìm sục khí và hệ thống lên men cơ chất rắn để sản xuất enzim phytaza ở

qui mô công nghiệp

2 Kế hoạch dự kiến sản xuất phytaza theo thuyết minh và hợp đồng

Tổng khối lượng enzim phytaza lên men sản xuất trong thời gian thực hiện

dự án là 100 tấn, phân bổ theo các năm như sau:

Số lượng (tấn) enzim dạng thô có hoạt lực

là 2500IU/ g

0 50 50

Khối lượng enzim phytaza sản xuất được/ tháng tính toán dựa trên công suất nhân giống của hệ thống nuôi cấy chìm sục khí qui mô 1000 l/ mẻ Hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 1000 l/ mẻ của viện Cơ điện Nông nghiệp và CNSTH có thể sản xuất được lượng giống 1000l với thời gian 3 ngày/ mẻ, tỷ lệ

tiếp giống là 8% thì mỗi mẻ nhân giống A niger cấp 2 sẽ được 12.500 kg cơ

chất Vậy một tháng sẽ lên men được 1 mẻ và lên men được 12.500 kg sinh khối

bề mặt

Trong 1g sinh khối phytaza bề mặt có hoạt lực là 1000 IU/g tức là 1.000.000 IU/kg, vậy để có được enzym thô hoạt lực là 2500 IU/g tức là 2.500.000 IU/kg thì trong 1 tháng có thể sản xuất được

khô, tủ lạnh sâu âm 200C, tủ lạnh sâu âm 800C, máy lắc ổn nhiệt nuôi cấy vi sinh vật, máy đo pH, Bình tam giác 500ml, phễu, hộp lồng, ống nghiệm các loại, ống đong, pipet các loại …

+ Công ty TNHH công nghệ xanh Thành Châu đầu tư thiết bị sau:

- Các thiết bị nhân giống , giữ giống enzym phytaza như nồi khử trùng, tủ cấy vô trùng, tủ sấy, tủ ấm, kính hiển vi quang học,

- Các thiết bị thu hồi và tạo hế phẩm phytaza ở qui mô công nghiệp như: máy li tâm liên tục 16000v/ phút công suất 1000l/mẻ, hệ thống sấy phytaza qui mô công nghiệp 5 tấn/mẻ

- Hệ thống lên men chìm sục khí qui mô 5000 l/mẻ

2.6 Nguyên vật liệu

2.6.1 Chủng giống

- Chủng nấm mốc Aspergillus niger ATCC 9142 từ bộ sưu tập giống của Mỹ

- Chủng nấm mốc Aspergillus ficcuum NRRL 3135 từ bộ sưu tập giống của Mỹ

- Chủng nấm mốc Aspergillus niger DL1 phân lập từ vỏ quả chanh Đà Lạt do

Bộ môn Vi Sinh, Viện Cơ điện NN & CNSTH cung cấp

- Chủng nấm mốc Aspergillus niger NCIM 563 từ Trung tâm sưu tập giống

Cộng hoà Séc

- Chủng nấm mốc Rhizopus microsporus từ Trung tâm sưu tập giống Cộng

hoà Séc

2.6.2 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường P1 bao gồm các thành phần như : Glucose 15g/l, Phytat natri 2,5g/l, NH4NO3 5g/l, KCl 0,5g/l, MgSO4 0,5g/l, FeSO4.7H2O 0,01g/l, MnSO4.4H2O 0,01g/l, Agar 2,5g/l

- Môi trường P2 (Cám gạo 20g/l; CaCl2 2g/l; K2HPO4 0,4g/l; KH2PO4 0,5g/l; NH4NO3 0,4g/l; MgSO4 7H2O 0,2g/l; nước 1l)

- Môi trường PDA: nước chiết khoai tây 1l (200g khoai tây chiết lấy 1 lít nước chiết); đường glucoza 20g

- Môi trường lên men bề mặt 1tấn môi trường): cám 400kg, bột ngô 400kg, trấu 10kg, dung dịch khoáng 400l

Cách pha dung dịch khoáng (g/l): K2SO4 17,4g; MgSO4 7H2O 12,3g; MnSO4.4H2O 0,22g; FeSO4.7H2O 2g; ZnSO4 1,44g; CaCl2 18,3g; KH2PO4 0,004g

- Môi trường Nấm men- nấm mốc: glucoza 20g/l, cao men 5g/l, chloramphenicol 0,1g/l, nước 1l)

- Môi trường nuôi cấy tổng số vsv hiếu khí (g/l): pepton 10g; NaCl 5g; nước chiết thịt 5g, glucoza 1g; agar 20g; nước 1l

