Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi

Ở Việt Nam nhiều tác giả đã nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn gia súc, đặc biệt là enzyme từ các chủng vi sinh vật nhưng các kết quả nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế, cho nên

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT

TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH

TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm

đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi”

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài:

PGS TS Quyền Đình Thi

TS Đỗ Thị Tuyên

8727

Hà Nội - 2010

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT

TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH

TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm

đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi”

Chủ nhiệm đề tài

TS Đỗ Thị Tuyên PGS TS Quyền Đình Thi

Cơ quan chủ trì đề tài

Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

Hà Nội - 2010

MỤC LỤC

1 TỔNG QUAN 1

1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2

1.1.1 Cải thiện chất lượng và hiệu quả sử dụng enzyme 3

1.1.2 Tìm các nguồn enzyme mới 5

1.1.3 Tạo ra các enzyme tái tổ hợp với năng suất cao chất lượng mới 6

1.1.4 Chuyển gene mã hóa enzyme vào thực vật 8

1.2 Tình hình sản xuất enzyme bổ sung thức ăn gia súc trên thế giới 10

1.3 Hiệu quả của đa enzyme so với đơn enzyme 11

1.4 Những khác biệt về trình độ KH&CN trong nước và thế giới 12

1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước trong thời gian qua 12

1.5.1 Tình hình nghiên cứu các enzyme tái tổ hợp 15

1.5.2 Tình hình nhập khẩu và liên doanh sản xuất 15

1.5.3 Hiệu quả kinh tế của các enzyme bổ sung và mức độ an toàn 16

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

2.1 Chủng vi sinh vật 16

2.2 Nguyên liệu 17

2.3 Môi trường nuôi cấy 17

2.4 Vector biểu hiện 17

2.5 Hóa chất 18

2.6 Các bộ mồi 18

2.7 Xác định hoạt tính 19

2.7.1 Xác định hoạt tính glucanase 19

2.7.2 Xác định hoạt tính mannanase 20

2.7.3 Xác định hoạt tính subtilisin 21

2.7.4 Xác định hoạt tính xylanase 21

2.8 Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng tự nhiên sinh tổng hợp enzyme 21

2.8.1 Sinh tổng hợp glucanase 21

2.8.2 Sinh tổng hợp mannanase và xylanase 22

2.8.3 Sinh tổng hợp subtilisin 22

2.8.4 Xác định ảnh hưởng của các yếu tố lên hoạt tính enzyme 23

2.9 Các phương pháp sinh học phân tử 23

2.9.1 Phản ứng PCR 23

2.9.2 Thao tác cắt, gắn dính DNA và biến nạp hóa học 23

2.9.3 Biến nạp xung điện 23

2.9.4 Tách chiết RNA 23

2.9.5 Đọc trình tự DNA 24

2.9.6 Biểu hiện plasmid tái tổ hợp trong E coli BL21 24

2.9.7 Biểu hiện plasmid tái tổ hợp trong Aspergillus 24

2.9.8 Biểu hiện trong Pichia pastoris 24

2.9.9 Biểu hiện Xln tái tổ hợp 24

2.9.10 Tách chiết DNA tổng số từ Pichia pastoris 24

2.9.11 Phương pháp tách DNA từ nấm sợi 25

2.9.12 PCR dung hợp hai đoạn 26

2.9.13 Biến nạp vào Bacillus subtilis WB800 26

2.10 Phương pháp tách chiết protein 26

2.10.1 Tinh sạch protein tái tổ hợp 26

2.10.2 Điện di SDS-PAGE 26

2.11 Các phương pháp sản xuất enzyme tái tổ hợp 27

2.11.1 Lên men sản xuất glucanase 27

2.11.2 Lên men sản xuất mannanase 27

2.11.3 Lên men sản xuất subtilisin 27

2.11.4 Lên men sản xuất xylanase 27

2.11.5 Tạo chế phẩm enzyme thô 27

2.12 Các phương pháp thử nghiệm chế phẩm 28

2.12.1 Xác định độ an toàn, độ độc cấp tính và bán trường diễn 28

2.12.2 Đánh giá hiệu quả chế phẩm đơn enzyme 29

2.12.3 Đánh giá hiệu quả chế phẩm Vietzyme M 30

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Nội dung 1 Đánh giá các chủng tự nhiên sinh tổng hợp các enzyme 35

3.1.1 Glucanase tự nhiên 35

3.1.2 Manananase tự nhiên 40

3.1.3 Protease tự nhiên 48

3.1.4 Xylanase tự nhiên 50

3.2 Nội dung 2 Tạo các chủng vi sinh vật tái tổ hợp 62

3.2.1 Glucanase tái tổ hợp 62

3.2.2 Mannanase tái tổ hợp 69

3.2.3 Subtilisin tái tổ hợp 74

3.2.4 Xylanase tái tổ hợp 80

3.3 Nội dung 3 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm enzyme 94

3.3.1 Tạo nguyên liệu đầu vào 95

3.3.2 Quy trình công nghệ sản xuất subtilisin tái tổ hợp 96

3.3.3 Quy trình công nghệ sản xuất glucanase tái tổ hợp 99

3.3.4 Quy trình công nghệ sản xuất mannanase tái tổ hợp 102

3.3.5 Quy trình công nghệ sản xuất xylanase tái tổ hợp 105

3.3.6 Quy trình sản xuất chế phẩm đa enzyme (Vietzyme M) 109

3.4 Nội dung 4 Đánh giá chế phẩm đơn và đa enzyme 111

3.4.1 Đánh giá độ an toàn, độc tính cấp và bán trường diễn của chế phẩm 111

3.4.2 Hiệu quả của chế phẩm enzyme đơn trên gà Lương Phượng 113

3.4.3 Hiệu quả của chế phẩm đơn enzyme xylanase trên lợn con sau cai sữa 114

3.4.4 Hiệu quả của chế phẩm Vietzyme M trên gà Lương Phượng 115

3.4.5 Thử nghiệm hiệu lực của chế phẩm đa enzyme lên sự sinh trưởng của lợn ở các lứa tuổi 8-50kg 117

KẾT LUẬN 120

LỜI CÁM ƠN 121

KIẾN NGHỊ 121

TÀI LIỆU THAM KHẢO 121

BÁO CÁO TỔNG HỢP

1 TỔNG QUAN

Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 với mục tiêu xây dựng nền chăn nuôi an toàn sinh học, bền vững được đề ra trong bối cảnh ngành còn đối mặt với nhiều khó khăn Nhiều ý kiến cho rằng, quy mô nhỏ lẻ, bất cập trong khâu giống, phát triển vùng nguyên liệu cho chế biến thức ăn là “rào cản” khiến mục tiêu trên khó thành hiện thực Những năm qua, ngành chăn nuôi luôn giữ mức tăng trưởng cao, bình quân giai đoạn 2001-2006 tăng 8,5%/năm Giá trị sản xuất chăn nuôi năm 2006 tăng trưởng 7,3% so với năm 2005 Tuy nhiên, năm 2007 chỉ đạt 4,6%, tỷ trọng của ngành tăng 24,1% (giảm 1,4% so với năm 2006) Việt Nam là nước nông nghiệp nên các nguồn nguyên liệu từ phụ phế liệu của ngành công nghiệp chế biến nông sản rất lớn, nếu sử dụng được nguồn nguyên liệu này để sản xuất thức ăn chăn nuôi sẽ mang lại hiệu quả kinh tế và lợi thế hơn nhiều so với các nguyên liệu khác Một trong những hạn chế lớn nhất của sử dụng nguyên liệu từ phụ phế liệu nông nghiệp

để sản xuất thức ăn chăn nuôi là những nguyên liệu này có tỷ lệ xơ cao, chính vì nhiều xơ nên chúng có tỷ lệ tiêu hóa và giá trị năng lượng thấp Thú có dạ dày đơn khó tiêu hóa chất này

do không sản xuất đủ lượng enzyme nội sinh cần thiết Không những thế, chất xơ còn bao bọc các chất dinh dưỡng, hạn chế khả năng tiêu hóa, hấp thu dưỡng chất Trong môi trường ruột, chất xơ hòa tan gây tăng độ nhớt và giữ nước bao phủ các nhung mao ruột, làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu dưỡng chất của ruột

Ở Việt Nam nhiều tác giả đã nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn gia súc, đặc biệt

là enzyme từ các chủng vi sinh vật nhưng các kết quả nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế, cho nên việc áp dụng các sản phẩm enzyme trong nước trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi vẫn chưa được cơ sở sản xuất thức ăn quan tâm Nguyên nhân chủ yếu là do năng suất sinh tổng hợp của các enzyme tự nhiên còn thấp, chất lượng các enzyme tự nhiên không được cải biến bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại và hầu hết các chế phẩm enzyme bổ sung cho thức ăn chăn nuôi đã được các nhóm nghiên cứu đều ở dạng đơn enzyme Chính vì vậy, mục tiêu của đề tài này là tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp các enzyme trên với năng suất, hoạt lực cao; và cuối cùng là xây dựng được các quy trình sản xuất các enzyme tái tổ hợp và nguyên thủy năng suất cao và cuối cùng là lên men tạo chế phẩm đa enzyme bổ sung thức ăn cho gia súc

Enzyme thức ăn thường được gọi là enzyme ngoại sinh để phân biệt với enzyme nội sinh

là những enzyme sinh ra trong cơ thể Enzyme thức ăn làm tăng tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và năng suất động vật theo hai cơ chế: 1 Kết hợp với enzyme nội sinh, phân giải các hợp chất thành những chất có kích thước đủ nhỏ để động vật dễ hấp thu Như vậy, việc lựa chọn enzyme thức ăn sao cho có tác dụng hỗ trợ enzyme nội sinh trong việc phân giải chất dinh dưỡng của thức ăn là rất cần thiết; 2 Enzyme thức ăn phải giảm được độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa thức ăn, vì chính độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa cản trở sự hấp thu thức ăn Một vài hợp chất khi giải phóng khỏi vách tế bào đã hình thành các gel làm tăng độ nhớt trong ruột Thường các khẩu phần chứa nhiều polysaccharide không phải tinh bột (non-starch polysaccharide, NSP) gây ra hiện tượng này Động vật non, đặc biệt là gia cầm rất nhạy cảm với sự biến đổi độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa Để tăng cường hai cơ chế trên, enzyme thức ăn thường được sản xuất dưới dạng những chế phẩm đa enzyme để phân giải đồng thời nhiều hợp chất Ví dụ: nếu dùng β-glucanase thì chỉ phá vỡ được vách nội nhũ của hạt đại mạch mà không phân giải được protein chứa trong tế bào chất, để phân giải được protein trong lớp tế bào chất này phải cần thêm cả cellulase và pentosanase Ngoài ra, phải đặc biệt quan tâm tới mối quan hệ tương tác giữa enzyme với các nguyên liệu khác nhau trong khẩu phần

Trong dinh dưỡng động vật dạ dày đơn, việc bổ sung các chế phẩm enzyme trong khẩu phần được ứng dụng khá rộng rãi Tác dụng chính của chúng là cải thiện khả năng tiêu hóa, ngăn cản các tác hại của các chất kháng dinh dưỡng có trong khẩu phần, đồng thời giảm thiểu các chất dinh dưỡng dư thừa bài thải ra môi trường Từ đó sẽ góp phần cải thiện năng xuất vật nuôi, nâng cao hiệu qủa kinh tế và giảm ô nhiễm môi trường (Wen, 1992; Thacker, 1993; Thacker and Baas, 1996) Trong các khẩu phần cho động vật dạ dày đơn, ngũ cốc thường chiếm tỷ lệ khá lớn, từ 50-65% mà trong thành phần của chúng chứa các nhóm non-starch polysaccharide (NSP) (ß-glucan; arabino-xylans; pentosans; triticale) là những hợp chất cơ thể động vật không tiêu hóa được Ngoài ra chúng còn làm giảm khả năng tiêu hóa, hấp thu các chất dinh dưỡng khác do làm tăng độ nhớt của đường tiêu hóa (Campbell and Bedford,

1992; Friesen et al., 1992; Boros et al., 1995) Nhiều nghiên cứu đã chứng minh là bổ sung

hỗn hợp các enzyme xylanase; cellulose; alpha-amilase; protease vào trong khẩu phần ngũ cốc có tác dụng đáng kể trong việc cải thiện tăng trọng, giảm chi phí thức ăn, nâng cao tỷ lệ

tiêu hóa năng lượng, protein và acid amin trong khẩu phần so với không bổ sung (Gdala et

al., 1997; Yin et al., 2000; Barrera et al., 2003)

1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu trên thế giới về các enzyme sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi đã tiến được bước dài Những enzyme sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi đã được nhiều công ty hàng đầu trên thế giới sản xuất từ hai chục năm nay, đã được ứng dụng thường quy ở những nước công nghiệp phát triển như Mỹ, Tây/Đông Âu, Nhật Bản và Trung Quốc Tuy nhiên những nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi vẫn được tiếp tục theo một số hướng chính sau đây như Marquardt (Dept of Animal Science, University of Manitoba, Winnpeg, Manitoba R3T 2N2, Canada) và Brufau (IRTA, Department of Animal Nutrition, Centre de Mas Bove,

Apartat 41 5 Reus, Spain) nhận định trong bài tổng quan “Future of feed enzymes: Orientation and perspectives” đăng trên “CIHEAM - Options Mediterraneennes”.

Sử dụng enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi đã có một tác động mạnh mẽ tới việc sử dụng các nguyên liệu thức ăn trong ngành chăn nuôi động vật, đặc biệt trong gia cầm và đặc biệt với thức ăn ngũ cốc như lúa mạch và lúa mỳ Nghiên cứu và phát triển trong tương lai sẽ tiếp tục được ngành công nghiệp ủng hộ ở mức độ ngày càng tăng trong một lĩnh vực mở rộng Theo Marquardt và Brufau, một số lĩnh vực tương lai cần tiếp tục nghiên cứu sẽ là:

1 Cải thiện chất lượng và hiệu quả của các enzyme hiện có trên thị trường theo hướng quan tâm tới giá thành, độ bền nhiệt, chống chịu thủy phân và nâng cao hoạt tính trong các bộ phận đích của bộ máy tiêu hóa ruột – dạ dày

2 Mở rộng sử dụng enzyme trong thức ăn cho gia cầm, thú nuôi bản địa bao gồm các loại gia cầm khác gà, lợn, cá và thú ngoại như cá sấu, rùa, baba, ếch

3 Mở rộng ra các loại enzyme khác như lipase, protease, amylase, cũng như được sử dụng bằng công nghiệp công nghệ sinh học

4 Chọn lọc và thiết kế các nguồn lựa chọn khác về enzyme cải biến di truyền cho cơ chất và động vật đặc thù Bao gồm các enzyme được sản xuất trong vi sinh vật, hạt thực vật và ngay bản thân trong động vật bằng công nghệ DNA tái tổ hợp

5 Mở rộng phổ nguyên liệu làm thức ăn có thể được xử lý bằng enzyme

6 Phát triển và chuẩn hóa các qui trình để đánh giá các chế phẩm enzyme khác nhau

7 Tiếp tục nghiên cứu cách thức sao cho enzyme tạo ra được những tác dụng có lợi

8 Phát triển các mô hình để tiên đoán đáp ứng đối với các enzyme trong mọi lớp động vật chăn nuôi và với mọi nguyên liệu làm thức ăn để tạo điều kiện dễ dàng cho các nghiên cứu về giá thành – lợi nhuận

9 Nghiên cứu tác động của enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi làm giảm ô nhiễm môi trường, phân chia dinh dưỡng và thay đổi đáp ứng nội tiết tố và tình trạng sức khỏe của động vật

Rõ ràng nghiên cứu và sản xuất enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi sẽ không ngừng phát đạt, tăng tốc và thu được nhiều lợi nhuận Lĩnh vực hấp dẫn của nghiên cứu sẽ tập trung vào nghiên cứu và phát triển dinh dưỡng động vật trong tương lai

Các hướng nghiên cứu (1-3) là những hướng nghiên cứu tương đối cổ điển: đánh giá tác dụng của các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi thương mại hoặc các enzyme đang nghiên cứu trong phòng thí nghiệm lên năng suất chăn nuôi lợn, bò sữa, gà vịt, ngan ngỗng,

gà tây hoặc lên năng suất thu trứng và vắt sữa và mở rộng sang tất cả các động vật chăn nuôi còn lại như cừu, dê, ngựa, cá, rùa và tất cả các loại động vật chăn nuôi khác Các nghiên cứu này nhằm đánh giá từng enzyme đơn lẻ một hoặc đánh giá hiệu quả chăn nuôi khi bổ sung cùng một lúc nhiều enzyme khác nhau

Các nguồn lựa chọn khác về enzyme (4) bao gồm: (4.1): Tìm kiếm những các nguồn vi sinh vật mới tổng hợp ra các enzyme này, tối ưu nuôi cấy, lên men, sản xuất, tinh sạch và đánh giá tính chất hóa lý Hai hướng nghiên cứu tuy có vẻ cổ điển, nhưng họ sử dụng nhiều phương pháp hiện đại hơn để đánh giá chính xác hơn như sử dụng phương pháp phân tử 16S, 18S, 26S hoặc 28S rRNA để phân loại vi sinh vật, sử dụng các loại kít có cột sắc ký hoặc kích thước lỗ để tinh sạch enzyme sử dụng vào việc đánh giá tính chất hóa lý (4.2): Tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp từ các enzyme đã biết nhằm mục đích nâng cao năng suất hoặc tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cải biến từ những enzyme đã

có nhằm nâng cao hoạt tính thủy phân đặc hiệu (4.3): Nhắm tới một tương lai xa hơn là chuyển gene mã hóa các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi này vào những cây trồng để tạo

ra nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi sau này đã có sẵn các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi, mà không cần phải bổ sung nữa Đây là một hướng rất mới trong vòng dăm năm lại đây

Các hướng nghiên cứu liên quan tới enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi khác như (5) Mở rộng phổ nguyên liệu làm thức ăn; (6) Chuẩn hóa các qui trình đánh giá enzyme bổ sung thức

ăn chăn nuôi; (7) Tìm các ưu điểm khác của enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi; (8) Phát triển

mô hình để đáp ứng đối với enzyme bổ sung cũng như (9) Các nghiên cứu về giảm ô nhiễm môi trường sẽ không được đề cập trong phần tổng quan này do chúng ít liên quan hơn tới nội dung thực hiện đề tài

Ngoài ra cũng liên quan tới đề tài là tổng quan tình hình sản xuất các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi của các công ty trên thế giới Thông thường khi các nghiên cứu ở các hướng trên đã hoàn thiện, các nhà nghiên cứu đăng k ý patent và các công ty sản xuất enzyme thức ăn chăn nuôi họ săn lùng, mua bản quyền, sản xuất, tiếp thị và thương mại hóa sản phẩm Để có thể cạnh tranh tốt hơn, chính bản thân các công ty còn sẵn sàng đầu tư trực tiếp vào các nghiên cứu định hướng ứng dụng trong các trường đại học, các viện nghiên cứu để đón đầu các patent, hoặc họ cũng lập ra các viện nghiên cứu riêng độc lập

