SẢN XUẤT SINH KHỐI LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ĐỂ BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO TÔM VÀ XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG AO NUÔI

SẢN XUẤT SINH KHỐI LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ĐỂ BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO TÔM VÀ XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG AO NUÔI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT

KHOA SINH HỌC

LỚP CSK31

BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN ĐỀ

SẢN XUẤT SINH KHỐI

LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

ĐỂ BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO TÔM VÀ XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG AO NUÔI

Nhóm thực hiện: Nhóm 3

BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO TÔM

VÀ XỬ LÝ MÔI TRƯỜNG AO NUÔI

GVHD: CN NGUYỄN VĂN GIANGSVTH: PHẠM NGỌC CHÚC

LÊ ĐOÀN VY HẠNGUYỄN THỊ KHÁNH LYNGUYỄN THỊ THỦY NGÂNĐẶNG VĂN NGHỊ

NGUYỄN XUÂN TOÀNĐÀM HUYỀN TRANGTRẦN THỊ QUỲNH TRANG

TRẦN THỊ THÙY TRANG

Xin gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn văn Giang, người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện về mọi mặt cho chúng tôi trong suốt quá trình làm

đề tài

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Thu nhận sinh khối tế bào

Hình 2: Chủng Lactobaccilus acidophilus được hoạt hóaHình 3 Hình thái khuẩn lạc Lactobaccilus acidophilusHình 4 Sinh khối trên bề mặt thạch

Hình 5 Dịch sinh khối tế bào

Hình 6 Sinh khối tế bào

Hình 7 Sinh khối được cố định trên tá dược

Hình 8 Nhuộm soi tế bào vi khuẩn

Mục lục

LỜI MỞ ĐẦU………1

Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Probiotic………4

1.1.1 Các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong probiotic……….4

1.1.2 Công dụng của Probiotic trong NTTS………4

1.1.3 Tác hại của probiotic……….6

1.2 Vi khuẩn Lactic………6

1.2.1 Phân loại vi khuẩn Lactic……….7

1.2.2 Đặc điểm hình thái………7

1.2.3 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa……….8

1.2.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic………8

1.2.3.2 Quá trình trao đổi chất ………10

1.2.4 Những ứng dụng của vi khuẩn lactic………10

1.2.4.1 Những ứng dụng trong công nghệ thực phẩm………10

1.2.4.2 Chế biến các sản phẩm sữa………10

1.2.4.3 Sản xuất bánh mỳ đen………11

1.2.4.4 Ủ thức ăn gia súc……….11

1.2.4.5 Muối chua rau quả………11

1.2.4.6 Sản xuất acid lactic và muối lactat……….11

1.2.4.7 Sản xuất men tiêu hóa cho người và động vật………11

1.2.4.8 Một số ứng dụng khác của vi khuẩn lactic………12

1.3 Lactobacillus acidophilus 12

1.3.1 Phân loại……….12

1.3.2 Đặc điểm hình thái………13

1.3.3 Đặc tính nuôi cấy………13

1.3.4 Tác dụng của Lactobacillus acidophilus ………13

Phần II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu………14

2.2 Đối tượng, dụng cụ, thiết bị………14

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu………14

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị………14

2.2.3 Môi trường nuôi cấy ……….14

2.2.4 Khử trùng thiết bị, dụng cụ………15

2.3 Phương pháp nghiên cứu……….15

2.3.1 Phương pháp phục hồi chủng……….15

2.3.2 Phương pháp phân tách khuẩn lạc……… 15

2.3.3 Phương pháp nhân giống………15

2.3.4 Phương pháp lên men………15

2.3.5 Phương pháp nhuộm gram………15

2.3.6 Phương pháp thu nhận sinh khối………16

2.3.7 Định lượng sản phẩm………16

Phần III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả hoạt hóa chủng Lactobaccilus acidophilus………17