+ Cám gạo, cám ngô mua ở các cơ sở xay xát thóc, ngô tại các huyện ngoại thành Hà Nội

+ Các khoáng vi lượng mua của các cửa hàng hoá chất tại Hà Nội

2.6.3 Hóa chất

- Các hóa chất thông dụng: Agar (Việt Nam)- Axit lactic (Việt Nam), Axit

citric - Axit axetic, CaCl2, CaCO3, (NH4)2SO4, (NH4)3PO4, Na2HPO4, MgSO4, K2HPO4, - FeSO4.7H2O, NH4NO3, Na2SO4, KCl, FeSO4, MnSO4.7H2O (Trung Quốc), Pepton (Trung Quốc), glucoza

- Các hóa chất chuẩn: Phytaza chuẩn của Sigma, USA, Natri- phytat của

Sigma, USA, ammonium heptamolybdate, ammonium monovanadate, axit nitric, Tween 20, CH3COONa, CH3COOH, NH4OH

2.7 Diện tích mặt bằng cần thiết cho quá trình sản xuất

+ Diện tích phòng thí nghiệm cho nâng cao hoạt lực và ổn định chủng giống là 200 m2 tại Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

+ Diện tích nhà xưởng cho sản xuất chế phẩm phytaza từ A niger bằng

phương pháp lên men cơ chất rắn, qui mô 50 tấn/năm khoảng 1000 m2 tại Công

ty TNHH công nghê xanh Thành Châu, bao gồm:

Diện tích mặt bằng cần cho nồi hơi là 30 m2 , diện tích cho nồi khử trùng

là 30m2, diện tích cho hệ thống nuôi cấy bề mặt là 200m2, diện tích cho thu hồi

và tạo chế phẩm và ly tâm 40m2, diện tích cho đảo trộn, sấy, đóng gói và bảo quản enzim phytaza (100 m2), diện tích kho chứa và sân bãi là 200 m2 Tổng

2.8 Nhân lực cần cho triển khai Dự án

- Phòng vi sinh, Viện Cơ điện nông nghiệp và công nghệ sau thu hoạch có đội ngũ cán bộ khoa học về công nghệ sinh học mạnh, bao gồm 1 PGS, 1 tiến sĩ,

4 nghiên cứu sinh, 7 thạc sĩ, 12 kỹ sư công nghệ sinh học và 3 công nhân lành nghề

- Công ty TNHH công nghệ xanh Thành Châu có 15 cán bộ kỹ thuật và công nhân tham gia thực hiện dự án

Tổng vốn đầu tư để triển khai dự án là: 6.27 tỷ đồng trong đó:

- Vốn từ ngân sách sự nghiệp khoa học là: 1,75 tỷ đồng

- Vốn huy động từ công ty là 4,52 tỷ đồng

- Tổng kinh phí đề nghị Nhà nước hỗ trợ là: 1.75 tỷ đồng

Trong đó:

+ Kinh phí hỗ trợ công nghệ : 700 triệu đồng

+ Chi phí lao động : 100 triệu đồng

+ Nguyên vật liệu, năng lượng : 750 triệu đồng

+ Chi khác : 200 triệu đồng

III.CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC CỦA DỰ ÁN

3.1.Xác định tính chất enzym phytaza của tập đoàn vi sinh vật sinh enzym do

đề tài chọn tạo và sưu tập

3.1.1 Xác định tính chất của phytaza từ chủng Aspergillus niger ATCC 9142

(pH tối ưu, khả năng chịu nhiệt, khả năng thủy phân bằng pepsin, trypsin)

3.1.1.1 Ảnh hưởng pH đến hoạt độ phytaza

Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ phytaza từ chủng Aspergillus niger ATCC 9142

được trình bày ở bảng 1

Bảng 1: Ảnh hưởng pH đến hoạt độ phytaza

(%)

2,0 338 45.0 2,5 495 66.0

Glycine- HCl

3,0 559 74.5 3,0 570 76.0 3,5 595 79.3 4,0 605 80.6 4,5 614 81.9 5,0 625 83.3

Acetate - Na

6,0 587 79.3 6,0 535 71.3 6,5 456 60.8 7,0 320 42.7

Tris - HCl

Phytaza được sinh ra từ chủng Aspergillus niger ATCC 9142 có khả năng

hoạt động trong khoảng pH rất rộng từ 2,0-8,0 Tuy nhiên hoạt độ phytaza mạnh

nhất ở ngưỡng pH là 5,5 ở đệm Acetate - Na