Có hàng nghìn công bố trên thế giới về các hướng nghiên cứu này Tuy nhiên để phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu trên thế giới, chúng tôi chỉ đưa ra những công trình tiêu biểu và cập nhật nhất để thấy rằng các hướng nghiên cứu này vẫn tiếp tục tồn tại song song với nhau

1.1.1 Cải thiện chất lượng và hiệu quả sử dụng enzyme

Trong một nghiên cứu của Barrera et al (2003) về khả năng tiêu hóa amino acid và chăn nuôi lợn bằng thức ăn bổ sung xylanase đã rút ra kết luận sự bổ sung xylanase vào thức ăn chăn nuôi trong đó lúa mỳ là nguồn cung cấp protein và năng lượng duy nhất đã cải thiện được các chỉ số AID (khả năng tiêu hóa rõ ràng ở ruột hồi, apparent ileal destibility) của

amino acid, ADG, và tỷ lệ thức ăn : tăng trọng; tuy nhiên, sự cải thiện này ít hơn khi bổ sung

amino acid tổng hợp (Barrera et al., 2003)

Omogbenigun et al (2004) đã bổ sung các chế phẩm đa enzyme vào thức ăn của lợn con

và thấy rằng các chế phẩm multienzyme đã cải thiện hiệu quả sử dụng dinh dưỡng và tốc độ sinh trưởng của lợn cai sữa Đây là công thức thân thiện môi trường và hiệu quả kinh tế cao

đối với thức ăn cho lợn con (Omogbenigun et al., 2004)

Cowieson và Adeola (2005) đã đánh giá các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi carbohydrase, protease, và phytase Họ thấy rằng các enzyme này có một tác dụng hỗn hợp trong thức ăn chăn nuôi gà giò khi đồng thời cho bổ sung cùng các enzyme với nhau Họ kết luận sử dụng phytase và XAP (xylanase, amylase, phytase) đồng thời trong thức ăn cho gà giò sẽ có hiệu quả kinh tế và có thể thu lợi nhuận khi chăn nuôi gia cầm (Cowieson and

Adeola, 2005) Sieo et al (2005) đã đánh giá mức độ ảnh hưởng của các chủng Lactobacillus

tái tổ hợp sinh tổng hợp β-glucanase lên các tính chất của hệ tiêu hóa và sự di chuyển thức ăn

ở gà giò Sự bổ sung các chủng Lactobacillus biến nạp vào thức ăn chăn nuôi đã cải thiện

được các tính chất của hệ tiêu hóa đồng thời nâng cao tốc độ di chuyển thức ăn trong ruột của

gà giò (Sieo et al., 2005)

Slominski et al (2006) đã sử dụng công nghệ enzyme để cải thiện tình trạng sử dụng

năng lượng từ các hạt có dầu cho gia cầm Họ đã đánh giá các công thức bổ sung enzyme riêng lẻ khác nhau và tổ hợp từ các enzyme cellulose, xylanase, glucanase, pectinase, mannanase Bổ sung carbohydrase đa hoạt tính có thể được sử dụng làm công thức để cải thiện tình trạng sử dụng năng lượng từ hạt lanh nhiều dầu, do đó nâng cao được giá trị dinh

dưỡng cho gia cầm (Slominski et al., 2006) Trong một nghiên cứu tương tự trước đó (Meng

et al 2006) nhưng đối với hạt cải dầu, họ kết luận mặc dù tác dụng enzyme lên tiêu hóa mỡ ở

hệ tiêu hóa ruột mề ở mức độ rất đáng kể, các chỉ số khác cũng cho thấy cải thiện đáng kể chỉ khi tỷ lệ thể vùi enzyme cao được sử dụng Số liệu này củng cố sự cần thiết bổ sung enzyme carbohydrase cho thức ăn gia cầm có hạt cải có nhiều dầu

Olukosi et al (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng liên quan tới thời gian chăn nuôi của dịch

chiết xylanase, amylase, và protease hoặc phytase đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau trong chăn nuôi gà giò Nghiên cứu này chỉ ra rằng sự kết hợp XAP (xylanase, amylase, và protease) và phytase đã cải thiện tình hình chăn nuôi Cả XAP lẫn phytase đều có hiệu quả trong việc cải thiện tiêu hóa phosphorus và duy trì gà giò hấp thụ dinh dưỡng bột ngô – đậu nành Số liệu này cũng cho thấy gà giò hấp thụ tốt hơn từ bổ sung enzyme ở độ tuổi non hơn và sự đóng

góp của enzyme vào việc lưu giữ dinh dưỡng giảm theo độ tuổi của gà giò (Olukosi et al.,

2007)

Nsereko et al (2002) đã nghiên cứu chế phẩm enzyme thủy phân xơ (xylanase và

glucanase) trong khẩu phần ăn của bò sữa cho thấy bổ sung enzyme thủy phân xơ tăng số lượng vi khuẩn dạ cỏ sử dụng các hemicellulose và sản phẩm thứ cấp của dịch thủy phân

cellulose (Nsereko et al., 2002)

Balci et al (2007) đã nghiên cứu tác động của các enzyme phân hủy chất xơ ngoại sinh

lên quá trình tích mỡ của bò đực Các kết quả thu nhận được từ nghiên cứu này cho thấy bò đực được cho ăn thức ăn bổ sung enzyme tăng trọng hàng ngày, tăng trọng tổng thể và tỷ lệ

chuyển hóa thức ăn cao hơn (Balci et al., 2007)

Mục đích nghiên cứu của Wu et al., 2005 là đánh giá tác dụng của β-mannanase lên gà Leghorns thương mại cho ăn thức ăn hạt đậu tương Sự chuyển hóa thức ăn trung bình của gà mái được cho ăn thức ăn năng lượng thấp bổ sung β-mannanase tương tự như gà mái cho ăn thức ăn năng lượng cao, và cả hai đều thấp hơn đáng kể so với gà mái cho ăn thức ăn năng lượng thấp không có β-mannanase Bổ sung β-mannanase tăng đáng kể sản xuất trứng và trọng lượng trứng trung bình của gà mái được cho ăn thức ăn năng lượng thấp Bổ sung β-

mannanase đã cải thiện sử dụng năng lượng của thức ăn đậu tương ngô bắp và có khả năng giảm giá thành thức ăn cho gà đẻ chứa β-mannan (Wu et al., 2005)

Trong một nghiên cứu, Ciftci et al (2005) đã đánh giá tác dụng của phytase vi khuẩn bổ

sung vào thức ăn chăn nuôi lên khối lượng thức ăn lấy vào, số lượng trứng đẻ và hiệu quả thức ăn trong gà mái đẻ trứng Tuy nhiên, trọng lượng gà trước và sau khi cho ăn rất giống nhau ở mọi lô thí nghiệm Nhưng bổ sung phytase vi khuẩn đã cải thiện được tỷ lệ đẻ trứng rõ

ràng (Ciftci et al., 2005)

Rengasayee et al (2005) đã tối ưu các thông số vận hành để sản xuất xylanase sử dụng

chủng tự nhiên Aspergillus bằng lên men mẻ chìm sử dụng thiết bị bán tự động Đây là thí

nghiệm đầu tiên sử dụng chủng nấm sợi để sản xuất enzyme ở Công ty Spic Biotech Ltd (nhà sản xuất chính các enzyme công nghiệp ở Ấn Độ), mà cho tới nay chỉ được sử dụng nuôi cấy vi khuẩn Sau khi lên men một số mẻ 200 lít để thu được các thông số về tốc độ khuấy, sục khí, pH, độ nhớt, thể tích, hoạt tính enzyme, nhiệt độ, họ đã nâng lên quy mô lên men

1500 lít rồi 9000 lít để sản xuất enzyme (Rengasayee et al., 2005)

1.1.2 Tìm các nguồn enzyme mới

Mặc dù trên thế giới đã có hàng trăm công ty sản xuất các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi và bán trên thị trường, nhưng các phòng thí nghiệm trên thế giới vẫn không ngừng nghiên cứu, tìm tòi các enzyme cùng loại nhưng từ những chủng chưa ai nghiên cứu tới để tìm ra các ưu thế vượt trội hoặc tìm ra các giải pháp thay thế, vướng mắc trong việc mua bán bản quyền, vần đề cạnh tranh giữa các công ty

Boyce và Walsh (2007) đã sản xuất, tinh sạch và đánh giá định hướng ứng dụng

β-glucanase từ Rhizomucor miehei DSM 1330 Họ sử dụng môi trường cám lúa mỳ cho sinh

trưởng và cảm ứng sinh tổng hợp β-glucanase ngoại bào từ R miehei Enzyme được tinh sạch đồng nhất Tính đặc hiệu cơ chất và độ tương đồng protein cho thấy đây là một endo-1,3(4)-β-glucanase (EC 3.2.1.6) Enzyme này có tiềm năng ứng dụng cho thức ăn chăn nuôi gia cầm Nó có hoạt tính đáng kể ở dãy pH pH 2,6-6,5 đặc trưng của bộ máy tiêu hóa loài chim Enzyme cũng bền nhiệt hơn các loại β-glucanase thương mại đang có, đặc biệt khi hâm nóng

ở nồng độ enzyme cao, và giữ được hoạt tính còn lại gấp hai lần so với những enzyme thương mại khi cho tiếp xúc ở các điều kiện của bộ máy tiêu hóa loài chim mô phỏng Trước đây, chưa có thông báo nào về sản xuất, tinh sạch và đánh giá β-glucanase từ Rhizomucor, và các tính chất hóa lý định hướng ứng dụng tạo cho enzyme này thích hợp để sử dụng trong thức ăn chăn nuôi (Boyce and Walsh, 2007)

Singh và Satyanarayana (2006) đã nghiên cứu sinh tổng hợp phytase bởi chủng nấm mốc

ưa nhiệt Sporotrichum thermophile trong lên men trạng thái rắn và ứng dụng của nó trong việc khử phytine của bánh dầu vừng Họ đã tìm ra chủng mốc S thermophile TLR50 có khả

năng sản xuất phytase trong mọi thành phần thức ăn chăn nuôi sử dụng thông thường được khảo sát ở mức độ khác nhau khi ủ men pha rắn Sản xuất enzyme tăng từ 180 U/g dư lượng mốc khô (dry moldy residue, DMR) trong bánh dầu vừng trong 120 giờ ở 45°C với tỷ lệ cơ chất – độ ẩm ban đầu 1:2,5 Bổ sung glucose và tiếp theo ammonium sulfate vào bánh dầu vừng làm cho phytase tiết ra cao hơn (282 IU/g DMR) Sinh tổng hợp phytase tăng lên 76% khi tối ưu Mốc tiết ra acid phosphatase, amylase, xylanase, và lipase cùng với phytase Nhờ hoạt tính của phytase, phosphate vô cơ được giải phóng có hiệu quả, dẫn tới khử phytate bánh dầu vừng (Singh and Satyanarayana, 2006)

Li et al (2006) đã tinh sạch và đánh giá tính chất β-mannanase từ Bacillus subtilis B36

pH và nhiệt độ tối ưu cho MANB36 là 6,4 và 50°C MANB36 tương đối bền nhiệt ở 60°C và hoạt tính riêng là 928 IU/mg Các cation kim loại (trừ Hg2+ và Ag+), EDTA và 2-mercaptoethanol (2-ME) không có tác dụng đối với hoạt tính enzyme Enzyme này có tính

đặc hiệu cao với locust bean gum (LBG) thay thế galactomannan (Li et al., 2006)

1.1.3 Tạo ra các enzyme tái tổ hợp với năng suất cao chất lượng mới

Hướng tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp có ba mục tiêu chính là nâng cao năng suất tổng hợp, hoạt tính riêng và chuyển enzyme sinh tổng hợp từ tế bào chủ gây độc sang tế bào chủ không độc hại đối với động vật chăn nuôi hoặc từ tế bào chủ khó lên men, môi trường đắt tiền sang tế bào chủ dễ lên men, tận dụng được các phế thải nông công nghiệp Các công trình về nhân dòng và biểu hiện các enzyme cùng loại với các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi trên thế giới thì nhiều vô kể, nhưng các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cũng được nhiều nhóm nghiên cứu nhân dòng, biểu hiện năng suất cao và đăng ký bản quyền Sau đây là những ví dụ thật tiêu biểu

Onderci et al (2006) đã đánh giá hiệu quả của E coli sinh tổng hợp α-amylase từ

Bacillus stearothermophilus sự phát triển, sử dụng thức ăn và hình thái của ruột non của gà giò cho ăn ngô Gà được uống nước E coli tái tổ hợp tăng trọng hằng ngày và cải thiện sự chuyển hóa thức ăn Cuối thí nghiệm, gà được uống nước chứa E coli ăn nhiều hơn, lớn

nhanh hơn và chuyển hóa thức ăn tốt hơn gà đối chứng không cho uống Sự hiện diện của vi khuẩn cũng cải thiện sự tiêu hóa các hợp chất hữu cơ Tuy nhiên, không có tác dụng đối với

dầu mỡ Bổ sung E coli làm giảm trọng lượng tụy tương đối, nhưng không ảnh hưởng trọng

lượng gan và độ dài của hệ thống ruột – mề Độ dài lông nhung và chân lông thì tăng lên đối với bổ sung vi khuẩn Sự có mặt của gene hemoglobin vi khuẩn không gây sự khác biệt nào

đáng kể mà quan sát thấy Số liệu này cho thấy bổ sung E coli có khả năng sinh tổng hợp

α-amylase đã cải thiện khả năng tiêu hóa thức ăn và tốc độ sinh trưởng của gà giò cho ăn ngô

(Onderci et al., 2006)

Sieo et al (2005) đã đánh giá sự ảnh hưởng của các chủng tái tổ hợp Lactobacillus sinh

β-glucanase lên các tính chất hệ thống tiêu hóa và tốc độ đưa thức ăn ở gà giò Bổ sung các

chủng Lactobacillus biến nạp vào thức ăn gà giò làm giảm đáng kể độ keo nhớt dịch ruột 46% so với gà cho ăn thức ăn không được bổ sung hoặc bổ sung các chủng Lactobacillus tự

21-nhiên Trọng lượng tương đối của tụy, gan, hệ thống ruột mề, ruột kết giảm 6-27%, và độ dài tương đối của hệ thống ruột mề giảm 8-15% Kiểm tra mô học của các mô tiêu hóa ruột mề

cho thấy rằng chiều cao lông nhung ruột của gà được cho ăn với các chủng Lactobacillus cao hơn đáng kể so với gà cho ăn kiểu khác Các chủng Lactobacillus biến nạp giảm thời gian thức ăn đi 2,2 giờ Bổ sung các chủng Lactobacillus tái tổ hợp vào thức ăn đã cải thiện các tính chất hệ thống tiêu hóa và thời gian đi của thức ăn trong gà giò (Sieo et al., 2005)

Liu et al (2006) đã biểu hiện thành công peptide trưởng thành của xylanase A chủng Aspergillus niger (AnxA) trong Pichia pastoris với năng suất cao dưới sự kiểm soát của AOX1 promoter AnxA tái tổ hợp (reAnxA) được tiết vào môi trường nuôi cấy Sau 96 giờ

cảm ứng 0,25% methanol, hoạt tính reAnxA trong dịch nuôi cấy đạt đỉnh cao, 175 IU/mg, gấp 1,9 lần so với protein tự nhiên AnxA (92 IU/mg) Nhiệt độ và pH tối ưu của reAnxA lần lượt là 50°C và 5 reAnxA bền ở dãy pH rộng 3-8 Sau khi ủ ở pH 3-8, 25°C trong 1 giờ, hoạt tính còn lại của reAnxA đều trên 80% Các giá trị Km và kcat đối với reAnxA lần lượt là 4,8 mg/ml và 123,2/s Phân tích HPLC cho thấy rằng xylotriose là sản phẩm thủy phân chủ yếu

của xylan bạch dương và từ cám không tan bởi reAnxA (Liu et al., 2006)

Chantasingh et al (2006) đã nhân dòng và đọc trình tự gene xylanase đầy đủ, mã hóa 326 amino acid thuộc họ glycosyl hydrolase nấm số 10, từ Aspergillus terreus BCC129 25 amino

acid đầu tiên của enzyme này là một peptide tín hiệu Gene xylanase trưởng thành 906 bp được nhân dòng vào vector pPICZαA biểu hiện ở P pastoris Băng 33 kDa xuất hiện trên SDS-PAGE gel sau một ngày cảm ứng methanol Enzyme biểu hiện được tinh sạch bằng sắc

ký lọc gel Xylanase tái tổ hợp tinh sạch cho hoạt tính tối ưu ở 60°C, pH 5 và Km 4,8±0,07 mg/ml và Vmax 757±14,54 µmol/phút mg, sử dụng xylan bạch dương làm cơ chất Ngoài ra, enzyme tinh sạch có độ bền pH rộng 4-10 khi ủ ở 40°C trong 4 giờ (Chantasingh et al.,

2006) Enzyme này giữ được 90% hoạt tính khi ủ ở 50°C, 30 phút Nó có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thức ăn chăn nuôi và bột giấy

α- amylase (EC 3.2.1.1) từ chủng Gram dương Alicyclobacillus acidocaldarius là một

enzyme ưa acid nhiệt, với nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 75°C và 3 (Yuan et al., 2005)

Trình tự nucleotide của gene amy được nhân dòng bằng PCR Gene amy (3901bp) gồm một

khung đọc mở mã hóa một polypeptide (1301 aa) Khối lượng tính toán của α-amylase AMY

~140 kDa Gene amy được biểu hiện ở E coli BL21 (DE3) và P pastoris đều có hoạt tính sinh học Hoạt tính amylase biểu hiện trong P pastoris được chứng minh bằng nhuộm hoạt

tính amylase α-amylase biểu hiện trong P pastoris được tinh sạch và đánh giá tính chất Khối lượng phân tử rõ ràng ~160 kDa trên SDS-PAGE pH tối ưu của enzyme là pH 3,2 như enzyme tự nhiên; nhưng nhiệt độ tối ưu là 65°C thấp hơn một chút so với enzyme tự nhiên Khoảng 50% hoạt tính tương đối giữ được sau khi ủ 30 phút ở 70°C Như vậy enzyme biểu

hiện trong P pastoris cũng là ưa acid nhiệt Ngoài ra trình tự được nhân dòng bằng PCR, nằm từ +1174 bp đến +3288 bp trên gene amy, mã hóa 705 aa với khối lượng phân tử tính toán 79 kDa Gene cắt bới đầu amy' được biểu hiện trong E coli BL21 (DE3), cảm ứng bởi 1

mM IPTG, cũng giữa nguyên hoạt tính α-amylase

Phytase có thể làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn khi giải phóng ra phosphate vô cơ

từ phytate, dạng dự trữ chính của phosphorus ở thực vật Phytase (phyC) từ chủng Bacillus subtilis VTT E-68013 được biểu hiện ở Lactobacillus plantarum chủng 755 sử dụng tín hiệu tiết từ Lact amylovorus (Kerovuo and Tynkkynen, 2000) Trong dịch nuôi cấy qua đêm trong

môi trường MRS chứa cellobiose để cảm ứng α-amylase promoter, phytase hoạt động xúc tác được tiết ra như một protein ngoại bào chủ yếu Tuy nhiên, phân tích lai Western cho thấy phytase được cải biến và không cải biến trong dịch tế bào Các thí nghiệm xung đuổi chỉ ra

rằng phytase tái tổ hợp được tiết ở tốc độ chậm hơn so với các protein tự nhiên của Lact plantarum 755