3.2 Quá trình tách khuẩn lạc………17

3.2.1 Quá trình cấy ria………17

3.2.2.Hình thái khuẩn lạc……….17

3.3 Quá trình nhân giống cấp 1……….18

3.4 Quá trình lên men………18

3.5 Quá trình thu nhận sinh khối………18

3.6 Cố định sinh khối tế bào trên tá dược………20

3.7 Nhuộm gram tế bào vi khuẩn 20

3.8 Định lượng sản phẩm 21

Phần IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 22

Kiến nghị 23

TÀI LIỆU THAM KHẢO 24

LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay nuôi trồng thủy sản (NTTS) là ngành phát triển rất mạnh trên thế giới, nó đem lại hiệu quả kinh tế cao Ở Việt Nam, năm 2002 chính phủ quyết định thủy sản là ngành kinh tế ưu tiên, trong đó ngành nuôi tôm là ngành mũi nhọn, nhằm mục đích: tăng kim ngạch xuất khẩu, chuyển đổi cơ cấu kinh tế kém hiệu quả, giảm áp lực khai thác ven bờ, nâng cao hiệu quả

sử dụng đất và tạo công ăn việc làm cho người lao động.Tổng giá trị xuất khẩu thủy sản Việt Nam không ngừng tăng trong suốt mấy thập niên vừa qua Tuy nhiên, đầu tư kí thuật để nâng cao sản lượng thủy sản vẫn chưa đápứng kịp với nhu cầu phát triển, ngành NTTS đang gặp khó khăn lớn dẫn đến thất bại ở nhiều cơ sở nuôi trồng Nguyên nhân chính là do ô nhiễm môi trường nước ao nuôi, dịch bệnh và hệ thống sinh thái bị phá hủy Vấn đề ô nhiễm nước ao nuôi là do lượng thức ăn thừa tôm không sử dụng được lớn, tôm bài tiết, lột xác nhiều và xác của những động vật thủy sinh phù du trong môi trường nhiều Khi ao nuôi bị ô nhiễm là cơ hội cho những nhóm vi sinh vật có hại phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là vật nuôi

bị bệnh Vì vậy, việc xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môi trường nước và phòng bệnh là cấp thiết

Trước đây, người nuôi thường sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý môi trường ao nuôi và phòng bệnh Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng sinh gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và con người Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc kháng sinh còn gây ra vấn đề về dư lượng kháng sinh trong vật nuôi vi phạm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm Do đó, cần chọn một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những đặc tính có lợi – Probiotic : phân hủy các chất hữu cơ thừa, đối kháng với vi khuẩn gây bệnh…đã được áp dụng Một trong những loài vi khuẩn có những đặc tính này là vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic mang nhiều những đặc tính có lợi cho người và vật nuôi:

hỗ trợ tiêu hoá, tăng cường khả năng miễn dịch, kích thích sự phát triển của vật nuôi…Ngoài ra chúng còn giúp điều trị các bệnh về đường tiêu hoá như: tiêu chảy, táo bón, loạn khuẩn…Bên cạnh đó, vi khuẩn lactic còn có khả

năng kìm hãm, ức chế các vi sinh vật gây bệnh: Candida albicans, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus…do chúng sinh các chất: bacteriocin, acid lactic….

Với nhiều những đặc tính có lợi như vậy chúng tôi đưa vi khuẩn lactic vào ứng dụng làm chế phẩm cho NTTS Trong sản xuất công nghiệp với

mục tiêu thu sinh khối lớn chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Sản xuất sinh

khối Lactobacillus acidophilus để bổ sung vào thức ăn cho tôm và xử lý môi trường ao nuôi”

Đề tài được triển khai với các nội dung chính là:

+ Thử nghiệm để hoàn thiện quy trình sản xuất sinh khối Lactobacillus acidophilus ở quy mô phòng thí nghiệm

+ Đánh giá các điều kiện thích hợp cho sự phát triển của Lactobacillus acidophilus

Trong điều kiện thời gian hạn hẹp, không tránh khỏi những sai sót Kính mong thầy cô và các bạn đóng góp ý kiến để đề tài được hoàn thiện hơn

Phần I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Probiotic

Theo nghĩa gốc, “biotic” hay “biosis” từ chữ “life” là đời sống, và “pro”

là thân thiện, nên probiotic có thể dịch sát là cái gì thân thiện với đời sống Định nghĩa sát hơn, là chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn hay vi nấm có ích

Theo định nghĩa của tổ chức lương nông quốc tế hay tổ chức y tế thế giới, probiotic là những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của ký chủ[ ]