Năm 2006, Li et al đã đọc trình tự, nhân dòng gene và biểu hiện β-mannanase chủng

Bacillus subtilis B36 trong E coli MANB36 Gene mã hóa MANB36, manB36, được nhân dòng bằng PCR và đọc trình tự manB36 chứa một khung đọc mở (ORF) gồm 1104 bp mã

hóa cho một protein dài 367 aa Khối lượng phân tử dự tính 38,13 kDa, tính theo protein suy

diễn của gene manB36 không có peptide tín hiệu, phù hợp với khối lượng phân tử rõ ràng 38

kDa của MANB36 tinh sạch được ước lượng bằng SDS-PAGE Protein chín MANB36 được

biểu hiện trong E coli BL21 và mannanase biểu hiện có hoạt tính sinh học bình thường (Li et al., 2006)

Không chỉ dừng ở mức độ tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp, các nhóm nghiên cứu trên thế giới còn đi xa hơn một bước nữa là cải biến các enzyme đang có bằng các công nghệ DNA tái tổ hợp và công nghệ protein Ở đây, chúng tôi đưa ra ví dụ thật

tiêu biểu theo hướng này, đó là các công trình của (Teng et al., 2007 ) về cải tạo các codon

của gene mã hóa β-1,3-1,4-glucanase tái tổ hợp từ Bacillus licheniformis EGW039 để biểu

hiện năng suất cao trong P pastoris (Teng et al., 2007 ) và công trình thứ hai của (Yang et al., 2006 ) tạo ra xylanase TB dung hợp từ đầu C của Streptomyces olivaceoviridis xylanase XYNB với đầu N của Thermomonospora fusca xylanase TfxA (Yang et al., 2006 )

Beta-1,3-1,4-glucanase (EC3.2.1.73), một enzyme công nghiệp quan trọng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men và bổ sung thức ăn chăn Để cải thiện hiệu quả biểu hiện của β-glucanase tái tổ hợp từ B licheniformis EGW039 (CGMCC 0635) trong P pastoris GS115 chuyển hóa gốc methyl, trình tự DNA mã hóa β-glucanase được thiết kế và tổng hợp

dựa vào hệ thống codon của P pastoris, các codon mã hóa 96 amino acid được tối ưu, trong

đó 102 nucleotide được thay đổi, tỷ lệ G+C được tăng lên đồng thời từ 43,6 lên 45,5% (Teng

et al., 2007 ) Ở mức độ bình lắc, hoạt tính β-glucanase lần lượt là 67,9 và 52,3 IUml/1 với

beta-glucan lúa mạch và lichenan làm cơ chất Ở quy mô lên men phòng thí nghiệm, nồng độ protein tiết ra vào khoảng 250 mg/l Hoạt tính β-glucanase lần lượt là 334 và 257 IU/ml với beta-glucan lúa mạch và lichenan làm cơ chất; tuy nhiên, không hoạt tính enzyme về cellulose được quan sát thấy So với đối chứng không tối ưu, mức độ biểu hiện của β-

glucanase tối ưu dựa trên các codon thích hợp trong P pastoris cao gấp 10 lần Enzyme được

tối ưu codon chiếm khoảng 53,8% protein tiết ra tổng số Độ acid và nhiệt độ và tối ưu của enzyme tái tổ hợp này lần lượt là pH 6 và 45°C

Xylanase TB lai được thiết kế bằng cách thay thế phân đoạn đầu N của S olivaceoviridis xylanase XYNB với vùng tương ứng của Thermomonospora fusca xylanase TfxA (Yang et al., 2006 ).Gene lai tb, mã hóa TB, được biểu hiện đúng ở E coli BL21 và P pastoris

GS115 TB được tinh sạch và đánh giá tính chất Nhiệt độ và pH tối ưu của TB là 70°C và 6,

rõ ràng được cải thiện hơn so với XYNB Độ bền nhiệt TB cao gấp 6 lần so với XYNB sau khi ủ các dịch enzyme ở 80°C và 90°C trong 3 phút Độ bền pH của TB thấp hơn 5-9 lần so với của XYNB Tuy nhiên, TB vẫn có hoạt tính riêng cao như XYNB Phân tích độ tương đồng trình tự để tìm ra các yếu tố ảnh hưởng tới tính chất và mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của enzyme TB

1.1.4 Chuyển gene mã hóa enzyme vào thực vật

Có thể nói ý tưởng chuyển gene mã hóa enzyme bổ sung trực tiếp vào thực vật, nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi sau này là một ý tưởng hay, đón đầu tương lai Trong một tương lai gần, ngay bản thân nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi đã chứa rất nhiều enzyme bổ sung thức

ăn chăn nuôi rồi, thì người ta không còn phải sản xuất enzyme bổ sung riêng nữa Hiện nay, trên thế giới người ta đã tiến rất sâu theo hướng nghiên cứu này, tới giai đoạn đánh giá các loại thức ăn đã chuyển gene mã hóa enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi lên năng suất chăn nuôi động vật

Giá trị dinh dưỡng thấp của hạt lúa mạch đối với gia cầm là nguyên nhân của sự vắng mặt của một enzyme ruột để khử polymer hiệu quả (1, 3-1,4)-beta-glucan, một polysaccharide chính trong thành tế bào nội nhũ Điều này dẫn tới độ nhớt cao trong ruột, hạn chế hấp thụ dinh dưỡng, làm giảm tốc độ sinh trưởng, và phân gia cầm keo dính mất vệ sinh dính vào gia cầm và nền chuồng trại chăn nuôi Cho nên, 7,5 tỷ gà giò sản xuất hàng năm ở Hoa Kỳ được

nuôi chủ yếu bằng thức ăn ngô và đậu nành (von Wettstein et al., 2000)

Với l ý do trên, họ đã cải thiện thức ăn lúa mạch cho gà giò với mạch nha chuyển gene chứa (1,3-1,4)-β-glucanase bền nhiệt Họ đã bổ sung vào lúa mạch bình thường 6,2% mạch nha chuyển gene chứa β-glucanase ưa nhiệt (4,28 µg/g protein hòa tan) cung cấp đạt trọng lượng tương đương với thức ăn ngô Số gà đi phân dính đã giảm hẳn Ruột và phân của gà cho ăn lúa mạch đối chứng chứa một hàm lượng lớn (1,3-1,4)-β-glucan hòa tan, và lần lượt

giảm xuống 75 và 50% khi bổ sung mạch nha chuyển gene vào thức ăn (von Wettstein et al.,

2000) Hàm lượng enzyme tái tổ hợp hoạt động trong ruột non tương ứng với sự có mặt trong thức ăn, cao gấp 11 lần trong manh tràng và 7,5 trong phân Beta-glucanase glycosyl hóa phân lập từ manh tràng có nguồn gốc từ mạch nha chuyển gene Như vậy có thể đưa các enzyme tái tổ hợp riêng lẻ từ mạch nha chuyển gene vào nhiều bộ phận khác nhau của bộ máy tiêu hóa ruột-mề của gà và đánh giá hiệu quả trao đổi chất của thành phần đã trộn

enzyme đích (von Wettstein et al., 2000)

Thức ăn là lúa mạch bình thường bổ sung lúa mạch chuyển gene biểu hiện β-glucanase ưa

nhiệt cải biến từ Bacillus trong quá trình nảy mầm có thể tăng trọng lượng gà giò so với thức

ăn ngô hạt Nó cũng giảm mạnh số gà đi phân dính, nhưng chưa loại hoàn toàn phân dính

Trong một nghiên cứu tiếp theo von Wettstein et al (2003) đã xác định xem liệu hàm lượng

mạch nha chuyển gene cao hơn có thể giảm tiếp phân dính không Một mục tiêu khác nhằm nghiên cứu khả năng sử dụng hạt chuyển gene β-glucanase ưa nhiệt trưởng thành bổ sung

thức ăn và so sánh thức ăn chứa hạt chuyển gene với thức ăn được bổ sung một hàm lượng glucanase thương mại nhất định

β-Bổ sung 75 hoặc 151 g/kg mạch nha chuyển gene chứa 4,7 hoặc 98 mg/kg β-glucanase ưa nhiệt vào 545 hoặc 469 g/kg lúa mạch không chuyển gene làm tăng trọng lượng gà giò Cornish Cross như thức ăn ngô sử dụng hiện nay Gene mã hóa enzyme được biểu hiện trong hạt aleurone với một promoter của gene α-amylase lúa mạch và enzyme được tổng hợp với

peptide tín hiệu để tiết vào nội nhũ của hạt mạch nha (von Wettstein et al., 2003).

Trọng lượng cũng đạt tương đương khi cho thức ăn bao gồm 39 g/kg hạt lúa mạch chuyển gene (chứa 66 mg/kg β-glucanase ưa nhiệt) và 581 g/kg lúa mạch không chuyển gene thay cho ngô hạt Ở đây, gene mã hóa enzyme được biểu hiện với promoter của gene D-hordein

(Hor3-1) trong quá trình chín hạt Enzyme được tổng hợp dưới dạng tiền thân có peptide tín

hiệu vaccine đi qua lưới nội chất vào các không bào dự trữ Enzyme được cất dưới dạng protein dự trữ prolamin của nội nhũ, bảo vệ nó không bị phân hủy trong quá trình tế bào chết theo lập trình của nội nhũ ở giai đoạn cuối của quá trình chín hạt và tạo ra độ bền nhiệt khác thường Một lượng lớn β-glucanase hoạt tính cao trong hạt chín cho phép giảm thành phần hạt chuyển gene xuống còn 0,2 g/kg thức ăn như các muối khoáng được bổ sung vào thức ăn

chuẩn (von Wettstein et al., 2003)

Bổ sung hạt chuyển gene (1 g/kg thức ăn) và bổ sung enzyme thương mại Avizyme 1100 (1 g/kg) cho trọng lượng, tiêu hao thức ăn và hiệu quả thức ăn tương đương ở gà giò cho ăn thức ăn hạt lúa mạch Đặc tính ỉa phân dính ở gà giò được loại bỏ với cả 9 thí nghiệm thức ăn

và giảm xuống mức quan sát thấy với thức ăn ngô chuẩn khi bổ sung lúa mạch chuyển gene

(von Wettstein et al., 2003) Sự tăng trọng tốt và sống sót bình thường của 400 gà giò kiểm

tra trên thức ăn lúa mạch được bổ sung hạt chuyển gene hoặc mạch nha chỉ ra rằng hạt và mạch nha đều không độc hại

Thức ăn hạt lúa mạch với hạt hoặc mạch nha chuyển gene bổ sung có β-glucanase ưa nhiệt là một lựa chọn thân thiện môi trường so với bổ sung enzyme, do nó sử dụng năng lượng quang tổng hợp để sản xuất enzyme trong hạt vì vậy tránh sử dụng năng lượng không

phục hồi được để lên men (von Wettstein et al., 2003) Việc cất enzyme trong các thể protein

của hạt trên cánh đồng tạo ra các qui trình bọc làm ổn định hoạt tính enzyme Thức ăn lúa mạch với hàm lượng nhỏ hạt chuyển gene như phụ gia của lúa mạch bình thường tạo ra một lựa chọn cho thức ăn gà giò ở những nơi mà ngô hạt không phát triển được vì các điều kiện khí hậu hoặc do đất đai không phù hợp và vì vậy phải nhập khẩu ngô

Phytate là dạng dự trữ chính của phosphorus trong nhiều hạt thực vật, nhưng phosphate liên kết ở dạng này không có tác dụng cho động vật dạ dày đơn Phytase, một enzyme thủy phân phosphate từ phytate, có khả năng tăng cao tiêu hóa phosphorus trong thức ăn động vật

khi đưa vào hạt gạo như là thức ăn bổ sung (Hong et al., 2004) Hai gene, có nguồn gốc từ vi khuẩn dạ cỏ Selenomonas ruminantium (SrPf6) và Escherichia coli (appA), mã hóa các

phytase hoạt tính cao được biểu hiện trong hạt lúa chuyển gene nảy mầm Biểu hiện phytase được khảo sát bởi một promoter của gene α-amylase (alphaAmy8) cảm ứng nảy mầm, và tiết phytase ngoại bào được định hướng bởi trình tự tín hiệu peptide betaAmy8 Hai phytase được biểu hiện rõ ràng ở hạt lúa chuyển gene nẩy mầm và trong một kiểu được kiểm soát tạm thời

và đặc hiệu mô Không quan sát thấy một tác dụng có hại nào lên sự phát triển thực vật hoặc

hình thành hạt (Hong et al., 2004). Hoạt tính phytase tới 0,6 và 1,4 IU/mg protein tế bào chiết tổng số thu được trong lúa chuyển gene nẩy mầm biểu hiện phytase appA và SrPf6, tương ứng, cao gấp 46-60 lần hoạt tính phytase so với hoạt tính không chuyển gene Phytase appA và SrPf6 sinh tổng hợp trong hạt lúa chuyển gene nẩy mầm có hoạt tính cao trong dãy

pH 3,0-5,5 và 2,0-6,0, tương ứng Mức độ phytase và di truyền trong lúa chuyển gene chỉ trong những cây biểu hiện cao là ổn định qua bốn thế hệ Các hạt lúa chuyển gene nẩy mầm, sinh tổng hợp một phytase tái tổ hợp hoạt tính cao rất giàu các enzyme thủy phân, dinh dưỡng

và muối khoáng, có thể là thức ăn bổ sung lý tưởng để cải thiện tiêu hóa phytate-phosphorus trong động vật dạ dày đơn

Yang et al (2007) đã biểu hiện xylanase với hoạt tính riêng cao từ Streptomyces olivaceoviridis A1 trong cây khoai tây chuyển gene (Solanum tuberosum L.) Protein tái tổ

hợp XYNB đạt tới 5% protein lá hòa tan tổng số trong tế bào chất Trong dịch chiết thân và

lá, hoạt tính xylanase đạt tới 87 µM/min/g lá tươi (9,7 µM/min/mg protein hòa tan tổng số) Xylanase bền ở 60°C và 70°C trong đệm pH 5,2 tới 5 phút Hơn nữa, hoạt tính xylanase giữ nguyên không thay đổi qua nhiều thế hệ khoai tây Những kết quả này chứng minh rằng khoai tây chuyển gene có thể được sử dụng để sản xuất ra xylanase với hoạt tính enzyme riêng cao và có thể là một giải pháp khác đối với cách bổ sung xylanase ngày nay vào thức ăn

chăn nuôi (Yang et al., 2007)

1.2 Tình hình sản xuất enzyme bổ sung thức ăn gia súc trên thế giới

Novozymes A/S có thể nói là một trong những công ty hàng đầu trên thế giới sản xuất các loại enzyme công nghiệp trong đó có công nghiệp bột giặt, công nghiệp dệt, công nghiệp thuộc da, công nghiệp chế biến thực phẩm và công nghiệp sản xuất enzyme bổ sung thức ăn gia súc Trong dòng enzyme bổ sung thức ăn gia súc phải kể đến các loại Ronozyme® mà hãng sản xuất chứa một trong các enzyme xylanase, protease, glucanase, phytase, pectinase, amylase, cellulose (www.novozymes.com) Theo danh mục hàng hóa nhập khẩu vào Việt Nam của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (90/2006/QĐ-BNN ngày 02/10/2006), các sản phẩm này được phép nhập về Việt Nam

Công ty hóa chất lớn của Đức BASF cũng sản xuất rất nhiều chế phẩm enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi như các loại Natuphos® và Natugrain® chứa phytase và xylanase tương ứng (www.nutrition.basf.com) Các sản phẩm thương mại được đóng gói dưới dạng khô hoặc dịch lỏng

Công ty sản xuất enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi lớn khác trên thế giới là Danisco Animal Nutrition (Đan Mạch, Anh Quốc, www.danisco.com) với các dòng sản phẩm Avizyme, Grandazym, Porzyme chứa enzyme đơn hoặc các tổ hợp enzyme khác nhau bao gồm xylanase, glucanase, subtilisin, amylase, pectinase

Vào năm 1975, một công ty của Mỹ US Kcmlri Co khởi động với enzyme thức ăn gia súc thương mại Kể từ khi một công ty của Phần Lan tên là Finnfeed

International of Cultor Group Finland (ngày nay Danisco Animal Nutrition) lần đầu tiên ứng dụng β-glucanase enzyme trong thức ăn gia cầm vào giữa những năm 1980, các enzyme thức ăn gia súc đã được sử dụng ngày càng tăng lên bởi công nghiệp thức ăn gia súc toàn cầu (Mo, 1997) và ngày nay đã trở thành một lớp phụ gia thức ăn gia súc quan trọng Vào năm

1998, giá trị enzyme hàng 150 triệu dollar Mỹ đã được bổ sung vào khoảng 10% thức ăn gia súc dạ dày đơn toàn cầu

Enzyme thức ăn gia súc được đưa vào Trung Quốc vào năm 1989, và sau những năm phát triển thị trường, nó đã được chấp nhận rộng rãi vào năm 2000 bởi rất nhiều công ty trong công nghiệp chăn nuôi gia súc và đạt tốc độ phát triển nhanh trong năm 2003

Tuy nhiên tốc độ phát triển các enzyme thành phần bắt đầu ứ lại vào năm 2004, trong khi phytase bắt đầu trải qua phát triển bùng nổ, trở thành enzyme được tìm kiếm nhiều nhất sau phụ gia thức ăn gia súc trong ba năm liền

Nhu cầu tiêu thụ hàng năm của các enzyme thức ăn gia súc vào năm 2006 đạt 20,100 tấn 12,800 tấn enzyme thành phần được sử dụng (giảm nhẹ 1,5% so với 2005) chế biến 14,44 triệu tấn thức ăn gia súc, thâm nhập thị trường 14,7% (như năm 2005)

Đối với các enzyme đơn vị riêng lẻ, 1.700 tấn đã được sử dụng (tăng cao 79%) trong khi hàm lượng phytase được sử dụng là 5.600 tấn (có tốc độ sinh trưởng là 24,4%) 33,54 triệu tấn thức ăn gia súc được chế biến, một sự gia tăng thị trường 34,1% (giảm nhẹ so với 2005) Giá trị thị trường của enzyme thức ăn gia súc Trung Quốc đạt 464 triệu nhân dân tệ (928

tỷ VNĐ) vào năm 2006, trong đó enzyme thành phần đạt giá trị 262 tỷ Nhân dân tệ (tăng 2,34% so với 2005) Phytase mà đã tăng lên khủng khiếp chỉ có một giá trị thị trường 143 triệu Nhân dân tệ (giảm 18,8% so với 2005)

1.3 Hiệu quả của đa enzyme so với đơn enzyme

Sau hơn hai mươi năm sản xuất và ứng dụng enzyme thức ăn chăn nuôi trong chăn nuôi gia súc và gia cầm, người ta đã nghiên cứu, sản xuất và đánh giá hiệu quả của các chế phẩm

đa enzyme cao hơn so với các chế phẩm đơn enzyme Omogbenigun et al (2004) đã bổ sung

các chế phẩm đa enzyme vào thức ăn của lợn con và thấy rằng các chế phẩm multienzyme đã cải thiện hiệu quả sử dụng dinh dưỡng và tốc độ sinh trưởng của lợn cai sữa Đây là công thức thân thiện môi trường và hiệu quả kinh tế cao đối với thức ăn cho lợn con

(Omogbenigun et al., 2004)

Cowieson và Adeola (2005) đã đánh giá các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi carbohydrase, protease và phytase Họ thấy rằng đa enzyme này có một tác dụng hỗn hợp trong thức ăn chăn nuôi gà giò khi đồng thời cho bổ sung cùng các enzyme với nhau Họ kết luận sử dụng phytase và XAP (xylanase, amylase, phytase) đồng thời trong thức ăn cho gà giò sẽ có hiệu quả kinh tế và có thể thu lợi nhuận khi chăn nuôi gia cầm (Cowieson and Adeola, 2005)

Slominski et al (2006) đã sử dụng công nghệ enzyme để cải thiện tình trạng sử dụng năng lượng từ các hạt có dầu cho gia cầm Họ đã đánh giá các công thức bổ sung enzyme riêng lẻ khác nhau và tổ hợp từ các enzyme cellulase, xylanase, glucanase, pectinase, mannanase Kết quả nghiên cứu này cho thấy rằng bổ sung carbohydrase đa hoạt tính có thể được sử dụng làm công thức để cải thiện tình trạng sử dụng năng lượng từ hạt lanh nhiều dầu,

do đó nâng cao được giá trị dinh dưỡng cho gia cầm (Slominski et al., 2006) Trong một nghiên cứu tương tự trước đó (Meng et al., 2006) nhưng đối với hạt cải dầu, họ kết luận mặc

dù tác dụng enzyme lên tiêu hóa mỡ ở hệ tiêu hóa ruột mề ở mức độ rất đáng kể, các chỉ số khác cũng cho thấy cải thiện đáng kể chỉ khi tỷ lệ thể vùi enzyme cao được sử dụng Số liệu này củng cố sự cần thiết bổ sung carbohydrase cho thức ăn gia cầm có hạt cải có nhiều dầu

Olukosi et al (2007)đã nghiên cứu ảnh hưởng liên quan tới thời gian chăn nuôi của dịch chiết xylanase, amylase, và protease hoặc phytase đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau trong chăn nuôi gà giò Nghiên cứu này chỉ ra rằng sự kết hợp XAP (xylanase, amylase, và protease) và phytase đã cải thiện tình hình chăn nuôi Cả XAP lẫn phytase đều có hiệu quả trong việc cải thiện tiêu hóa phosphorus và duy trì gà giò hấp thụ dinh dưỡng bột ngô – đậu nành Số liệu này cũng cho thấy gà giò hấp thụ tốt hơn từ bổ sung enzyme ở độ tuổi non hơn và sự đóng

góp của enzyme vào việc lưu giữ dinh dưỡng giảm theo độ tuổi của gà giò (Olukosi et al.,

2007)

Với những ưu thế của các chế phẩm đa enzyme so với các chế phẩm đơn enzyme, cho nên các công ty sản xuất enzyme thức ăn chăn nuôi đã sản xuất và tung ra thị trường các dòng sản phẩm đa enzyme (gồm cellulase, amylase, phytase, β-glucanase, pectinase, protease) như Nutri-Zym™ Dry, Nutri-Zym™ S Dry (Nutri-AD International NV., Bỉ); Ferm MOS, Nutragen-P (Nutribios Corporation, Canada); Natuphos® Combi L, Natugrain® Blend (BASF, Đức); Allzyme™ DDG (Alltech Inc; Mỹ); Enzite, Laczyme, XYLAN 500 (International Nutrition; Mỹ); Luctazyme Pro-Pig (Lucta S.A., Tây Ban Nha); Complex-Enzyme For Forage (Makata) (Haofa Bioengineering Exploitation Co Ltd., Trung Quốc);

Hing efficiemcy Compound Enzymes (Nanning Dazhihuang Fovage Products Co., Ltd., TQ) (90/2006/QĐ-BNN ngày 02/10/2006)

1.4 Những khác biệt về trình độ KH&CN trong nước và thế giới

Trong 9 hướng nghiên cứu về enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi trên thế giới hiện nay và trong tương lai gần thì Việt Nam có một khoảng cách rất xa so với họ Có một số hướng Việt Nam đã thực hiện trong một thời gian tương đối dài là phân lập các chủng vi sinh vật tự nhiên, nuôi cấy, sinh tổng hợp enzyme rồi đánh giá tác dụng của những enzyme này tới năng suất chăn nuôi khi bổ sung vào thức ăn Tuy nhiên các phương pháp chuẩn, sử dụng thiết bị hiện đại và hóa chất tinh khiết để đánh giá hoạt tính cũng như tác dụng của chúng lên năng suất và chất lượng vật nuôi ở Việt Nam thường chưa được áp dụng Do đó, ngay trong hướng

đi này, chúng ta vẫn còn cách xa Cụ thể là các công trình trong nước không đủ khả năng để công bố trên các tạp chí quốc tế vì hàm lượng khoa học thấp Thứ hai là kết quả của các công trình chưa đăng ký bản quyền và ít được các công ty sản xuất thức ăn chăn nuôi quan tâm tới Các hướng tìm ra các nguồn vi sinh vật mới (đối với Việt Nam) để sinh tổng hợp các enzyme

bổ sung thức ăn chăn nuôi cũng thường không được chú trọng phát triển tiếp

Các hướng tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp hoặc cải biến di truyền, hoặc tạo ra các nguyên liệu làm thức ăn có sẵn các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi

ở Việt Nam đang ở thời kỳ manh nha Hiện nay đã có một số nhóm nghiên cứu ở Việt Nam

đã và đang tạo ra các enzyme tái tổ hợp sử dụng làm thức ăn chăn nuôi như Quyền Đình Thi

et al về các enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá et al., 2007c; Trịnh Đình Khá et al., 2007d),

protease (Nguyễn Thị Thảo and Quyền Đình Thi, 2004; Quyền Đình Thi and Trần Thị Quỳnh

Anh, 2007b) và mannanase (Nguyễn Sỹ Lê Thanh et al., 2006); Đỗ Thị Ngọc Huyền (nhóm Nguyễn Thị Thùy Châu, Viện Sau thu hoạch) về phytase phân lập từ chủng Bacillus (Đỗ Thị Ngọc Huyền et al, 2005; Đỗ Thị Ngọc Huyền, 2007) Đương nhiên hướng cải biến các

enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi có sẵn càng chưa có điều kiện để phát triển ở Việt Nam cũng như tạo nguyên liệu làm thức ăn có sẵn enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi Các nhóm chuyển gene vào thực vật ở Việt Nam hiện nay mới quan tâm đến các gene kháng sâu bệnh (rầy nâu, khô văn) và các gene chống chịu các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như khô hạn, úng ngập, mặn, phèn chua

Các hướng khác như chuẩn hóa phương pháp đánh giá tác dụng của enzyme thức ăn chăn nuôi, đánh giá đáp ứng đối với enzyme thức ăn chăn nuôi của động vật được cho ăn, xây dựng mô hình hay đánh giá quan tâm tới giảm thiểu ô nhiêm môi trường hầu như là con số zero ở Việt Nam Rất ít các công trình nghiên cứu cơ bản về những hướng đi này

Tóm lại khác biệt về trình độ khoa học và công nghệ trong nước và thế giới trong lĩnh vực enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cả bề sâu lẫn bề rộng

1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước trong thời gian qua

Để phát triển chăn nuôi lợn, gà hàng hóa thì vấn đề giảm giá thành sản xuất, giải quyết hiệu quả nguồn nguyên liệu thức ăn có lợi thế trong nước nhằm đảm bảo một nền chăn nuôi

ổn định là vấn đề cần thiết hiện nay Việt Nam là nước nông nghiệp với cây trồng chính là lúa nên sản phẩm cám gạo phục vụ thức ăn chăn nuôi có rất nhiều triển vọng và lợi thế so với các nguyên liệu khác Theo báo cáo tổng kết chăn nuôi thời kỳ 1990-2002 (Cục Khuyến nông và Khuyến lâm, 2003), sản lượng cám gạo sản xuất năm 2002 đạt khoảng 3 triệu tấn Tận dụng

có hiệu quả nguồn nguyên liệu này không những tạo ra một lượng lớn thịt, sữa, trứng giúp giải quyết nhu cầu xã hội về lượng đạm/đầu người vốn rất thấp hiện nay mà còn tiết kiệm được ngoại tệ từ nhập khẩu nguyên liệu thức ăn chăn nuôi

Thế nhưng, một trong những hạn chế lớn nhất của cám gạo là nó có tỷ lệ xơ cao Chính vì nhiều xơ nên cám gạo có tỷ lệ tiêu hóa thấp, giá trị năng lượng thấp Thành phần xơ chủ yếu

là chất đường không phải tinh bột Cám gạo có các thành phần xơ chủ yếu như arabinoxylan, cellulose và lignin Thú có dạ dày đơn khó tiêu hóa chất này do không sản xuất đủ lượng enzyme nội sinh cần thiết Không những thế, chất xơ còn bao bọc các chất dinh dưỡng, hạn chế khả năng tiêu hóa, hấp thu dưỡng chất Trong môi trường ruột, chất xơ hòa tan gây tăng

độ nhớt và giữ nước bao phủ các nhung mao ruột, làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu dưỡng chất của ruột Thông thường, khẩu phần nhiều xơ sẽ rất khó cân đối về mặt dinh dưỡng Khi nhu cầu dinh dưỡng không được thỏa mãn đầy đủ sẽ kích thích heo ăn nhiều và thải ra nhiều phân hơn, do đó làm tăng ô nhiễm môi trường Mặc khác, do khả năng giữ nước của chất xơ khá cao nên lượng phân thải ra thường rất ẩm ướt, gây khó khăn cho việc dọn rửa, vận chuyển và xử lý chất thải

Vì những hạn chế do chất xơ gây ra nên việc sử dụng cám gạo trong khẩu phần heo không thể đạt được kết quả như mong đợi Trên thế giới, để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa các nguyên liệu nhiều xơ như cám mì, cám lúa mạch, người ta bổ sung thêm men vào khẩu phần Trước đây, enzyme được thu nhận, chiết xuất từ động thực vật (protease từ nhựa đu đủ, dạ dày; amylase từ hạt nảy mầm) Tuy nhiên, việc chiết xuất này tỏ ra không kinh tế, trong khi

đó vi sinh vật chứa rất nhiều loại enzyme và các enzyme vi sinh vật này có hoạt lực khá cao Thêm vào đó, chúng sinh sản khá nhanh, dễ nuôi cấy và môi trường lên men lại là các phụ phẩm nông nghiệp rẻ tiền, sẵn có ở nước ta như: cám gạo, trấu, bã mía, bã khoai mỳ (sắn)

Ở Việt Nam, nhiều tác giả đã nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn gia súc, đặc biệt

từ các chủng vi sinh vật nhưng các kết quả nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế, cho nên việc áp dụng các sản phẩm enzyme trong nước trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi vẫn chưa được cơ sở sản xuất thức ăn quan tâm Nguyên nhân chủ yếu là do năng suất sinh tổng hợp của các enzyme tự nhiên còn thấp, chất lượng các enzyme tự nhiên không được cải biến bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại và hầu hết các chế phẩm enzyme bổ sung cho thức ăn chăn nuôi đã được các nhóm nghiên cứu đều ở dạng đơn enzyme Do đó các chế phẩm này chưa cạnh tranh được với các chế phẩm ngoại nhập là các chế phẩm đa enzyme và

đã có cải biến về di truyền, sử dụng các chủng vi sinh vật tái tổ hợp

Chính vì vậy, mục tiêu của đề tài là chọn lọc các chủng vi sinh vật tự nhiên có khả năng tổng hợp các các enzyme như lactase, xylanase, glucanase, phytase, subtilisin, lipase và amylase), kế đến là tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp các enzyme trên với năng suất, hoạt lực cao; bước kế đến là xây dựng được các quy trình sản xuất các enzyme tái tổ hợp và nguyên thủy năng suất cao và cuối cùng là lên men tạo chế phẩm đa enzyme bổ sung thức ăn cho gia súc

Trong một thời gian tương đối dài, ở Việt Nam đã có nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau thực hiện các công trình nghiên cứu liên quan tới enzyme bổ sung thức ăn gia súc Thành tựu bước đầu đạt được rất đáng kể Hầu hết các nhóm nghiên cứu đều tập trung vào khâu tuyển chọn các chủng vi sinh vật tự nhiên trong các mẫu đất, phân, nước thải, có hoạt tính thủy phân chất xơ, tinh bột, protein Sau đó họ chọn các chủng có hoạt tính cao nhất rồi nuôi cấy phòng thí nghiệm và đánh giá một số tính chất hóa lý, và thực hiện các thí nghiệm phối trộn với thức ăn gia súc và đánh giá hiệu quả của các chế phẩm enzyme này

Đoàn Văn Thược và Mai Thị Hằng đã thực hiện đề tài “Tuyển chọn và nghiên cứu một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh amylase trên bã sắn phế thải để sản xuất enzyme cho chăn nuôi gia súc” (Trung tâm Thông tin và Khoa học Quốc gia, www.vista.gov.vn) Kết quả thu

được từ bã sắn phế thải đã tuyển chọn được 3 chủng vi sinh vật có khả năng sinh amylase:

Aspergillus oryzae NM1, Aspergillus niger BS1 và Bacillus subtilis V37 Trong 3 chủng nêu

trên, có 2 chủng có khả năng sinh α-amylase là A oryzae NM1 và B subtilis V37, và một

chủng A niger BS1 có khả năng sinh glucoamylase Các chủng có thể phối hợp với nhau tạo

thành hệ amylase hoàn thiện, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn Amylase của 3 chủng tuyển

chọn đều bền và hoạt động tốt ở pH thấp, khá bền nhiệt và hoạt động tốt ở nhiệt độ gần với nhiệt độ cơ thể, có thể sử dụng làm enzyme cho chăn nuôi gia súc

Trong báo cáo 2005 của dự án hợp tác với Thụy Điển Sida/SAREC Ref VS-BT-05

“Study on using agriculture by-products for producing microbial enzyme-fed used for poultry and pig husbandry in Vietnam” Mai Thị Hằng và cộng sự đã thông báo các kết quả đánh giá nhiệt độ và pH tối ưu của amylase (Aspergillus oryzae NM1, Aspergillus niger BS1 và Bacillus subtilis V37) xylanase (Aspergillus NM1 và GM56, Bacillus THB14 và 55Lm6), phytase (Bacillus BT17, Vk37, THB17), cellulase (Aspergillus BS1 và BS2) Tác giả và cộng

sự cũng thông báo cải thiện tổng hợp enzyme của các chủng này bằng các phương pháp cổ điển (nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nitơ, muối khoáng) và gây đột biến bằng UV và hóa chất Nhưng không kèm theo các kết quả cụ thể nào Các thí nghiệm cho lợn ăn bổ sung các chế phẩm thương mại khác được tiến hành, nhưng chế phẩm enzyme này không có thông báo kèm theo (Chương trình hợp tác nghiên cứu Việt Nam – Thụy Điển, http://www.sarec.gov.vn/homepage.asp)

Ở các tỉnh phía nam, một số đề tài nghiên cứu về enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cũng

đã được tiến hành (Trung tâm Thông tin Khoa học và Công nghệ, Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM) Đinh Văn Cải (1999, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam) đã thực

hiện đề tài "Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ men vi sinh trong khẩu phần của bò sữa và bê" Cũng trong năm, Viện Sinh học Nhiệt đới thông báo đã

sản xuất được các chế phẩm enzyme bằng phương pháp vi sinh vật: α-Amylase từ

Aspergillus oryzae và Bacillus subtilis; hoạt tính 15 đơn vị/g; sử dụng vào thức ăn gia súc với

nhiệt độ và pH thích hợp lần lượt là 60°C, pH 6 và 80°C, pH 6-6.5; phân giải tính bột thành

các dextrin và đường Chế phẩm cellulose từ Aspergillus oryzae và Trichoderma viride; bổ

sung vào thức ăn gia súc; phân giải cellulose thành các dextrin, đường; nhiệt độ và pH thích hợp 40°C, pH 5-6 Các chế phẩm này ứng dụng vào thức ăn gia súc nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn, tăng sản lượng thịt, sữa, đạt hiệu quả kinh tế cao với chi phí thấp Năm 2002, Võ

Thị Hạnh (Viện Sinh học Nhiệt đới) chủ nhiệm đề tài "Nghiên cứu để sản xuất chế phẩm hỗn hợp vi sinh vật sống và enzyme dùng trong chăn nuôi (heo) và thủy sản (tôm)"

Năm 2004 ở Thành phố Hồ Chí Minh, một số đề tài liên quan tới việc sản xuất các enzyme bổ sung cho thức ăn gia súc cũng đã được tiến hành Trần Thạnh Phong (Trung tâm

Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ) đã “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger trên môi trường lên men bán rắn” Chế

phẩm sinh học từ bã mía dùng bảo quản cỏ xanh làm thức ăn cho gia súc: Hướng nghiên cứu này vừa được Trần Thạnh Phong, Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM, thực hiện thành công Trần Thạnh Phong và nhóm cộng sự đã tận dụng nguồn phế liệu bã mía kết hợp với cám mì, dùng phương pháp công nghệ sinh học (lên men bán rắn) để tổng hợp thành chế phẩm sinh học, mang tên là chế phẩm enzyme xylanase Chế phẩm này kết hợp với chế phẩm VEM (chứa nhóm vi khuẩn lactic và nấm men) dùng vào việc ủ cỏ xanh (hoặc các phế phẩm nông nghiệp khác như bắp, đậu) có tác dụng duy trì được một thời gian dài giá trị dinh dưỡng của

cỏ như là lúc mới thu hoạch Giải pháp này đã thiết thực đáp ứng cho vấn đề bảo quản dự trữ nguồn thức ăn cho gia súc Đinh Minh Hiệp (Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ

Trẻ) đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp enzyme phytase từ vi sinh vật và ứng dụng bổ sung thức ăn gia súc, gia cầm”

Năm 2004, Đồng Thị Thanh Thu đã thông báo hướng dẫn một số học viên cao học khóa

12 (Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học TPCMH) thực hiện một số đề tài tốt nghiệp liên quan đến việc đánh giá hoạt tính của một số enzyme như protease (Trần Thị Ngọc Mai:

Nghiên cứu đặc tính và ứng dụng của protease dạng hòa tan và dạng cố định từ nấm mốc A oryzae); hydrolase (Lê Thị Hồng Nga: Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng một số enzyme

hydrolase từ vi sinh vật bởi cơ chất tương ứng của enzyme), phytase (Lê Quốc Phong:

Nghiên cứu một số đặc tính và thử nghiệm ứng dụng của phytase chiết tách từ môi trường

nuôi cấy Bacillus spp.), amylase (Nguyễn Quyết, Nghiên cứu các đặc tính và ứng dụng của – amylase dạng dạng hòa tan và cố định thu nhận từ vi khuẩn Bacillus subtilis)

(www.biology.hcmuns.edu.vn/store/thesis/detai-CH-K12.htm) Hoàng Quốc Khánh (Viện sinh học nhiệt đới) cũng hướng dẫn học viên cao học Phạm Huỳnh Ngọc Quyên thực hiện đề

tài: Sản xuất xylanase từ Trichoderma harzianum bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt trên vỏ

cà phê (www.biology.hcmuns.edu.vn/store/thesis/detai-CH-K12.htm)

Theo Trần Thị Dân và Nguyễn Ngọc Tuấn (2006), các chủng Bacillus, đặc biệt Bacillus subtilis, là những chủng được nghiên cứu nhiều nhất ở Việt Nam để khai thác sinh khối (Tô Minh Châu et al., 2005) làm probiotic, và để sử dụng các enzyme của chúng tăng cường tiêu

hóa trong động vật và con người Protease là một enzyme công nghiệp quan trọng, chiếm tới

60% thị phần enzyme tổng số; do đó, protease Bacillus subtilis được sản xuất và tinh sạch

(Đỗ Thị Bích Thủy and Trần Thị Xô, 2004) Trình tự nucleotide của gene 16S rRNA từ

Bacillus HA401 sản xuất α-amylase kiềm đã được xác định (Tang Thi Chinh, 2006) Một enzyme khác là phytase, nâng cao thủy phân phosphorus, cũng được sản xuất từ chủng

Aspergillus niger (Trần Thị Tuyết et al., 2004) Enzyme góp phần cải thiện tỷ lệ chuyển hóa

thức ăn và làm giảm ô nhiễm môi trường vì phosphorus

1.5.1 Tình hình nghiên cứu các enzyme tái tổ hợp

Phòng CNSH Enzyme (Viện CNSH) đã và đang triển khai các đề tài nghiên cứu theo hướng tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh tổng hợp các enzyme sử dụng bổ sung vào

thức ăn chăn nuôi như protease (Quyền Đình Thi et al., 2006; Quyền Đình Thi and Trần Thị Quỳnh Anh, 2007a), mannanase (Nguyễn Sỹ Lê Thanh et al., 2006), cellulase (Trịnh Đình Khá et al., 2007b; Trịnh Đình Khá et al., 2007a), lactase (ĐTCS: Nghiên cứu nhân dòng, biểu hiện enzyme lactase từ một chủng vi sinh vật và định hướng ứng dụng bổ sung vào sữa và các sản phẩm từ sữa), lipase (Quyền Đình Thi et al., 2006; Quyền Đình Thi and Trần Thị Quỳnh Anh, 2007a; Quyen et al., 2007) Có enzyme đã được biểu hiện năng suất cao trong E coli, đánh giá tính chất hóa lý và sẽ được biểu hiện trong nấm men và Bacillus như protease,

mannanase và lipase Trong luận văn nghiên cứu sinh của Đỗ Thị Ngọc Huyền, tác giả cũng

nhân dòng, đọc trình tự, phân tích và đăng ký GenBank một gene mã hóa phytase từ Bacillus subtilis Sau đó tác giả đã biểu hiện thành công ở E coli và đánh giá tính chất hóa lý (Đỗ Thị

Ngọc Huyền, 2007)

Tuy nhiên để sử dụng các chủng vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất các enzyme bổ sung thức

ăn chăn nuôi tái tổ hợp thì bắt buộc phải chuyển các gene trên vào các chủng sản xuất như

Bacillus subtilis, Lactobacillus, Aspergillus niger và Trichoderma Hiện nay Phòng CNSH

Enzyme đang tiếp cận các phương pháp xây dựng vector chuyên biểu hiện ở các hệ thống tế

bào chủ Bacillus và nấm sợi và các phương pháp biến nạp vector vào các hệ thống tế bào chủ

này Đây sẽ là khâu khó khăn nhất, vì hầu hết các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học ở

Việt Nam đều chỉ sử dụng các loại vector biểu hiện ở E coli hoặc nấm Pichia pastoris, mang tính nghiên cứu nhiều hơn Hơn nữa E coli không thể sử dụng cho lợn ăn được

1.5.2 Tình hình nhập khẩu và liên doanh sản xuất

Hiện nay trên thị trường Việt Nam đã bán các sản phẩm enzyme sử dụng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho các đối tượng bò, lợn, gà, vịt Những sản phẩm này đều được sản xuất

ở nước ngoài Nếu các cơ sở sản xuất trong nước có khả năng sản xuất được các chế phẩm enzyme tương tự, thì sẽ tạo công ăn việc làm cho nhiều người lao động Đặc biệt nếu các chế phẩm enzyme được sản xuất tận dụng các phế thải nông nghiệp và công nghiệp chế biến thực phẩm thì giá thành sẽ rẻ hơn, có sức cạnh tranh hơn

Theo Quyết định số 01/2006-QĐ-BNN ra ngày 06/01/2006 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trên thị trường Việt Nam được phép buôn bán các chế phẩm chứa các loại

enzyme tiêu hóa do các công ty lớn trên thế giới sản xuất như Novozymes A/S (Đan Mạch, chế phẩm Ronozyme® các loại chứa glucanase, xylanase, protease, phytase), Finnfeeds International Ltd; Danisco Animal Nutrition Finland hoặc England (các chế phẩm Avizyme, Phyzyme, Porzyme), Chem Tech (Hàn Quốc) Ngoài các công ty lớn ra còn một số công ty khác trên thế giới cũng đã và đang chào bán các chế phẩm chứa enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi trên thị trường Việt Nam, họ đến từ Đức, Hà Lan, Bỉ, Canada, Pháp, Spain, Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Singapore, Malaysia, Philippine Chế phẩm của Trung Quốc chưa có thương hiệu nhưng lại có nhiều công ty tham gia thị trường

Mặc dù trên thị trường đã có nhiều sản phẩm thương mại của các công ty ngoại quốc, nhưng chúng ta vẫn nên tự sản xuất nhằm tạo thêm công ăn việc làm cho người lao động, chủ động cung cấp Điều này cũng giống như là câu chuyện về máy tính trước đây Thế giới có rất nhiều hãng lớn sản xuất và láp ráp máy tính, và bày bán la liệt trên thị trường Việt Nam trước khi các công ty của Việt Nam thực hiện sản xuất và láp ráp

1.5.3 Hiệu quả kinh tế của các enzyme bổ sung và mức độ an toàn

Các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi (xylanase, amylase, protease, glucanase, phytase, pectinase, cellulase, mannanase) đều có hiệu quả kinh tế cao: làm tăng trọng trung bình của động vật lên 5-10%, giảm thức ăn trên một kilogram trọng lượng, tăng năng suất đẻ trứng, tăng năng suất tiết sữa, tăng khả năng hấp thụ phosphor và giảm ô nhiễm môi trường Hiệu quả kinh tế cao đã được chứng minh qua hàng trăm công trình nghiên cứu đã được công bố

trên các tạp chí quốc tế (Nsereko et al., 2002; Omogbenigun et al., 2004; Ciftci et al., 2005; Cowieson and Adeola, 2005; Wu et al., 2005; Slominski et al., 2006; Balci et al., 2007; Olukosi et al., 2007) Chính vì hiệu quả kinh tế cao cho nên hàng chục công ty lớn trên thế

giới đã và đang sản xuất các chế phẩm enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi như Novozymes A/C (Đan mạch), BASF (Đức), Danisco Animal Nutrition (Đan Mạch, Anh Quốc), Alltech Inc (Mỹ) từ hơn chục năm nay

Trong đề tài chúng tôi đề xuất sẽ sử dụng các chủng vi sinh vật như Aspergillus niger và Bacillus subtilis để sản xuất các loại enzyme như trên Các chủng vi sinh vật này hoàn toàn là những chủng vi sinh vật an toàn đối với người và động vật Bacillus subtilis là chủng vi sinh

vật được sử dụng bổ sung vào hệ thống vi sinh vật tiêu hóa ở người, động vật, tôm cá từ lâu Theo các tiêu chuẩn của FDA (Mỹ) và các tiêu chuẩn của Châu Âu, các chủng này hoàn toàn

an toàn đối với động vật

Trong số các chủng Aspergillus, Aspergillus oryzae và Aspergillus niger được công nhận

là chủng an toàn “the Generally Recognized as Safe (GRAS)” trong danh sách của Tổ chức Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration (FDA) ở Hoa Kỳ

Tất cả các công trình nghiên cứu ở Việt Nam về các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi

đều đã sử dụng các chủng Bacillus subtilis và Aspergillus niger để sản xuất enzyme và bổ sung trực tiếp vào thức ăn mà không có vấn đề gì về độc hại Trong đề tài này, các chủng E coli tái tổ hợp được sử dụng để nghiên cứu các tính chất hóa lý của enzyme tái tổ hợp, chứ

không được sử dụng trực tiếp để sản xuất enzyme tái tổ hợp dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Do vậy vấn đề an toàn của các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi ở đề tài này hoàn toàn tuân thủ theo các quy định chung của quốc tế lẫn Việt Nam

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật dùng để khảo sát hoạt tính enzyme do phòng CNSH Enzyme (Viện

CNSH) sưu tập và phân lập: 137 chủng Aspergillus (Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học), 2 chủng Aspergillus (Trung tâm Sưu tầm Vi sinh vật Đức DSM), B subtilis G1 (Phòng

Vi sinh vật Phân tử, Viện CNSH), 2 chủng B subtilis, 2 chủng Aspergillus (Phòng Vi sinh vật, Viện KHKT Nông nghiệp miền Nam), 2 chủng Aspergillus (Phòng Vi sinh vật đất, Viện CNSH), chủng Bacillus subtilis CC (Liên hiệp KH Sản xuất CNSH và Môi trường, Viện

CNSH, Viện KH&CN Việt Nam)

Escherichia coli DH5α và BL21 lần lượt được sử dụng để nhân dòng và biểu hiện gene Pichia pastoris GS115 và Aspergillus niger VTCC-F021 được sử dụng để biểu hiện gene mã

hóa glucanase, mannanase, xylanase

2.2 Nguyên liệu

Gene mã hóa xylanase A, B từ A niger DSM1957 được khuếch đại PCR từ vector pJXlnAB (pJET1+xlnab), gene mã hóa xylanase G2 từ A oryzae VTTC-F187 được khuếch đại PCR từ vector pJXlnG2 (pJET1+xlng2)

Chế phẩm Miazyme của công ty Finnfeed International; glucanase: 3500 IU/g; xylanase: 3500 IU/g; α-amylase: 500 IU/g Chế phẩm Bergazyme của công ty Berg + Schmidt- Germany; endo 4 xylanase: 3500 IU/g Chế phẩm Roxazyme® G2 của công ty DSM Nutritional products- Switzeland: endo-1,4-β-glucanase, xylanase Các nguyên liệu khác: bắp, tấm, bột cá, khô nành, dầu đậu nành, premix, aa

β-2.3 Môi trường nuôi cấy

Bảng 2.1 Các loại môi trường trong thí nghiệm

4.10-5% biotin; 1% (v/v) glycerol hoặc 0,5% (v/v) methanol

35 µl 1 M MgCl2 hoặc MgSO4; 50 µl 0,1 M CaCl2

T-base (1 lít) 2 g (NH4)2SO4; 18,3 g K2HPO4 3H2O; 6 g KH2PO4; 1 g natri-citrate

Môi trường phục hồi

ZnSO4.7H2O, 8,8 g/liter; CuSO4.5H2O, 0,4 g/liter; MnSO4.4H2O, 0,15 g/liter;

Na2B4O7.10H2O, 0,1 g/liter; (NH4)6Mo7O24.4H2O, 0,05 g/liter]; 200g sucrose; 16g agar; 1 lit H2O khử ion

(w/v) KCl; 2% (w/v) sucrose; pH 6,5 Môi trường thạch được bổ sung 2% (w/v)

CM (Complete

medium)

10ml solution A (10% Ca(NO3)2); 10ml solution B (2% KH2PO4; 2,5% MgSO4; 15% NaCl, pH 5,3); 0,2% hỗn hợp yeast-casein; 1% glucose; 1ml MNS; 900ml H2O

2.4 Vector biểu hiện

Vector biểu hiện pET22b+ của Novagen

Vector biểu hiện pPICZαA của Invitrogen

Vector biểu hiện pAC7 do phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ sinh học cung cấp

Vector nhân dòng được sử dụng là pGEMT (Promega), vector biểu hiện pAN7.1GluA từ Phòng Di truyền và Bệnh học Thực vật, Trường Đại học Hamburg, Đức

Vector pJET1.2/blunt (Fermentas) và vector pPICZαA được dùng để nhân dòng và biểu

hiện xynanse, glucanase (hình 2.1B) Vector có vùng cloning gồm 3 enzyme là EcoRI, SmaI

và BamHI với 2 gene kháng kháng sinh là Ampicilin (dùng để chọn lọc trong E coli) và Kanamycin (dùng chọn lọc trong Bacillus Khi vector được đưa vào vật chủ Bacillus sẽ hội

nhập vào genome của vật chủ bằng việc thay thế gene sinh tổng hợp amylase của vật chủ nhờ

hai trình tự 3’ amyE và 5’ amyE

A

B

C

Hình 2.1 Vector biểu hiện pAC7 (A);

pPICZαA,B,C (B); vector nhân dòng pJET1.2/blunt (C)

2.5 Hóa chất

3,5-Dinitrosalisilic acid, D(+)-xylose, xylan từ bột mịn yến mạch được mua từ Fluka (Đức); agarose, peptone và yeast extract từ từ Bio basic INC (Canada); D-glucose, methanol, sodium chloride, sodium hydroxide, glycerol từ Merck (Đức), sodium dodecylsulfate từ Sigma (Mỹ); gel DNA extraction kit (Promega), tryptone (Ấn Độ); Probond TM của

Invitrogen (Mỹ); Taq polymerase, EcoRI, XbaI, MssI, T4-ligase được mua từ Fermentas

(Litva), sorbitol từ Scharlau (Tây ban nha)

Các hóa chất khác được sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết

2.6 Các bộ mồi

Các bộ mồi dùng trong thiết kế plasmid biểu hiện gene glucanase, mannanase, subtilisin, xylanase trong pET22b+, pPICZαA và pAC7 được thể hiện ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Các bộ mồi dùng trong thiết kế vector biểu hiện

1146 bp

1056 bp

Promoter acoA aco-subF GACCGGCGGCTGCGAGTGCTGTGAGAAGCAAAAAATTGTG

Cassette subG1-terminater T7

Chủng B subtilis CC được nuôi cấy trong môi trường MT1 và MT2 Sau các khoảng thời

gian nhất định, đánh giá khả năng thủy phân CMC của chủng vi khuẩn bằng cách rỏ 100 µl dịch vi khuẩn nuôi cấy vào các lỗ đục sẵn trên đĩa thạch và 100 µl nước cất vô trùng cho lỗ đối chứng Ủ 30 phút các đĩa trên ở 4°C, giúp enzyme có khả năng khuếch tán vào trong thạch Sau đó, để vào tủ ấm 37°C Sau 24 giờ nhỏ dung dịch lugol vào và tráng đều khắp mặt thạch, để yên trong 15 phút Gạn bỏ hết lugol và quan sát Vùng CMC bị phân giải xung quanh lỗ sẽ có màu trong suốt do không bắt màu của lugol Đo đường kính vòng phân giải D-

d (mm) Hoạt tính CMCase của enzyme được biểu thị bằng hiệu số giữa đường kính vòng

phân giải với đường kính lỗ khoan (D-d) Hiệu số này càng lớn thì hoạt tính enzyme càng lớn

Định lượng

Dung dịch CMC: 44,8 g CMC hòa trong 2800 ml nước cất ở 90°C Hỗn hợp được làm mát sau đó bổ sung 800 ml đệm 0,5 M citrate (35 g citric acid monohydrate và 98 g natri citrate dihydrate/l), 0,4 g methiolate và 0,4 g glucose Định mức bằng nước cất đến 4 lit Bảo quản ở 4°C

Xác định đường chuẩn: Cho glucose vào 6 ống nghiệm với nồng độ 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mg/ml Sau đó bổ sung 1 ml dung dịch CMC lạnh (4°C) vào mỗi ống Lật ngược ống 10 lần Đặt vào tủ ấm 50°C trong 20 phút rồi làm lạnh bằng nước máy 1 ml 0,75 M natri carbonate

và 2 ml dung dịch 0,02 N I2-KI được bổ sung vào mỗi ống và trộn đều Để ở 25°C trong 1 giờ Acid hóa với 5 ml 1,2 N phosphoric acid và trộn đều bằng đũa thủy tinh Đo ở bước sóng

480 nm Lập đường chuẩn

Mẫu kiểm chứng: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch CMC lạnh (4°C) Đặt vào tủ ấm 50°C trong 20 phút rồi làm lạnh bằng nước máy 1 ml 0,75 M natri carbonate và 2 ml dung dịch 0,02 N I2-KI được bổ sung vào mỗi ống và trộn đều Để ở 25°C trong 1 giờ Acid hóa với 5 ml 1,2 N phosphoric acid và trộn đều bằng đũa thủy tinh Đo ở bước sóng 480 nm Mẫu thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch CMC lạnh (4°C) và 1 ml enzyme Đặt vào tủ ấm 50°C trong 20 phút rồi làm lạnh bằng nước máy 1 ml 0,75 M natri carbonate

và 2 ml dung dịch 0,02 N I2-KI được bổ sung vào mỗi ống và trộn đều Để ở 25°C trong 1 giờ Acid hóa với 5 ml 1,2 N phosphoric acid và trộn đều bằng đũa thủy tinh Đo ở bước sóng

480 nm

Xác định hoạt tính glucanase bằng cách xác định đường khử

Theo phương pháp này, một đơn vị hoạt độ được xem là lượng enzyme trong 1 ml của dung dịch tạo ra một lượng đường khử tương ứng với 0,5 mg glucose khi ủ ở 50°C trong 20 phút, với 1 ml 1% CMC trong đệm 0,1 M citrate, pH 5 Từ đó ta có đồ thị xác định hoạt tính enzyme thông qua lượng đường khử tạo thành