1.1.1 Các nhóm vi sinh vật chủ yếu trong probiotic

Nhiều nhóm vi sinh vật probiotic – lactic và probiotic – non lactic đã được sử dụng sản xuất các chế phẩm này Vi khuẩn dùng rộng rải nhất và được thử nghiệm lâm sàng nhiều nhất, là các loại Lactobacillus (như L acidophilus, L rhamnosus, L bulgaricus, L reuteri và L casei); nhiều chủng Bifidobacterium và Saccharomyces boulardii là những vi nấm không gây bệnh.Công dụng của Probiotic trong NTTS

Các nhóm vi sinh vật nói trên có những khả năng đặc biệt: tổng hợp các chất hữu cơ có khả năng phân hủy, diệt khuẩn và là nguồn dinh dưỡng nên rất có lợi khi sử dụng để làm thức ăn và cải tạo môi trường nuôi trồng thủy sản

Sau khi được sử dụng trên diện tích NTTS, probiotic sẽ phát huy côngdụng theo những quá trình sau: khống chế sinh học (những nhóm vi sinh vật

có ích tác động đối kháng lên nhóm vi sinh vật gây bệnh) và xử lý sinh học (phân hủy các chất hữu cơ trong nước bằng sản phẩm tổng hợp của chúng)

Probitic được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho động vật trên cạn từ những năm 1970, cho thấy hiệu quả rõ rệt trong tăng trưởng và hệ miễn dịchcủa vật nuôi

Tuy nhiên, việc sử dụng probitic trong NTTS chỉ mới được đề cập đếntrong những năm gần đây

Yasudo và Taga (1980) đã chỉ ra rằng một loài vài vi khuẩn có ích không chỉ là thức ăn mà còn là yếu tố kiểm soát các dịch bệnh trên cá và

hoạt động tích cực tái tạo các chất dinh dưỡng trong môi trường Những nghiên cứu sau đó tiếp tục gia tăng

Kennedy (1998) sử dụng probiotic đối với ấu trùng cá đã nhận thấy có

sự gia tăng sức sống, tính đồng nhất và tỉ lệ tăng trưởng

Trong 1 báo cáo của Rengpipat (2003) ghi nhận sự tăng trưởng và khảnăng chống lại Vibrio của tôm sú đen khi sử dụng probiotic trong quá trình nuôi

Trong báo cáo CHIẾN LƯỢC QUẢN LÝ VÀ DINH DƯỠNG LÀM TĂNG SỨC KHỎE CON TÔM – công ty TNHH công nghệ sinh học ATC

đề cập những cơ chế ghi nhận hiệu quả của chế phẩn sinh học đối với sức khỏe tôm bao gồm: (1) loại bỏ vi khuẩn mang bệnh trong ruột non; (2) thànhphần màng tế bào của các vi khuẩn trong chế phẩm sinh học kích thích hệ miễn dịch bẩm sinh của tôm; (3) các enzym và các thành phần kháng khuẩn tạo ra từ chế phẩm sinh học sẽ triệt hại các vi khuẩn truyền bệnh

Douilett (1998) sử dụng probiotic trong môi trường nước nuôi cá và động vật giáp xác đã nhận xét probiotic làm sạch môi trường nước bằng cách giảm nồng độ các chất hữu cơ (organic materials – OM) và amoniac

Một số probiotic hiện đang được sử dụng trong các trang trại nuôi tôm

ở Indonexia như Multi bacter, Enviro star, Super NB… với mục đích phân giải các hợp chất hữu cơ từ phân và thức ăn thừa (Supryadi, 2000)

Theo Boyd (1995), các lý do để sử dụng probiotic trong môi trường nước bao gồm sự ngăn mùi, giảm thành phần tảo lục, tảo lam, giảm nitrate, nitrite, amoniac và phosphate, tăng lượng oxy hòa tan và nâng cao khả năng phân hủy chất hữu cơ

Qua những nghiên cứu và báo cáo đã được công bố, có thể tổng hợp những công dụng của probitic trong NTTS như sau:

- Đối với động vật thủy sinh:

+ Kích thích hệ miễn dịch, tăng sức đề kháng dịch bệnh

+ Cạnh tranh, đối kháng, tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh

+ Phân giải thức ăn trong hệ tiêu hóa của động vật thủy sinh làm tăng cường khả năng hấp thụ