2.7.2 Xác định hoạt tính mannanase

Định tính: Hoạt tính endo-β-1,4-mannanase được xác định tương đối theo phương pháp khuếch tán enzyme trên đĩa thạch Đĩa thạch chứa cơ chất 0,5% LBG trong đệm KP, dày khoảng 0,5 cm được đục lỗ đường kính 0,5 cm 50 µl dịch enzyme được rỏ vào lỗ rồi ủ 12 giờ trong tủ lạnh cho enzyme khuếch tán Sau đó, đĩa thạch được ủ 6 giờ ở 37°C, rồi nhuộm với 1% lugol Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r, với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm

lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ, biểu thị hoạt tính tương đối của enzyme

Định lượng: Hoạt tính β-mannanase được xác định chính xác theo phương pháp quang phổ (Miller, 1959), với cơ chất 0,5% LBG trong đệm 20 mM phosphate pH 7 Hàm lượng đường khử giải phóng ra trong dung dịch phản ứng ở 40°C trong 5 phút được đo bằng quang phổ bước sóng 540 nm Độ hấp phụ được đối chiếu với đường chuẩn nồng độ đường mannose (hình 2.2) để tính hàm lượng đường giải phóng tương đương Một đơn vị hoạt tính mannanase được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác thủy phân giải phóng 1 µmol manose trong 1 phút ở điều kiện thích hợp

Đường chuẩn mannose

Dophaloang X

T: Thời gian ủ V: Thể tích enzyme trong phản ứng Một đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme xúc tác thủy phân 1 µmol mannose trong 1 phút ở điều kiện thích hợp

Hình 2.2 Đường chuẩn mannose

2.7.3 Xác định hoạt tính subtilisin

Hoạt tính subtilisin với cơ chất casein được xác định theo phương pháp Anson cải tiến (Phạm Thị Trân Châu) Đơn vị hoạt tính là lượng enzyme phân giải protein (casein) tạo thành các sản phẩm hòa tan trong trichloracetic acid cho phản ứng màu với thuốc thử Folin trong 1 phút tương ứng với 1 µmol tyrosine ở điều kiện thí nghiệm theo công thức sau:

T

V V T

V mol

M NaCl Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r, với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ, biểu thị hoạt tính tương đối của enzyme

2.8 Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng tự nhiên sinh tổng hợp enzyme

2.8.1 Sinh tổng hợp glucanase

Khảo sát sinh trưởng

A niger VTCC-F021 nuôi cấy trong môi trường CPY bổ sung 0,5% cơ chất CMC, nuôi

lắc 200 rpm Dịch nổi môi trường được thu ở những giờ khác nhau để xác định hoạt tính glucanase ngoại bào

Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy

Chủng A niger VTCC-F021 nuôi cấy trong môi trường CPY bổ sung 0,5% cơ chất CMC,

nuôi lắc 200 rpm ở các nhiệt độ khác nhau Dịch nổi môi trường được thu ở 120 giờ nuôi cấy

để xác định hoạt tính glucanase ngoại bào

Tối ưu nguồn cơ chất cảm ứng

A niger VTCC-F021 nuôi cấy trong môi trường CPY bổ sung cơ chất CMC ở các nồng

độ khác nhau, nuôi lắc 200 rpm ở 37°C Dịch nổi môi trường được thu ở 120 giờ nuôi cấy để xác định hoạt tính glucanase ngoại bào

Tối ưu nguồn carbon

A niger VTCC-F021 nuôi cấy trong môi trường CPY bổ sung 1% cơ chất CMC Trong

đó nguồn cao nấm men được thay thế bằng một số nguồn carbon khác nhau như: lactose, glucose, sucrose, trấu cám, lõi ngô, vỏ lạc, bã mía, vỏ quýt khô, nuôi lắc 200 rpm ở 37°C Dịch nổi môi trường được thu ở 120 giờ nuôi cấy để xác định hoạt tính glucanase ngoại bào

Sau khi xác định được nguồn carbon thích hợp nhất, để tối ưu nguồn carbon, A niger

VTCC-F021 được nuôi cấy trong môi trường có nguồn carbon thích hợp với các nồng độ khác nhau

từ 0,1 đến 1,4%, cách nhau 0,5%

2.8.2 Sinh tổng hợp mannanase và xylanase

Để khảo sát nguồn carbon và nguồn nitrogen các chủng nghiên cứu sinh tổng hợp xylanase và mannanase được nuôi ở môi trường lỏng khoáng Czapek (0,1% K2HPO4; 0,1% NaNO3; 0,1% MgSO4); nhưng cao nấm men được thay bằng một trong các nguồn carbon khác như trấu cám, vỏ lạc, bột sắn, bã mía, vỏ quýt khô, lõi ngô, nấm linh chi, xơ dừa, vỏ hạt

cà phê còn pepton được thay bằng một trong các nguồn nitrogen khác như cazein, cao thịt bò,

amonium nitrat, urea, bột đậu tương, bột đầu cá A niger VTCC-F128 (guargum 0,3%, pH 6,

168 giờ, 37°C); A oryzae MN (0,7% guargum, pH 5, 192 giờ, 28°C và A awamori F296 (0,5% guargum, pH 7, 264 giờ, 37°C)

VTCC-Để xác định ảnh hưởng của các yếu tố (nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, nồng độ cơ chất)

lên sinh tổng hợp xylanase và mannanase từ nghiên cứu, một số chủng Aspergillus được nuôi

trong môi trường ban đầu (khoáng Czapek (0,1% K2HPO4; 0,1% NaNO3; 0,1% MgSO4); cao nấm men 0,5%, peptone 1%, guar gum 0,5%), lắc 200 v/ph:

+ Dải nhiệt độ 28°C (30°C, 37°C)

+ Nuôi các chủng Aspergillus với môi trường ban đầu cứ sau 24 h thu 1ml mẫu để xác

định hoạt tính mannanase đến 312 giờ thì kết thúc đợt nuôi

+ pH thay đổi từ pH 2-9 nuôi ở 37°C, 120 giờ (A niger VTCC-F128), ở 37°C, 192 giờ

(A awamori VTCC-F296), ở 28°C, 96 giờ (A oryzae MN)

2.8.3 Sinh tổng hợp subtilisin

Xác định động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp subtilisin

Để sinh tổng hợp subtilisn ngoại bào tối ưu, hai chủng Bacillus G1 và RD23 được khảo

sát động thái sinh trưởng trong môi trường LB, lắc ở 37ºC, 200 rpm và lấy mẫu ở các thời điểm 6, 12, 24, 30, 36, 48, 57 và 72 giờ để xác định hoạt tính subtilisin và mật độ tế bào

Nguồn carbon, nitrogen và môi trường thay thế

Các chủng Bacillus G1 và RD23 được nuôi cấy trong các điều kiện pH 7; 37°C; lắc 200

rpm và trong môi trường LB, nhưng 0,5% cao nấm men được thay thế bằng một trong các nguồn carbon khác nhau như tinh bột gạo, tinh bột khoai tây, glucose, sucrose, lactose để khảo sát nguồn carbon hoặc thay thế 1% peptone bằng một số nguồn nitrogen khác (casein, cao thịt, cao thịt bò, ammonium nitrate, urea) để khảo sát nguồn nitrogen

Tối ưu nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng

Để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu, G1 và RD23 nuôi cấy trong môi trường LB, lắc 200 rpm, ở các nhiệt độ khác nhau (25, 28, 30, 37°C) Để khảo sát pH môi trường nuôi cấy tối ưu, hai chủng này được nuôi cấy trong môi trường LB với pH 4-9; 37°C; 200 rpm Để khảo sát

ảnh hưởng của cơ chất casein lên sinh trưởng và sinh tổng hợp subtilisin, chủng được nuôi cấy trong môi trường LB, 37°C, 200 rpm với nồng độ casein khác nhau Trong cả ba thí nghiệm này, mẫu được thu sau 30 giờ nuôi cấy

2.8.4 Xác định ảnh hưởng của các yếu tố lên hoạt tính enzyme

Việc xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xylanase và endo-β-mannanase được thực hiện bằng cách cho các yếu tố (nhiệt độ, pH, dung môi hữu cơ, chất tẩy rửa, muối ion kim loại) biến thiên tác động lên dịch enzyme ủ theo tỉ lệ 1:1(v/v) ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ Sau đó đo hoạt tính xylanase và endo-β-mannanase còn lại và so sánh với hoạt tính của dịch enzyme không ủ Đối với việc xác định nhiệt độ (pH) tối ưu, hỗn hợp phản ứng được ủ 5 phút ở các nhiệt độ (pH) khác nhau rồi được đo hoạt tính enzyme

2.9 Các phương pháp sinh học phân tử

2.9.1 Phản ứng PCR

Để khuếch đại đoạn gene mã hóa xylanase từ plasmid pJXlnB, các mồi đặc hiệu được sử

dụng là pPXlnB-F và pPXlnB-R Các mồi được thiết kế đặc hiệu dựa vào trình tự nucleotide

của gene mã hóa xylanase xlnB từ A niger DSM1957, được bổ sung điểm cắt của hai enzyme giới hạn EcoRI (GAATTC), và XbaI (TCTAGA) để chèn vào vector biểu hiện pPICZαA

Hỗn hợp phản ứng PCR (tổng thể tích là 10 µl) bao gồm: 1 µl đệm PCR; 0,6 µl 25 mM MgCl2; 0,8 µl 2,5 mM dNTP; 0,6 µl DNA khuôn; 5,8 µl nước cất; 0,4 µl mồi mỗi loại; 0,5 µl

Taq polymerase 1 IU Phản ứng PCR được thực hiện theo chương trình: 95°C/5′; 35x (95°C/45″; 52°C/1′; 72°C/1′); 72°C/10′

Khuếch đại gene xylanase G2 được thực hiện với khuôn cDNA và cặp mồi đặc hiệu

XlnG2F và XlnG2R với chu trình nhiệt PCR: 94°C/3′; 35x (54°C/1′, 72°C/1′); 72°C/10′

2.9.2 Thao tác cắt, gắn dính DNA và biến nạp hóa học

Các thao tác cắt, gắn dính DNA và biến nạp hóa học được thực hiện theo các phương

pháp chuẩn của phòng thí nghiệm đã mô tả (Vũ Hồng Diệp et al., 2008).

2.9.3 Biến nạp xung điện

Một khuẩn lạc nấm men P pastoris được nuôi trong 50 ml môi trường YPG qua đêm ở

30°C, lắc 200 rpm trong 16 h đến khi OD600nm đạt 1,3-1,6 Dịch nuôi được cho vào hai ống, mỗi ống 25 ml, ly tâm 5 phút với 1500 g/phút ở 4°C Tủa tế bào được bổ sung 20 ml H2O để lạnh vào mỗi ống, lắc nhẹ cho tan tế bào, tiếp tục ly tâm 5 phút với 1500 g/phút ở 4°C Tủa tế bào được bổ sung 2 ml 1 M sorbitol đã để lạnh, lắc nhẹ cho tan tế bào, ly tâm như trên Tủa tế bào được bổ sung 100 µl sorbitol để lạnh, lắc nhẹ cho tan tế bào Các thao tác này đều phải thực hiện trong tủ cấy Tế bào khả biến được sử dụng ngay trong ngày

Tám mươi µl dịch tế bào ở trên được cho vào ống eppendorf, bổ sung 10 µl (~10 µg)

DNA pPXlnB/MssI Hỗn hợp tế bào được đưa vào cuvette 0,2 cm và biến nạp xung điện

1500 V, 25 mA, 25 W, 50 µF và 100 Ω Sau khi biến nạp bổ sung ngay 1 ml 1 M sorbitol để lạnh, chuyển vào ống falcon 15 ml, ủ 2 h ở 30°C Tiếp theo, dịch tế bào được trải trên đĩa thạch YPGS chứa 1‰ zeocine Đĩa được ủ 3-4 ngày ở 30°C đến khi khuẩn lạc xuất hiện

2.9.4 Tách chiết RNA

Các phương pháp nhân dòng (tách chiết RNA tổng số, DNA plasmid, gắn dính, cắt enzyme hạn chế, chạy điện di agarose, biến nạp, chọn dòng) đã được mô tả ở công trình trước đây (Quyền Đình Thi, 2004)

2.9.5 Đọc trình tự DNA

Trình tự nucleotide được xác định theo phương pháp Sanger, trên máy ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer Phân tích trình tự nucleotide được thực hiện bằng phần mềm DNAstar

Các phương pháp sinh học phân tử: tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ B subtilis,

DNA plasmid, gắn dính, biến nạp, chọn lọc plasmid tái tổ hợp được tiến hành như đã mô tả

trước đây (Nguyễn Sỹ Lê Thanh et al., 2006).

2.9.6 Biểu hiện plasmid tái tổ hợp trong E coli BL21

Nuôi cấy preculture một khuẩn lạc BL21 mang plasmid tái tổ hợp trong môi trường LB lỏng bổ sung 100 µg/ml ampicilin ở 37°C, qua đêm Sau đó tiếp giống 1% dịch nuôi preculture cũng vào môi trường LB bổ sung ampicilin, lắc ở 37°C khoảng 2-3 giờ sao cho

OD đạt 0,6-0,8 thì cảm ứng 1 mM IPTG Sau khi cảm ứng cứ sau 2 giờ lấy mẫu một lần và biểu hiện trong khoảng 6 giờ

2.9.7 Biểu hiện plasmid tái tổ hợp trong Aspergillus

Chuẩn bị protoplast: Nuôi môi trường sơ cấp, tiếp giống khoảng 30.000 bào tử nấm nuôi

16 giờ trong môi trường YPD trong bình tam giác 250ml lắc 150rpm ở 30°C Thu sợi nấm bằng cách lọc qua màng lọc, nghiền nhỏ sợi nấm bằng máy nghiền, chuyển toàn bộ sợi nấm vào bình tam giác 1l chứa 150ml môi trường YPD nuôi lắc 150rpm ở 30°C qua đêm Chuẩn

bị hỗn hợp enzyme trong 20ml với 1,5g sợi nấm, Lọc canh trường nuôi cấy trong màng lọc Wilson-sieve (100µm) và rửa với nước cất Chuyển toàn bộ sợi nấm đã làm khô bằng giấy khử trùng vào hỗn hợp enzyme, lắc 75rpm trong 2 giờ Kiểm tra bào tử bằng kính hiển vi, sau

đó lọc lấy bào tử nấm qua màng lọc 100µm và rửa bằng 0,7M NaCl trong đá Li tâm ở 2000rpm trong 10 phút ở 2°C, cặn được hòa lại trong 0,7M NaCl, tiếp tục ly tâm 2000rpm trong 10 phút 2°C, và cặn được hòa trong dung dịch STC Tiếp theo bổ sung DNA plasmid

đã mờ vòng và để trong đá 10 phút Hút 1ml hỗn hợp chứa DNA plasmid trải nhẹ lên các đĩa thạch, để 15 phút sau đó phủ 10ml agar chứa 400µg/ml hygromycin

2.9.8 Biểu hiện trong Pichia pastoris

Nuôi một khuẩn lạc tái tổ hợp trong 3ml môi trường MGY, lắc 250rpm, 28°C, 16-18 giờ (OD600 2-6) Ly tâm dịch preculture 4500rpm ở nhiệt độ phòng, thu tế bào Hòa tế bào trong 3

ml môi trường MMY Sau đó dùng 1% dịch hòa tế bào để biểu hiện trong MMY Quá trình biểu hiện được nuôi lắc ở 28°C, 250rpm và methanol được bổ sung 0,5% cứ sau 24 giờ cho đến khi hoạt tính của enzyme biểu hiện đạt tối ưu

2.9.9 Biểu hiện Xln tái tổ hợp

Khuẩn lạc dòng P pastoris GS115/pPXlnB được nuôi khởi động trong 5 ml môi trường

YP bổ sung 1% glycerol lắc 200 rpm ở 30°C khoảng 16 h, OD600 đạt 2-6 Sau đó tửa tế bào giống được cho vào 50 ml môi trường YP bổ sung 1% methanol sao cho OD600 đạt khoảng 1,0 Cứ sau 24 h, 1 ml mẫu được thu và tiếp 1% methanol một lần Dịch biểu hiện sau 24 h được tủa 10 lần bằng methanol sau đó chạy điện di trên gel 12,5% polyacrylamide

2.9.10 Tách chiết DNA tổng số từ Pichia pastoris

1,5ml dịch nuôi lắc 1 khuẩn lạc P pastoris trong môi trường YPD được ly tâm 4500rpm,

5phút để thu cặn tế bào Bổ sung 200µl đệm ly giải (2% Triton X-100; 1% SDS; 100mM NaCl; 10mM Tris-HCl pH 8; 1mM EDTA pH 8) Lắc rung cho tan tế bào và để vào tủ -80°C,

10 phút; chuyển sang bể ủ nước 95°C, 1 phút rồi lắc rung 30 giây Lặp lại ba lần Sau đó bổ sung 200µl chloroform; lắc rung 1 phút và ly tâm 13000 rpm, 10 phút, 4°C Hút dịch trong pha trên sang một ống mới và thêm 0,9V isopropanol; lắc đều và để 30-60 phút ở -20°C Thu

tủa DNA bằng cách ly tâm 13000rpm, 4°C, 20 phút Rửa lại tủa bằng 70% ethanol và làm khô Hòa tủa trong TE

2.9.11 Phương pháp tách DNA từ nấm sợi

Cắt khoảng 0,5cm2 đĩa thạch nuôi cấy nấm, nuôi trong 50ml môi trường lỏng YPG, lắc

200 rpm ở 28ºC trong 3-4 ngày Thu sợi nấm bằng cách lọc qua phễu lọc nhờ lực hút chân không Nghiền nhỏ sợi nấm thu được trong cối chày sứ bằng nitrogen lỏng Sau đó chuyển vào ống eppendorf 2ml Bổ sung 600µl đệm ly giải vào mỗi ống và ủ lắc 40-60 phút ở 65ºC

Ly tâm 13000rpm, 10 phút ở nhiệt độ phòng hoặc 4ºC Hút pha trên sang ống eppendorf 1,5 mới Bổ sung 1V chloroform và lắc đều Ly tâm 13000 rpm ở 4ºC trong 15 phút Hút dịch trong pha trên sang ống 1,5 mới và tủa DNA bằng cách bổ sung 750µl isopropanol, lắc đều

và để vào tủ lạnh 30 phút (có thể để qua đêm) Ly tâm 13000 rpm ở 4ºC trong 20 phút Sau

đó bỏ dịch nổi, thu cặn Rửa cặn bằng 500µl cồn 70% lạnh Làm khô tủa và hòa lại trong TE

Biến nạp vào nấm sợi A niger

Nuôi khoảng 30.000 bào tử trong 50 ml môi trường YPD, lắc 28ºC, 150 rpm qua đêm; Xay toàn bộ dịch nuôi cấy trên cùng với 150ml môi trường YPD (3x 10 giây); Sau khi xay, dùng 50ml hỗn hợp trên cho vào 150 ml môi trường YPD và lắc qua đêm ở 28ºC, 150 rpm trong bình 500ml (preculture); Lọc toàn bộ dịch môi trường bằng phễu lọc Wilson-sieve (100µm) và rửa nhiều lần bằng nước đề ion khử trùng; Xác định trọng lượng của hỗn hợp sợi nấm sau khi làm khô bằng giấy thấm đã khử trùng; Trộn dung dịch enzyme với hỗn hợp sợi nấm trên (20ml dịch enzyme với 1-1,5g sợi nấm), trong bình 100 ml ở 28ºC, 75rpm; Tiếp theo tế bào trần được thu nhận bằng cách lọc lần lượt qua phễu lọc Wilson-sieve 100µm và 40µm Hòa lại cặn tế bào trần rất cẩn thận trong 12ml NaCl Sau đó lại ly tâm và hòa lại cặn

tế bào trần như trên Kiểm tra số lượng tế bào trần bằng kính hiển vi Bổ sung 50µg DNA và trộn đều thật cẩn thận Bổ sung 1ml PTC đã để lạnh trước và trộn đều cẩn thận Giữ trong đá 25 phút và cứ 2 phút lại lắc đều Nuôi lắc qua đêm ở 28°C, 80rpm Trộn tế bào với môi trường AMM bổ sung 50 µl hygromycin Đổ vào 2 đĩa để qua đêm ở 28ºC; Phủ 10 ml 1,2% agar chứa 50 µl hygromycin; Kiểm tra đĩa mỗi ngày và khi có khuẩn lạc mọc thì nhặt

plasmid-và chuyển sang đĩa môi trường chọn lọc CM có hàm lượng hygromycin 900µg/l

Lai Southern blot

Chạy điện di trên gel agarose mẫu DNA tổng số sau khi xử lý bằng enzyme hạn chế, nhuộm ethidium và kiểm tra sự phân tách của mẫu Cho gel vào hộp nhựa và rửa qua bằng nước cất 2 lần khử trùng Sau đó rửa qua với nước cất 2 đã khử trùng Biến tính DNA trong gel bằng cách ngâm gel trong dung dịch Denaturation solution, lắc 30 phút ở nhiệt độ phòng Rửa gel bằng nước cất 2 đã khử trùng Tiếp theo ngâm bản gel vào Neutralization solution, lắc 30 phút ở nhiệt độ phòng Cân bằng gel trong 20×SSC ít nhất 10 phút Đặt một tấm giấy thấm Whatman 3MM để làm cầu dẫn dung dịch 20×SSC và đặt bản gel lên trên, tránh bọt khí tạo thành giữa hai lớp Đặt màng nylon lên trên mặt gel, cũng tránh bọt khí giữa hai lớp Đặt thêm khoảng 4-5 tấm giấy thấm Whatman 3MM lên trên màng nylon Đặt chồng giấy thấm dày khoảng 10cm lên trên và đặt lên một vật nặng có trọng lượng khoảng 200-500g, để qua đêm cho DNA chuyển lên màng nylon Trước khi cố định, màng được rửa qua đệm 2×SSC Đặt màng lên tấm Whatman 3MM (đặt mặt chứa DNA lên phía trên) Đem cố định dưới tia

UV 1-3 phút Rửa lại màng với 2×SSC, đặt trở lại trên tấm Whatman 3MM và để khô Lắc xoay vòng ở 68ºC, qua đêm Loại bỏ dung dịch phủ màng, và đổ hỗn hợp mẫu dò vào và ủ tiếp qua đêm ở 68°C.Loại hỗn hợp mẫu dò và rửa lại màng 2 lần, mỗi lần 5 phút ở nhiệt độ phòng với 20ml dung dịch W1 Rửa 2 lần, mỗi lần 15 phút ở 68ºC với 20ml dung dịch W2 Rửa qua với dung dịch WP Rửa 30 phút trong dung dịch B2 ở nhiệt độ phòng Gắn kháng thể trong 30 phút (5µl kháng thể được pha trong 50ml dung dịch B2) Rửa màng 3 lần, mỗi lần 20 phút với dung dịch WP ở nhiệt độ phòng Rửa màng 5 phút trong dung dịch B3 để cân

bằng lại pH thích hợp cho enzyme hoạt động để phân giải cơ chất Trải đều 500µl cơ chất lên tấm nhựa nylon, sau đó úp mặt màng chứa DNA lên trên cơ chất, để 5 phút ở nhiệt độ phòng Đọc kết quả dưới tia huỳnh quang hóa học

2.9.12 PCR dung hợp hai đoạn

Hai đoạn promoter acoA (cặp mồi acoAF và acoAR) và cassette subG1-terminater T7

(cặp mồi aco-subF và T7R) được chạy PCR với Pfu polymerase đầu bằng và tinh sạch bằng

gel extraction kit Sau đó tiến hành dung hợp 2 đoạn bằng trong một phản ứng PCR (2 µl 10x buffer; 2 µl 25 mM MgSO4; 2 µl 2,5 mM dNTP; 0,5 µl 2 IU/µl Pfu polymerase; 9,5 µl H2O

và 2 µl sản phẩm mỗi phân đoạn sau tinh sạch) với chu trình nhiệt 95°C/4′; 15x (95°C/45″; 56°C/1′30″; 72°C/1′45″); 72°C/10′ Tiếp theo sản phẩm sau khi dung hợp sẽ được khuếch đại với cặp mồi acoAF và T7R với phản ứng (2 µl 10x buffer; 1,5 µl 25 mM MgSO4; 2 µl 2,5

mM dNTP; 0,5 µl 2 IU/µl Pfu polymerasse; 10-9 µl H2O; 1 µl 10 pmol/µl mồi mỗi loại và 2-3

µl sản phẩm PCR dung hợp làm khuôn) 95°C/4′; 30x (95°C/45″; 53°C/1′; 72°C/1′45″); 72°C/10′

2.9.13 Biến nạp vào Bacillus subtilis WB800

Nuôi preculture 1 khuẩn lạc Bs WB800 trong 2ml môi trường SPII hoặc LB qua đêm ở

37°C Sau đó cấy chuyển sang môi trường SPII mới với OD600nm khởi đầu là 0,1 và lắc tiếp ở 37°C trong 3-4 giờ để OD600nm đạt khoảng 0,6-0,8 (không được quá 1) Tiếp theo thu tế bào bằng cách ly tâm 1 ml dịch nuôi cấy với 5000 rpm, 4 phút ở nhiệt độ phòng Loại bỏ 900 µl dịch nổi và hòa tan tế bào trở lại với 100 µl dịch còn lại cùng với 15 µl dịch DNA (nồng độ 2 µg/µl), lắc tiếp 30 phút ở 37°C Bổ sung 500 µl LB và lắc tiếp 1 giờ Cuối cùng cấy trải các nồng độ khác nhau (50, 200 µl) lên môi trường LB chọn lọc

Tủa β-mannanase

Để tủa β-mannanase hiệu quả nhất, muối ammonium sulfate được bổ sung vào dịch enzyme theo các nồng độ bão hòa 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 và 100% Để β-mannanase tủa ở 4°C, sau đó ly tâm 12500 rpm trong 20 phút ở 4°C và thu tủa Tủa protein được hòa tan lại trong đệm KP 20 mM, pH7 và hoạt tính được xác định như trên Nồng độ muối bão hòa thích hợp để tủa endo-β-mannanase là nồng độ cho hoạt tính sau tủa cao nhất Dịch 10 ml enzyme tủa ở nồng độ muối thích hợp được thẩm tích qua màng cellulose trong đệm KP 20 mM, pH7 (sau 4 giờ thay đệm) thẩm tích mẫu trong 01 ngày

2.10 Phương pháp tách chiết protein

2.10.1 Tinh sạch protein tái tổ hợp

Protein tái tổ hợp được tinh sạch sử dụng kit tinh sạch bằng cột Probond™ (Invitrogen) Cột tinh sạch 10ml theo kit được cho 2ml resin vào, resin lắng xuống nhờ trọng lượng và hút nhẹ dịch nổi ra Cột Ni2+ được rửa 2x bằng nước khử ion và đệm gắn cột (250mM NaH2PO4, 2,5M NaCl và 10mM imidazol, pH 8) Sau đó 8ml dịch protein (dịch nổi) cần tinh sạch được đưa lên cột, đặt lên một máy lắc nhẹ để các hạt resin luôn giữ ở trạng thái lơ lửng trong dịch protein trong 30-60 phút để xylanase gắn vào hạt resin Tiếp theo, các hạt resin được để lắng

và loại bỏ dịch trong cột Cột được rửa 3x với đệm rửa (250mM NaH2PO4, 2,5M NaCl và 20mM imidazol, pH 8) Protein gắn cột được thôi ra bằng dung dịch thôi (250mM NaH2PO4, 2,5M NaCl và 250mM imidazol, pH 8) với 11 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1ml Hàm lượng protein và số đơn vị hoạt tính enzyme được xác định trong mỗi phân đoạn

2.10.2 Điện di SDS-PAGE

Điện di phân tích protein của các chủng nghiên cứu được thực hiện như đã mô tả (Laemmli, 1970) dùng gel 12,5% polyacrylamide

2.11 Các phương pháp sản xuất enzyme tái tổ hợp

Các chủng vi sinh vật nghiên cứu sau khi

đã được khảo sát thời gian nuôi cấy, tối ưu các điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme cao nhất trên môi trường thay thế rẻ tiền nhằm phục vụ cho mục đích sản xuất sẽ được tiến hành lên men quy mô 5 lít trên thiết bị lên men tự động để thu sản phẩm Quá trình lên men trên thiết bị tự động được thực hiện tại phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học và Khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội Quy trình lên men được thực hiện theo các bước hình 3

2.11.1 Lên men sản xuất glucanase

Lõi ngô và bột đậu tương phơi khô, nghiền mịn trộn với tỉ lệ 1% CMC, 1% bột đậu tương, 0,4% lõi ngô Khoáng Czapek pH 5,5 (0,2% NaNO3, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4, 0,05% KCl) Môi trường được khử trùng trước khi lên men Tiếp giống vào môi trường lên men, lên men ở 30°C và 120 giờ

2.11.2 Lên men sản xuất mannanase

Các thông số kỹ thuật lên men ban đầu với chủng nấm men P pastoris GS115: nhiệt độ

30°C; pH 5,5; tốc độ khuấy ban đầu 300 rpm và sục khí 0,50 vvm; tiếp giống 5%; điều chỉnh tốc độ khuấy và sục khí đảm bảo nồng độ oxy hòa tan (DO) ≥ 2 Trong quá trình lên men, tiếp cảm ứng 0,5% (v/v) methanol hàng ngày kể từ lúc bắt đầu tiếp giống, lấy mẫu định kỳ 12 giờ một lần để theo dõi sự phát triển và đo hoạt tính enzyme Tiến hành chạy điện di và đo

hàm lượng protein tổng số các mẫu thu được để kiểm tra

2.11.3 Lên men sản xuất subtilisin

Các thông số kỹ thuật lên men ban đầu với chủng vi khuẩn B subtilis WB800: nhiệt độ

37°C; pH 5,5; tốc độ khuấy ban đầu 200 rpm và sục khí 0,50 vvm; tiếp giống 5%; điều chỉnh tốc độ khuấy và sục khí đảm bảo nồng độ oxy hòa tan (DO) ≥ 2 Sau 24 giờ tiếp giống lên men, bình lên men sẽ được tiếp cảm ứng 0,5% (w/v) acetoin, tiến hành lấy mẫu định kỳ 12 giờ một lần để theo dõi sự phát triển và đo hoạt tính enzyme Đồng thời các mẫu cũng được tiến hành chạy điện di và đo hàm lượng protein tổng số để kiểm tra

2.11.4 Lên men sản xuất xylanase

Lõi ngô và bột đậu tương phơi khô, nghiền mịn trộn với tỉ lệ 7% lõi ngô và 5 % bột đậu tương Khoáng Czapek pH 7 (0,2% NaNO3, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4, 0,05% KCl) Môi trường được đem khử trùng trước khi lên men Tiếp giống vào môi trường lên men, lên men

ở 30°C và 120 giờ

2.11.5 Tạo chế phẩm enzyme thô

Sau khi kiểm tra theo dõi và thu hồi dịch lên men ở thời điểm tối ưu, dịch thu hồi đem ly tâm để loại bỏ cặn và xác tế bào, sau đó dịch tiếp tục được xử lý qua máy lọc luân hồi với màng lọc có kích thước thích hợp để loại nước, muối khoáng và một số protein có kích thước nhỏ hơn enzyme nghiên cứu Dịch cô đặc cuối cùng sẽ được đông khô tạo ra chế phẩm dạng

Hình 2 3 Các bước của quy trình lên men

Chủng cất ở tủ lạnh sâu -84°C

Hoạt hóa chủng

Nhân giống cấp I trên máy lắc

Lên men 5 lít trên thiết bị tự động

Theo dõi và thu hồi dịch lên men

bột Các chế phẩm này sẽ được đo kiểm tra hoạt tính và xác định độ bền ở hai điều kiện bảo quản là nhiệt độ thường và trong tủ lạnh 4°C

Vật liệu: Chế phẩm Vietzyme M dạng bột do Phòng enzyme thuộc Viện công nghệ sinh

học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam cung cấp

Động vật: Chuột nhắt trắng, dòng Swiss: 240 con, trọng lượng 20±2 g/con (120 con dùng

cho nghiên cứu độc tính cấp và 120 con dùng cho nghiên cứu độc tính bán trường diễn và sự thay đổi trọng lượng cơ thể chuột)

Pha chế phẩm Vietzyme M

Chế phẩm Vietzyme M được cân chính xác và cho vào cốc sứ (lượng chế phẩm tính theo từng nhóm) Lấy một lượng nước cất nhất định cho vào cốc sứ có chế phẩm và khuấy cho chế phẩm tan tới mức tối đa Tiếp theo lấy chày sứ nghiền kỹ cặn chế phẩm còn lắng dưới cốc sứ trong thời gian 30 phút Khi đó dung dịch ở dạng đặc, tuy nhiên trong dung dịch này vẫn còn một ít cặn không tan Lọc loại bỏ cặn to để không làm tắc kim khi cho chuột uống Dung dịch này được sử dụng để nghiên cứu độc tính

Xác định liều chết trung bình (LD50)

Liều chết trung bình (LD50) qua đường tiêu hóa trên chuột nhắt trắng được xác định theo phương pháp Karber G Phương pháp cho chuột uống chế phẩm được tiến hành như trên Theo dõi số lượng chuột chết ở mỗi nhóm và ghi vào bảng số liệu (bảng 2.4)

Bảng 2.4 Bảng số liệu

Nhóm thí nghiệm Chỉ tiêu

LD50 (bảng 2.4)

Khảo sát sự thay đổi trọng lượng chuột nhắt trắng dưới ảnh hưởng của Vietzyme M

Chuột nhắt trắng được cân chính xác (g) vào buổi sáng ở tất cả các nhóm ở ngày thứ 1,

15, 30 và 45 sau khi uống chế phẩm

Các số liệu trọng lượng chuột nhắt trắng được tính trung bình (X ±SD), độ lệch chuẩn (SD), so sánh và tính P giữa các nhóm theo t-test

2.12.2 Đánh giá hiệu quả chế phẩm đơn enzyme

Đánh giá hiệu quả chế phẩm đơn enzyme được thực hiện ở Viện KHKT NN miền Nam

Đánh giá hiệu quả chế phẩm đơn enzyme trên gà thịt thương phẩm

Thiết kế thí nghiệm

240 gà con thương phẩm 1 ngày tuổi giống Lương Phượng được phân phối ngẫu nhiên vào 48 ô chuồng (6 nghiệm thức x 8 ô /nghiệm thức x 5 gà /ô) 4 khẩu phần (KP) thí nghiệm được phân phối ngẫu nhiên vào các ô chuồng thí nghiệm:

Bảng 2.5

Công thức Thành phần Hàm lượng enzyme cho mỗi công thức

(IU/kg tă)

amylase 250 IU/g

Nhiệt độ chuồng nuôi khoảng 28-32°C và được kiểm soát bằng hệ thống phun sương trên mái, tỷ lệ trống /mái biến động 1,35-1,45 và không có khác biệt giữa các nghiệm thức Nước uống được cung cấp tự do thông qua núm uống tự động gắn trước cửa chuồng

Khẩu phần và phương pháp cho ăn

Khẩu phần cơ sở được xây dựng dựa trên khuyến cáo của Lã Văn Kính (2003) là 3050 kcal ME/kg tă; 19% protein; 1,1% lysine

Thức ăn dưới dạng bột, chế độ ăn tự do Thức ăn dư thừa được cân mỗi ngày (nếu có)

Chỉ tiêu theo dõi

Trọng lượng gà lúc 0; 30; 60 và 75 ngày tuổi; thức ăn ăn vào các giai đoạn tương ứng; tỷ

lệ chết; tỷ lệ tiêu chảy

Xử lý thống kê

Xử lý ANOVA trên phần mềm MINITAB phiên bản 13.2

Địa điểm và thời gian thí nghiệm

Trung tâm nghiên cứu & HLCN Bình Thắng, Viện KHKT Nông nghiệp miền Nam từ 15/9-25/11/2009

Đánh giá hiệu quả chế phẩm đơn enzyme trên lợn con sau cai sữa

Thiết kế thí nghiệm

60 lợn con sau cai sữa 28 ngày tuổi giống Yorkshire x Landrace, trọng lượng trung bình khoảng 7kg/con được phân phối ngẫu nhiên vào 15 ô chuồng (5 nghiệm thức x 3 ô/nghiệm thức x 4 lợn/ô) 5 khẩu phần (KP) thí nghiệm được phân phối ngẫu nhiên vào các ô chuồng thí nghiệm, cụ thể như sau:

Nhiệt độ chuồng nuôi khoảng 28-32°C, máng ăn bán tự động, nước uống được cung cấp

tự do thông qua núm uống tự động gắn trước cửa chuồng

Khẩu phần ăn và phương pháp cho ăn

Khẩu phần cơ sở được xây dựng dựa trên khuyến cáo của Lã Văn Kính (2003) là 3300kcal ME/kg thức ăn; 22% protein; 1,5% lysine Thức ăn dưới dạng bột, chế độ ăn tự do Thức ăn dư thừa được cân mỗi ngày (nếu có)

Chỉ tiêu theo dõi

Trọng lượng lợn lúc 28 và 56 ngày tuổi; thức ăn ăn vào giai đoạn 28-56 ngày; tỷ lệ chết;

tỷ lệ tiêu chảy

Xử lý thống kê

Xử lý ANOVA trên phần mềm MINITAB phiên bản 13.2

2.12.3 Đánh giá hiệu quả chế phẩm Vietzyme M

Đánh giá hiệu quả chế phẩm Vietzyme M được thực hiện ở Viện Chăn nuôi

Đánh giá hiệu quả Vietzyme M trên gà thịt thương phẩm

Gà Lương Phượng có nguồn gốc từ Nam Ninh, Trung Quốc là giống gà thả vườn đã được

nuôi thích nghi và công nhận là gống gốc năm 2004

Xylanase được sinh tổng hợp từ A oryzae VTCC-F187, A niger VTCC-F017 tái tổ hợp;

manannase được biểu hiện từ P pastoris GS115/pPMan; protease được biểu hiện từ B

subtilis WB 800; glucanase được biểu hiện từ P pastoris GS115/pPeglA

Các thí nghiệm khảo sát khả năng sinh trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn cho thịt của vật

nuôi được bố trí theo phương pháp phân lô so sánh có lặp lại giữa các khẩu phần ăn khác

nhau Vật nuôi giữa các lô thí nghiệm có sự đồng đều về giống, độ tuổi, giới tính chế độ

chăm sóc, nuôi dưỡng quy trình phòng bệnh giống nhau

Thí nghiệm trên gà Lương Phượng 4 tuần tuổi, bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với

9 lô và 3 lần lặp lại (5 gà trống, 5 gà mái trên lần lặp lại) tổng số 150 con (5x 3x 10)

Bảng 2.7 Mô hình thử nghiêm chế phẩm đa enzyme trên gà thương phẩm

Bảng 2.8 Cách bố trí thí nghiệm chế phẩm Vietzyme M trên gà thương phẩm

sung (%≈ IU/kg thức ăn)

Ghi chú: KPCS: khẩu phần cơ sở Chế phẩm Vietzyme M (xylanase: 3260 IU/g chế phẩm;

manannase: 520 IU/g chế phẩm; glucanase: 510 IU/g chế phẩm; protease: 480 IU/g chế phẩm)

Vietzyme M được bổ sung vào khẩu phần cơ sở với 3 mức khác nhau: 0,1; 0,5 và 1%

Bảng 2.9 Khẩu phần cơ sở để thí nghiệm gà Lương Phượng sau 4 tuần tuổi

STT Nguyên liệu Tỷ lệ khối lượng (%) Mức dinh dưỡng/kg thức ăn

9 Muối ăn 0,2 Methionine + Cyst (%) 0,75

Ghi chú: Thành phần Vitamin số 8 bao gồm: vitamin A+D: 470 kU; vitamin E+K: 1,08g; vitamin

B1+B2+B6: 420mg; vitamin B12+H2+Folic acid 48,9mg; Niacin: 1,2g; D.Calpan: 400mg; Fe+ Cu:

1,86g; Zn+Mn: 7,5g; I+Co+Se: 84mg

Đánh giá hiệu quả chế phẩm Vietzyme M trên lợn

Lợn ngoại (Landrace x Yorkshine → cái F1 x đực Duroc → F2 thí nghiệm) do Trung tâm

Nghiên cứu lợn Thụy Phương, Viện Chăn nuôi là đơn vị giữ giống gốc cung cấp

Thí nghiệm được tiến hành trên lợn con ở các giai đoạn khác nhau: 8-15kg; 15-20kg

20-50kg, bố trí hoàn hoàn ngẫu nhiên, với 4 lô và 3 lần lặp lại (4x 3x 3) tổng số 36 con

Bảng 2.10 Mô hình nghiên cứu trên lợn

Bố trí thí nghiệm Phương án bổ sung Hàm lượng enzyme bổ sung

Chế phẩm Vietzyme M được bổ sung vào KPCS để thử nghiệm trên lợn con sau cai sữa

theo tiêu chuẩn của trung tâm nghiên cứu lợn Thụy Phương- Viện Chăn nuôi

Bảng 2.11 Khẩu phần cơ sở để thí nghiệm lợn con giai đoạn tăng trưởng từ 8-20kg

STT Nguyên liệu Tỷ lệ khối lượng (%) Mức dinh dưỡng/kg thức ăn

Ghi chú: Thành phần Premix vitamin (kg): Vitamin A: 6000kU; vitamin D 3 : 600kU; vitamin E: 7.500

IU; vitamin K 3 : 240mg; vitamin B1: 660mg; vitamin B2: 1200mg; vitamin B 6 : 850mg; vitamin B12:

18mg; NIACIN: 4875 mg; D-Calpan: 3000mg; Folic acid: 200mg; Biotin 25mg; Cu 20g; Fe 50g; Mn

15g; Zn 100g; Co: 250mg; Se: 150mg; I: 300mg

Bảng 2.12 Khẩu phần cơ sở để thí nghiệm lợn con giai đoạn tăng trưởng từ 20-50kg

STT Nguyên liệu Tỷ lệ khối lượng

6 Primix vitamin 0,10 Lysine (%) 1,03

9 Bột xương 2,44

10 Muối ăn 0,40

Ghi chú: Thành phần Primix vitamin (kg): Vitamin A: 6000kU; vitamin D 3 : 600kU; vitamin E: 7.500 IU; vitamin K 3 : 240mg; vitamin B1: 660mg; vitamin B2: 1200 mg; vitamin B 6 : 850mg; vitamin B12: 18mg; NIACIN: 4875 mg; D-Calpan: 3000mg; Folic acid: 200mg; Biotin 25mg; Cu 20g; Fe 50g; Mn 15g; Zn 100g; Co: 250mg; Se: 150mg; I: 300mg

Chế phẩm Vietzyme M được bổ sung vào KPCS ở 2 mức độ khác nhau: 0,1%; 0,5% để thử nghiệm trên lợn con sau cai sữa

Xác định khả năng sinh trưởng của vật nuôi thí nghiệm

Sinh trưởng tích lũy

Đối với gà: khối lượng cơ thể gà thí nghiệm được theo dõi từ 28 ngày tuổi đến 84 ngày tuổi Hàng tuần toàn bộ số gà thí nghiệm được cân vào ngày tuổi cuối cùng của tuần, cân từng con, thời gian cân từ 8-9 giờ sáng trước khi cho ăn Người và dụng cụ cân được cố định Cân sử dụng để xác định khối lượng gà là cân Nhơn Hòa (loại cân đồng hồ) sản xuất tại Việt Nam với các kích cỡ khác nhau, cân nhỏ giới hạn tối đa là 0,5 kg (độ chính xác là 0,1 g) và cân lớn giới hạn tối đa là 5 kg (độ chính xác từ 1 đến 5 g)

Đối với lợn: Cân khối lượng cơ thể thí nghiệm từ ngày bắt đầu thí nghiệm và ngày kết thúc thí nghiệm, cân bằng cân điện tử

Sinh trưởng tuyệt đối

Sinh trưởng tuyệt đối được tính theo công thức TCVN 2.39.1977 giá trị bằng gam/con/ngày như sau:

t

P P

A= 2− 1 (A độ sinh trưởng tuyệt đối; P

2 khối lượng cơ thể cân lần sau (gam); P1 khối lượng cơ thể cân lần trước (gam); t thời gian giữa hai lần cân (ngày)

Tiêu tốn và chi phí thức ăn

Hàng ngày cân chính xác lượng thức ăn cho vật nuôi ăn vào lúc 8 giờ sáng và đến đứng giờ đó, ngày hôm sau khi vét lượng thức ăn còn dư thừa trong máng để cân thức ăn thừa Lượng thức ăn tiêu thụ trong ngày (kg) = Tổng lượng thức ăn cho vào trong ngày (kg) – tổng lượng thức ăn thừa trong ngày (kg)

Lượng thức ăn tiêu thụ trung bình cơ thể vật nuôi trên ngày bằng tổng lượng thức ăn tiêu thụ trên một ngày chia cho tổng số cá thể vật nuôi thí nghiệm

Tiêu tốn thức ăn cho 1kg thịt hơi của vật nuôi thí ngiệm (TTTA/kg tăng khối lượng) TTTA (kg)/kg tăng khối lượng được tính bằng tổng lượng thức ăn tiêu tốn trong thời kì (kg) chia cho tổng khối lượng cơ thể vật nuôi thí nghiệm

Tỷ lệ nuôi sống

Tỷ lệ nuôi sống (%) = [Số gà cuối kỳ (con)] : [Số gà đầu kỳ (con)] x 100

Đánh giá năng suất thịt ở gà nuôi

Để đánh giá năng suất cho thịt, tiến hành mổ khảo sát gà thí nghiệm Trong đề tài này chỉ

mổ khảo sát thí nghiệm gà ở phương thức nuôi nhốt ở các lô thí nghiệm khác nhau Mỗi lô

mổ 12 con gồm 6 gà trống và 6 gà mái có khối lượng tương đương khối lượng trung bình của toàn đàn Thời gian mổ khảo sát gà độ tuổi 84 ngày tuổi

Phương pháp mổ gà khảo sát theo phương pháp của Bùi Quang Tiến (1993) và Omojolal

et al (2007) đánh giá bằng 5 chỉ tiêu

[Khối lượng gà sống]: = [Khối lượng gà nhịn đói sau 12 giờ (chỉ cho gà uống nước)]

Khối lượng thân thịt (thịt xẻ): là khối lượng gà sau khi cắt tiết, vặt lông, bỏ ruột, phổi,

khí quản, lá lách, mật, màng sừng của mề, đầu và xương bàn chân

[Tỷ lệ thân thịt (%)] = [Khối lượng thịt xẻ (gam)] : [Khối lượng sống (gam)] x 100

Khối lượng thịt đùi và tỷ lệ thịt đùi: Rạch một đường cắt từ khớp xương đù trái, xong

xong với xương sống dẫn đến chỗ cơ đùi và cơ ngực Tách cắt bỏ cơ đùi Cân khối lượng cơ đùi trái và nhân đôi sau đó tính tỷ lệ cơ đùi theo công thức

[Tỷ lệ thịt đùi (%)] = [Khối lượng đùi trái x 2 (gam)] : [Khối lượng thịt xẻ (gam)] x 100

Khối lượng cơ ngực và tỷ lệ thịt ngực: Khối lượng cơ ngực bằng khối lượng cơ nhực trái

(bỏ da, bỏ xương) nhân đôi

[Tỷ lệ thịt ngực (%)] = [Khối lượng cơ ngực x 2 (gam)] : [Khối lượng thịt xẻ (gam)] x

100

Khối lượng mỡ bụng và tỷ lệ mỡ bụng: Lấy toàn bộ mỡ trong xoang mỡ bụng, cân lên ta

được khối lượng mỡ bụng

[Tỷ lệ mỡ bụng (%)] = [Khối lượng mỡ bụng (gam)] : [Khối lượng thịt xẻ (gam)] x 100

Tỷ lệ các cơ quan nội tạng: Tim lá lách, gan, tụy Tách ruột thừa, dạ dày tuyến và mề

loại bỏ phân sau đó cân bằng cân phân tích (gram) Sau đó tính tỷ lệ các cơ quan nội tạng trên

so với khối lượng thịt xẻ

[Tỷ lệ gan (%)] = [Khối lượng gan (gam)] : [Khối lượng thịt xẻ (gam)] x 100

Các cơ quan nội tạng khác xác định tương tự như tính tỷ lệ gan

Xác định hàm lượng nước trong thịt

Chất lượng thịt mới chỉ được đánh giá bằng hàm lượng nước trong thịt Hàm lượng nước được đánh giá theo phương pháp của Tsai và cs (1981) : Lấy chính xác 5g thịt ngực và thịt đùi, để vào 9cm2 giấy thấm (whatman N°1), dàn đều trên mặt phẳng 10,2 x 10,2 cm Sau đó

ép với lực sấp xỉ 32kg/cm3 trong 1 phút (lực ép được xác định bằng cân đồng hồ Nhơn Hòa, khi ép trên mặt phẳng của cân Tính lượng nước liên kết trong khối thịt được giải phóng trong

01 phút ép, so với mẫu ban đầu ta tính được tỷ lệ % nước chứa trong bắp thịt

[Tỷ lệ nước trong thịt (%)] = [Lượng nước giải phóng ra 1 phút ép (gam)] : [Khối lượng thịt ban đầu (gam)] x 100

Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được thu thập hàng ngày và hàng tuần một cách khách quan và đảm bảo chính xác Các số liệu thu thập được xử lý thống kê theo hàm ANOVA trên máy tính với phân mềm Excel Các giá trị thu được đem so sánh chuẩn Fisher’s để nhận biết mức ý nghĩa 95%

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nội dung 1 Đánh giá các chủng tự nhiên sinh tổng hợp các enzyme

3.1.1 Glucanase tự nhiên

Chủng Bacillus subtilis CC

Sinh trưởng

Lượng sinh khối bắt đầu tăng nhanh sau

khi nuôi 8 h và đạt tới mức cân bằng sau khi

nuôi 28 h (bảng 3.1) Sau 30-32 giờ nuôi

cấy, mật độ vi khuẩn ở trong cả hai loại môi

trường đều đạt cực đại, và ổn định đến 54

giờ, sau đó OD600 của vi khuẩn bắt đầu

giảm Trong môi trường MT2, vi khuẩn tạo

sinh khối cao hơn so với trong môi trường

MT1 qua giá trị OD600 Sau 30 giờ nuôi cấy,

vi khuẩn trong môi trường MT2 cho giá trị

OD600 lớn nhất là 0,95 gấp gần 1,3 lần so

với khi nuôi ở môi trường MT1 (OD600 lớn

nhất 0,735)

Sau 76 h nuôi cấy, vi khuẩn bắt đầu suy

thoái, sinh khối giảm đi rõ rệt Môi trường MT2 thích hợp hơn cho sinh trưởng của B subtilis

CC, ngoài việc cho sinh khối lớn hơn, môi trường này còn kéo dài trạng thái cân bằng hơn so với khi sử dụng môi trường MT1

Sinh tổng hợp CMCase

Hoạt tính thủy phân CMC của B subtilis

CC sinh trưởng trong MT1 thấp hơn so với

hoạt tính này khi chúng phát triển trong

MT2, đạt 13 mm và 25 mm, tương ứng

(Bảng 3.2) Sau 24 giờ nuôi cấy, mặc dù

sinh khối khá cao nhưng hoạt tính CMCase

tăng không đáng kể Sau 48 giờ, hoạt tính

CMCase giảm rất mạnh, đường kính vòng

phân giải tương ứng là 7 mm (MT1) và 18

mm (MT2) Hoạt tính enzyme cao nhất khi

vi khuẩn bước vào trạng thái cân bằng Ở giai đoạn phát triển tăng sinh và giảm sinh, hoạt tính enzyme chưa đạt được giá trị cực đại hoặc bị giảm đáng kể

Bảng 3.1 Sinh trưởng của B subtilis CC trong

hai môi trường khác nhau

Bảng 3.2 Sinh tổng hợp CMCase của B subtilis

CC theo thời gian

Hoạt tính enzyme

OD600

Thời gian

Ảnh hưởng của nguồn carbon

Polysaccharide là nguồn carbon tốt hơn

so với monosaccharide và disaccharide cho

chủng B subtilis CC sinh β-glucanase (bảng

3.3) Dextrin và tinh bột tan là nguồn carbon

tốt nhất trong môi trường để sinh tổng hợp

CMCase, đạt 147 và 123 IU/ml, tương ứng;

tiếp theo là glucose và sucrose, với hoạt tính

112 và 88 IU/ml, tương ứng Sinh khối đạt

cao nhất khi sử dụng dextrin làm nguồn

carbon (OD600 = 0,95) Trong khi sinh khối

đạt mức khá cao với nguồn carbon glucose

và sucrose (OD600= 0,78 và 0,80, tương ứng), nhưng hoạt tính β-glucanase vẫn ở mức thấp Mặc dù sinh khối của B subtilis CC với nguồn carbon là glucose tương đương với sinh khối

tạo thành khi sử dụng sucrose, nhưng hoạt tính CMCase cao hơn hẳn (112 IU/ml so với 88 IU/ml) Lactose và glycerol không thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp β-glucanase của B subtilis CC

Tang et al (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau lên sinh tổng

hợp β-glucanase của B subtilis ZJF1A5 Dextrin là nguồn carbon tốt nhất cho sinh trưởng và hoạt tính β-glucanase từ vi khuẩn này, tiếp theo là các loại tinh bột ngũ cốc và cám lúa mì (Tang et al., 2004) B subtilis ZJF1A5 sinh β-glucanase một phần kết hợp với sinh trưởng của tế bào Khi tế bào vào pha cân bằng, sinh tổng hợp β-glucanase tạo đỉnh sau khi tế bào tự tiêu, trong khi pH tăng Điều này xảy ra vì gene mã hóa cho β-1,3-1,4-glucanase được biểu hiện khi tế bào đi vào giai đoạn ổn định trong khi lượng GTP trong tế bào giảm Khi tăng hàm lượng carbon (dextrin) lên 4%, sinh khối và hoạt tính β-glucanase đều tăng Vì β-glucanase của Bacillus là một enzyme cảm ứng, nên để tăng hoạt tính enzyme cần phải tăng

sinh khối vi khuẩn và bổ sung chất cảm ứng

Ảnh hưởng của nguồn nitrogen

Cao nấm men là nguồn nitrogen tốt nhất,

với OD600 sau 24 giờ nuôi cấy là 0,95 và

hoạt tính β-glucanase 146 IU/ml (bảng 3.4)

Các nguồn nitrogen vô cơ NaNO3,

(NH4)2SO4 và urea không thích hợp cho sinh

trưởng và sinh tổng hợp β-glucanase của B

subtilis CC Khi sử dụng (NH4)2SO4 và urea

như nguồn nitrogen, B subtilis CC phát

triển rất kém (OD600 chỉ đạt 0,34 và 0,37,

tương ứng), nhưng sinh tổng hợp CMCase

từ vi khuẩn này cũng khá tốt, đạt 100 IU/ml

và 106 IU/ml, tương ứng Kết quả này trùng với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác cho rằng, dịch chiết nấm men là nguồn nitrogen tốt nhất cho sinh trưởng và sinh tổng hợp β-glucanase của B subtilis và các nguồn nitrogen vô cơ không thích hợp cho sinh trưởng và

sinh tổng hợp enzyme của chủng vi khuẩn này Bột đậu tương cũng là nguồn nitrogen tốt cho chủng vi khuẩn này Khi B subtilis được nuôi với nguồn carbon là bột lúa mạch và bột đậu

tương, hoạt tính β-glucanase đạt 75% so với khi sử dụng dịch chiết nấm men (Tang et al.,

2004)

Bảng 3.3 Hoạt tính CMCase từ B subtilis CC

với các nguồn carbon khác nhau

Hoạt tính enzyme Nguồn

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên

sinh trưởng và sinh tổng hợp CMCase của B

subtilis Đường kính vòng phân giải CMC: D-d

Hoạt tính enzyme Nguồn

D-d (mm) (IU/ml) Cao nấm