- Đối với môi trường nước trong ao nuôi:

+ Phân hủy các chất hữu cơ là các chất thải của động thực vật thủy sinh Kết quả là làm giảm đáng kể lớp bùn, nhớt trong ao

+ Làm tăng lượng oxy hòa tan, giảm COD, BOD

+ Hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật gây ô nhiễm, tạo màu, gây mùi trong ao nuôi, kết quả là làm giảm màu và mùi hôi

+ Làm giảm lượng chất độc sinh ra do quá trình phân hủy không triệt

để các hợp chất hữu cơ

1.1.2 Tác hại của probiotic

Hiện nay chưa có báo cáo nào về tác hại của probiotic khi sử dụng trong NTTS

Thông thường, trong NTTS, một hàm lượng kháng sinh nhất định được bổ sung vào trong thức ăn và trong nước để diệt vi sinh vật gây bệnh

và kích thích tăng trưởng của vật nuôi Trong trường hợp lượng chất kháng sinh và hóa chất sử dụng dư thừa thì các chất này sẽ tích tụ trong thủy sản gây hại đến sức khỏe người tiêu dùng Probiotic là các sinh vật có lợi cho cả động vật và con người, do đó sản phẩm sau khi NTTS có sử dụng probiotic không có hại cho người

1.2 Vi khuẩn Lactic

Một trong những nhóm vi sinh vật được sử dụng phổ biến trong

probiotic là vi khuẩn Lactic

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae Các chủng vi khuẩn thuộc

nhóm này có đặc điểm sinh thái khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối giống nhau Tất cả đều có đặc điểm có đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, không di động, kỵ khí tùy nghi hay vi hiếu khí và không chứa các enzyme hô hấp như citochrom và catalase

Chúng thu nhận năng lượng nhờ quá trình phân giải hydrat cacbon và sinh ra axit lactic

Sinh sản bằng hình thức phân đôi tế bào

1.2.1 Phân loại vi khuẩn Lactic

Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống khác nhau: Streptococcus,

Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc Ngày nay người ta bổ sung vào

nhóm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium.

Trong giống Lactobacillus đã phân lập được các loài sau:

Lactobacillus acidophilus Lactobacillus brevis Lactobacillus casei Lactobacillus catenaforme Lactobacillus crispatus Lactobacillus fermentum Lactobacillus gassert Lactobacillus iners Lactobacillus jensenll Lactobacillus jeichmannll Lactobacillus oris

Lactobacillus parocasei spp.parocasei Lactobacillus plantarum

Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus ult

Lactobacillus vaginals

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thànhdạng hình cầu và hình que Kích thước của chúng thay đổi tùy từng loài.

- Giống Streptococcus có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tếbào 0.5-1µm Sau khi phân chia theo một phương chúng thường tồn tại ở dạng đơn bào, song cầu hoặc chuỗi ngắn

- Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính

từ 0.5-0.8µm và chiều dài khoảng 1.6µm trong một số điều kiện chúng cũng

có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1-3µm Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung

- Giống Lactobacillus có dạng hình que Tùy vào điều kiện của môi trường sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài Sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẽ

- Giống Pedicoccus là những tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn Có hoạt tính thủy phân protein rất yếu

- Giống Bifidobacterium là những trực khuẩn, khi mới phân lập có thể phân nhánh dạng chữ Y, V và tập hợp thành khối Sau nhiều lần cấy chuyền chúng trở thành dạng trực khuẩn dạng thẳng hoặc hơi uốn cong

1.2.3 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa

1.2.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Chúng không chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố

cở bản như cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu về một

số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ…

1 nhu cầu dinh dưỡng cacbon:

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các

monosaccarit ( glucoza, fructoza, manoza ), các disaccarit ( saccaroza,

lactoza, maltoza ) cho đến các polysaccarit ( tinh bột, dextrin )

Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấutrúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ

2 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sửdụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường

Các nguồn ni tơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,…Hiện nay cao nấm men

là nguồn ni tơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất tuy nhiên ở quy

mô công nghiệp không thể sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém

3 Nhu cầu về Vitamin:

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của

tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…

4 Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác:

Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu

cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ

Một số axit hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của

vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng cácmuối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic

Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác độngquan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

5 Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt,